付佳，諶倫建，徐冰,2，華紹烽，李從強(qiáng)，楊明坤，邢寶林,2，儀桂云,2

（1 河南理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南省煤炭綠色轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 焦作 454003；2 煤炭安全生產(chǎn)與清潔高效利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 焦作 454003）

煤炭氣化是煤炭清潔利用的一種重要方式[1?2]，但氣化產(chǎn)生的廢水可能對(duì)環(huán)境造成污染[3]。苯酚是固定床氣化廢水中的主要有機(jī)污染物之一[4]，其自然降解性差[5]，含苯酚及其衍生物的廢水大量排放將導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境日趨惡化，嚴(yán)重危害水生生物、人類以及動(dòng)植物安全[6?7]，故含酚廢水的處理受到廣泛關(guān)注和研究。

含酚廢水的主要處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法等三大類[8?9]，具體的技術(shù)手段包括吸附法、膜分離技術(shù)、溶劑萃取法、高級(jí)氧化法、電化學(xué)處理法、光催化法以及生物降解技術(shù)等[10?16]。物理法和化學(xué)法處理工藝較復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，易造成二次污染[17]。生物降解技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)性好、效率高、環(huán)境友好等特點(diǎn)，是目前較為成熟的水處理手段之一[18]。有研究表明假單胞菌屬（Pseudonomonassp.）[19]、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）[20]、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）[21]、紅球菌屬（Rhodococcussp.）[22]、放線菌的諾卡氏菌（Nocardiasp.）[23]和真菌的酵母菌屬（Yeastsp.）[24]等具備降解苯酚的能力。微生物對(duì)苯酚的降解受酸堿度、溫度、苯酚濃度和重金屬種類及其含量等因素的影響[25]。當(dāng)前大多研究涉及的廢水成分簡(jiǎn)單，組成相對(duì)穩(wěn)定，但實(shí)際煤化工廢水，尤其是煤氣化廢水，不僅含有苯酚、萘等多種難降解有機(jī)污染物，還含有重金屬[26]、氨氮等無(wú)機(jī)污染物[27]，因此煤氣化廢水的微生物處理更為復(fù)雜，培養(yǎng)馴化適于煤化工廢水的高效降解菌株對(duì)污染水的治理尤為重要。

Panigrahy等[28]從焦化廢水中分離出NS1細(xì)菌，經(jīng)90h處理，該菌株幾乎可完全降解1500mg/L的苯酚。葉子蘭等[29]從某化工廠廢水中分離出Y_1細(xì)菌，經(jīng)36h處理，苯酚濃度從1100mg/L降至110mg/L，其降解率可達(dá)90%。Abarian等[30]研究了扎蘭德煤焦油礦的苯酚降解菌的生長(zhǎng)情況，并馴化篩選出的菌株P(guān)42和P53能夠降解1800mg/L的苯酚。上述研究均表明相關(guān)環(huán)境樣本可以作為煤化工廢水生物修復(fù)目的菌株的來(lái)源。

基于此，本文以煤氣化廢水和焦化廢水為菌源，以苯酚為單一碳源，經(jīng)多次馴化，篩選了2種降解苯酚的好氧菌，考察溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速、重金屬離子等對(duì)菌株降解苯酚的影響，探討苯酚的微生物降解機(jī)理，并研究模擬煤炭氣化廢水的微生物修復(fù)效果，研究成果可為煤氣化廢水微生物修復(fù)用工程菌的馴化篩選、生長(zhǎng)特性及廢水的凈化修復(fù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌源取自某焦化廠廢水和氣化廠廢水。苯酚，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠。實(shí)驗(yàn)用水為無(wú)菌水，實(shí)驗(yàn)用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、微量元素溶液及牛肉膏蛋白胨的組成如下。

無(wú)機(jī)鹽（MSM）培養(yǎng)基的組成：K2HPO40.5g/L、KH2PO40.5g/L、NaCl 0.2g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl20.1g/L、MnSO40.01g/L、NH4NO31g/L。

微量元素溶液的組成：FeSO4·7H2O 1g/L、MgSO41g/L，并用NaOH及HCl調(diào)至pH為7.0±0.1。

牛肉膏蛋白胨（LB）培養(yǎng)基的組成：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15～20g/L。

模擬煤炭氣化實(shí)驗(yàn)用煤為新疆煙煤，模擬氣化實(shí)驗(yàn)的步驟：稱取400g粒徑為5～10mm的新疆煙煤煤樣于固定床氣化爐的氣化室內(nèi)，在常壓條件下，900℃氣化4h，水蒸氣的流量為10mL/min，生成的煤氣經(jīng)去離子水洗滌后放空。氣化結(jié)束后，收集洗滌水，并在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 苯酚降解菌的馴化、分離和純化

首先，分別取焦化廢水（JHFS）和氣化廢水（QHFS）樣品各10mL，加入到苯酚含量為500mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在pH為7.0、搖床轉(zhuǎn)速160r/min、30℃條件下培養(yǎng)，然后以10%的轉(zhuǎn)接量分別接種到苯酚含量為800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1500mg/L、2000mg/L 的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，取最后一輪富集液配制成10?1、10?2、10?3……10?8梯度的稀釋液，再取10?6、10?7、10?8稀釋液各200μL涂布在含苯酚無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，挑選清晰可見(jiàn)的單菌落，利用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線分離純化，并對(duì)這些菌株進(jìn)行編號(hào)，圖1是菌株馴化分離的流程。將純化好的菌株經(jīng)LB 液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，按10%接種量接種到含500mg/L苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行苯酚降解實(shí)驗(yàn)，48h后取樣測(cè)定苯酚含量的變化，選取降解效果最佳的菌株進(jìn)行鑒定。

圖1 苯酚降解菌的馴化分離流程

1.3 苯酚降解菌的鑒定

根據(jù)16S rDNA 基因序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征等對(duì)篩選到的苯酚降解菌進(jìn)行鑒定。首先在LB 固體培養(yǎng)基上對(duì)菌株進(jìn)行平板劃線，于30℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)特征。挑取少量菌體進(jìn)行染色，并利用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)，參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特征分析。同時(shí)，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序鑒定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，采用N?J法（MEGA7.0）進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（GE，UV?7000，USA）測(cè)定在270nm處0～150mg/L苯酚的吸光度值，根據(jù)濃度和吸光度值繪制苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程為y=0.0151x+0.0086，R2=0.9998。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算待測(cè)溶液中的苯酚含量。

1.5 苯酚的降解

1.5.1 種子液的制備

從LB 固體平板上挑取降解菌JHFS?1 的單菌落，并將其接種到LB 液體培養(yǎng)基中，在pH=7.0、160r/min、35℃條件下孵化過(guò)夜，然后離心收集菌體，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌，PBS洗滌后的菌體制成OD600=1.0±0.1種子液，用于后續(xù)降解苯酚。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)條件對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響

本部分實(shí)驗(yàn)選用OD600=1.0±0.1 的JHFS?1 為初始菌液，初始培養(yǎng)條件為：接種量=10%、苯酚初始濃度500mg/L、pH=7.0、溫度35℃、轉(zhuǎn)速160r/min，采用單因素變量法研究不同苯酚初始濃度、溫度、pH、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、NaCl濃度和重金屬離子對(duì)JHFS?1降解苯酚能力的影響。

1.6 降解中間產(chǎn)物的檢測(cè)

為研究苯酚的微生物降解途徑，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要對(duì)降解中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。采用一定量的二氯甲烷萃取代謝物，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC?MS，Agilent，890A?5975C，USA）進(jìn)行分析。色譜柱為DB?WAX（30.0m×250μm，0.25μm），掃描質(zhì)量范圍為35～500u（1u≈1.66×10-27kg)。采用Thermo Scientific Nicolet iS20紅外光譜儀，在4000～400cm?1的掃描范圍內(nèi)對(duì)冷凍干燥的中間產(chǎn)物樣品進(jìn)行傅里葉變換紅外吸收光譜（FTIR）分析。

1.7 苯酚降解菌對(duì)煤氣洗滌水的降解

實(shí)驗(yàn)用模擬氣化廢水取自實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的新疆煙煤的模擬固定床氣化，微生物降解煤氣洗滌水的實(shí)驗(yàn)裝置同文獻(xiàn)[31]。將一定量的苯酚降解菌接種于煤氣洗滌水中，空氣通氣流量為20mL/(min·L)，反應(yīng)溫度為37℃。每隔一定時(shí)間取一定量的水樣，采用elementar vario TOC select 總有機(jī)碳（TOC）分析儀測(cè)定煤氣洗滌水中的TOC值。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯酚降解菌株的馴化、篩選及鑒定

焦化廢水（JHFS）和氣化廢水（QHFS）菌源經(jīng)苯酚濃度為500～2000mg/L 的MSM 培養(yǎng)基馴化，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著苯酚初始濃度增加，溶液中苯酚的降解時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)苯酚初始濃度為500mg/L時(shí)，經(jīng)過(guò)24h基本上完全降解；初始濃度增加到1000mg/L時(shí)，降解時(shí)間至少需要72h；初始濃度為1200mg/L時(shí)，降解時(shí)間至少162h，說(shuō)明初始濃度增大，在菌株及其他條件不變的情況下苯酚降解越困難。從焦化廢水和氣化廢水中菌株馴化效果來(lái)看，焦化廢水中菌株降解苯酚的速度明顯快于氣化廢水，尤其是在高苯酚濃度條件下，焦化廢水中的菌株降解效果顯著優(yōu)于氣化廢水中的菌株。

圖2 JHFS和QHFS在不同苯酚濃度條件下的馴化階段

為篩選苯酚高效降解菌種，將2 種廢液用500mg/L苯酚MSM培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步馴化。經(jīng)過(guò)3次48h馴化后，焦化廢水和氣化廢水中菌株對(duì)苯酚的降解率均可達(dá)到95%左右，如圖3所示。

圖3 3次馴化過(guò)程中焦化廢水菌源和氣化廢水菌源對(duì)苯酚的降解效果

經(jīng)過(guò)分離篩選，從焦化廢水得到兩株單菌落JHFS?1、JHFS?2，從氣化廢水得到1株單菌落QHFS?1。分別將3株菌株和混合菌按1∶1∶1投加到苯酚濃度為500mg/L、800mg/L、1000mg/L 的MSM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其對(duì)苯酚的降解效果，并根據(jù)生長(zhǎng)量繪制其生長(zhǎng)曲線，如圖4和圖5所示。

由圖4可知，菌株JHFS?1、QHFS?1在實(shí)驗(yàn)條件下具有優(yōu)良的降解效果，對(duì)1000mg/L苯酚的降解效果可以達(dá)到95%左右?；旌暇鷮?duì)800mg/L苯酚的降解率可達(dá)80%以上，但對(duì)超過(guò)800mg/L的苯酚降解率僅10%左右。JHFS?2對(duì)苯酚基本沒(méi)有降解效果。

圖4 3種菌株及混合菌株對(duì)苯酚的降解效果

從圖5可知，菌株JHFS?1、QHFS?1生長(zhǎng)曲線相似，經(jīng)過(guò)短暫的延滯期（0～5h）后進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（5～29h），然后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。JHFS?2生長(zhǎng)曲線總體上與JHFS?1相似，但生長(zhǎng)緩慢，OD600較小。

圖5 菌株JHFS?1、JHFS?2以及QHFS?1的生長(zhǎng)曲線（LB培養(yǎng)基）

將降解苯酚效果最好、菌株生長(zhǎng)量最大的JHFS?1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用菌株。經(jīng)過(guò)LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，菌株JHFS?1在LB平板上形成較小型菌落，菌落呈乳白色、圓形，表面有些許凸起（圖6）。

圖6 菌株JHFS?1在LB平板上形成的菌落

表1是菌株JHFS?1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果。菌株JHFS?1的革蘭氏染色反應(yīng)、淀粉水解酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，Voges?Proskauer（V?P）試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。

表1 菌株JHFS-1生理生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)菌株JHFS?1的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序，利用BLAST 進(jìn)行序列相似性對(duì)比，鑒定所篩選的菌株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobacter calcoaceticus，該菌株基于16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖7所示。

圖7 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的菌株JHFS?1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 影響JHFS-1降解苯酚的主要因素

2.2.1 苯酚初始濃度

圖8是苯酚初始濃度與降解率之間的關(guān)系。由圖8 可知，當(dāng)苯酚濃度在100～800mg/L 范圍內(nèi)，經(jīng)36h 后苯酚降解率均在90%以上；當(dāng)苯酚濃度為1000mg/L 時(shí)，經(jīng)過(guò)48h 后苯酚的降解率也可達(dá)到90.90%。從菌株生長(zhǎng)情況看（圖9），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的生長(zhǎng)量增大，但苯酚濃度較低，最終的OD600 值也較低，可能是因?yàn)楸椒恿坎荒軡M足菌株生長(zhǎng)需要所致；當(dāng)苯酚濃度過(guò)高（如超過(guò)1200mg/L），菌株僅在初始階段有微量生長(zhǎng)，且OD600 很低，可能是苯酚對(duì)菌株JHFS?1 發(fā)生毒害抑制作用影響其生長(zhǎng)；最佳的苯酚初始濃度為500～800mg/L。

圖8 苯酚初始濃度對(duì)JHFS?1降解效果的影響

圖9 苯酚初始濃度對(duì)JHFS?1生長(zhǎng)的影響

2.2.2 溫度

圖10是環(huán)境溫度與苯酚（初始濃度為500mg/L）降解率的關(guān)系。由圖10可知，在溫度低于45℃條件下，不同溫度對(duì)應(yīng)的苯酚降解率變化趨勢(shì)一致，且在100h內(nèi)其降解率均可達(dá)90%左右。但溫度為30℃時(shí)降解速度最快，經(jīng)過(guò)36h其降解率為90.93%，其次是38℃和35℃，說(shuō)明該菌株降解苯酚的適宜溫度為25～40℃，最佳溫度30℃。

圖10 溫度對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響

2.2.3 pH

實(shí)驗(yàn)考察了pH為4～9范圍內(nèi)JHFS?1對(duì)苯酚的降解效果，如圖11所示。pH對(duì)該菌株降解苯酚的影響不大，在偏酸性（pH為4～6）條件下降解率為80%左右，pH 9.0時(shí)降解率最低也可達(dá)70.35%。

圖11 pH對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響

2.2.4 接種量

圖12 是接種量與苯酚降解率的關(guān)系。由圖12可知，在實(shí)驗(yàn)條件下除接種量1%以外，接種量對(duì)苯酚最終降解率影響不大，接種量為4%～16%范圍內(nèi)其降解率均在90%左右，但對(duì)降解效率有較明顯影響。接種量為4%時(shí)，經(jīng)過(guò)84h才能達(dá)到最大降解率（85.97%）；接種量為13%時(shí)，只需54h時(shí)就達(dá)到最大降解率（89.55%）；接種量為16%時(shí)，達(dá)到最大降解率所需的時(shí)間比接種量為13%時(shí)稍有延遲。1%的接種量基本上沒(méi)有降解效果，可能是菌株量太少，且受到苯酚毒性抑制作用而不能生長(zhǎng)。

圖12 接種量對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速

由于培養(yǎng)篩選的菌株屬于好氧菌，采用搖床為其提供所需氧分，搖床轉(zhuǎn)速與苯酚降解率之間的關(guān)系如圖13所示。由圖13可知，搖床轉(zhuǎn)速為40r/min時(shí)，JHFS?1 對(duì)苯酚沒(méi)有降解效果，其余條件下苯酚的最大降解率基本上都在90%左右，說(shuō)明搖床轉(zhuǎn)速對(duì)苯酚的降解率影響不大，但對(duì)降解效率有一定的影響。當(dāng)轉(zhuǎn)速?gòu)?0r/min 增加到120r/min 時(shí)，降解效率有顯著提高，120r/min 與200r/min 的苯酚降解率和降解效率相差不大，可以認(rèn)為最佳轉(zhuǎn)速為120r/min。JHFS?1 菌為好氧菌，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為40r/min時(shí)，供氧量滿足不了JHFS?1菌對(duì)氧的需求，因此不能有效降解苯酚；隨著搖床轉(zhuǎn)速增加，溶解氧增多為菌株提供了良好的生長(zhǎng)代謝環(huán)境，因而降解效果增強(qiáng)。

圖13 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響

2.2.6 NaCl濃度煤氣化或焦化廢水中均含有大量的鹽，鹽濃度較高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化，微生物物質(zhì)吸收過(guò)程受干擾阻斷，甚至使微生物中毒，進(jìn)而引起菌體死亡。選取NaCl作為鹽類代表性物質(zhì)，考察NaCl濃度對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響，結(jié)果如圖14所示。由圖14可知，添加1%的NaCl時(shí)，苯酚的降解率最高，達(dá)64.69%，比不添加NaCl時(shí)降低了25.12個(gè)百分點(diǎn)；當(dāng)NaCl 添加量增加到2%及以上，其降解率不足30%，說(shuō)明NaCl對(duì)JHFS?1生長(zhǎng)和降解苯酚有顯著的抑制作用。

圖14 NaCl濃度對(duì) JHFS?1降解苯酚的影響

2.2.7 Cu2+和Mn2+濃度

微生物是利用其產(chǎn)生的酶催化污染物進(jìn)行降解，某些金屬離子是酶的激活劑，但也有部分金屬離子會(huì)破壞酶的蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使酶失去活性。煤氣化或焦化廢水中含有大量金屬離子，選取煤氣化廢水中具有代表性的Cu2+、Mn2+為對(duì)象，探討重金屬離子對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響。

圖15是Cu2+、Mn2+對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響。由圖15(a)可知，Cu2+對(duì)JHFS?1 降解苯酚的影響主要是降低苯酚的降解效率：不含Cu2+時(shí)，達(dá)到最大降解率需24h，當(dāng)含有Cu2+時(shí)，達(dá)到最大降解率需48h；同時(shí)，Cu2+濃度較低時(shí)，對(duì)苯酚的降解率影響不大，但當(dāng)Cu2+濃度增加到100mg/L 時(shí)，苯酚降解率降低顯著，經(jīng)48h降解后其降解率僅為76.91%，說(shuō)明Cu2+對(duì)JHFS?1 降解苯酚有一定的抑制作用。Mn2+對(duì)JHFS?1 降解苯酚具有一定的促進(jìn)作用：Mn2+為50mg/L 時(shí)，菌株JHFS?1 對(duì)苯酚的降解率可達(dá)到94.22%；當(dāng)Mn2+濃度為10mg/L、25mg/L、100mg/L時(shí)，經(jīng)48h 降解，苯酚的降解率分別為92.11%、93.13%、93.26%，均比沒(méi)有Mn2+存在時(shí)的降解率（92.03%）稍高。

圖15 重金屬離子對(duì)JHFS?1降解苯酚的影響

2.3 JHFS-1降解苯酚機(jī)理

采用GC?MS、FTIR對(duì)JHFS?1降解苯酚的中間產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)中間產(chǎn)物變化推測(cè)其降解機(jī)理。

（1）JHFS?1降解苯酚中間產(chǎn)物的GC?MS分析

采用GC?MS 對(duì)苯酚不同降解時(shí)間的中間產(chǎn)物進(jìn)行分析，經(jīng)0h、24h、36h及48h降解后的總離子流圖如圖16 所示。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MS 數(shù)據(jù)庫(kù)NIST11和保留時(shí)間進(jìn)行定性，其主要代表性中間產(chǎn)物列于表2～表5。

表2 苯酚降解0h過(guò)程產(chǎn)物

表3 苯酚降解24h過(guò)程產(chǎn)物

表4 苯酚降解36h過(guò)程產(chǎn)物

表5 苯酚降解48h過(guò)程產(chǎn)物

圖16 JHFS?1降解苯酚的GC?MS總離子流圖

圖16(c)上停留時(shí)間11.532min、18.416min 和22.330min 分別對(duì)應(yīng)為乙二酸酯、琥珀酸鹽和5?羥基戊酸鹽類物質(zhì)，結(jié)合菌株的生長(zhǎng)曲線（圖5）可知，隨著苯酚的降解，24～36h 相對(duì)濃度先呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，隨著反應(yīng)進(jìn)行至48h，菌株OD600值趨于穩(wěn)定，表明菌株此時(shí)停止降解底物，過(guò)程產(chǎn)物會(huì)隨著反應(yīng)的停止而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，上述物質(zhì)可能是苯酚降解的末端產(chǎn)物。

在苯酚經(jīng)過(guò)24h降解的樣品中，檢測(cè)到鄰苯二酚（對(duì)應(yīng)停留時(shí)間為15.730min的峰），但在經(jīng)過(guò)36h和48h降解的樣品中沒(méi)有檢測(cè)到鄰苯二酚，這表明該化合物是苯酚降解的初始中間產(chǎn)物。在降解48h時(shí)樣品中檢測(cè)到2?氧代戊酸、甲酸、乙二酸、丁酸和富馬酸酯，這些產(chǎn)物是苯酚開(kāi)環(huán)降解的產(chǎn)物。苯甲酸和龍膽酸可能為另一種降解途徑的中間產(chǎn)物。

（2）JHFS?1降解苯酚的FTIR分析

圖17是苯酚降解中間產(chǎn)物的FTIR 圖譜，結(jié)合上述GC?MS分析結(jié)果，圖17(a)中1385.32cm?1尖銳峰表示存在苯環(huán)（苯環(huán)拉伸），說(shuō)明含有苯酚；圖17(b)中1765.54cm?1尖銳峰表示存在羥基官能團(tuán)，說(shuō)明可能含有鄰苯二酚等中間產(chǎn)物；圖17(b)、(c)中1663.47～1664.08cm?1代表了C= = O 基團(tuán)的存在，表明可能存在2-羥基黏糠酸半醛；圖17(a)～(c)中3236.48～3237.39cm?1為不飽和的C—H 伸縮振動(dòng)峰或者是—OH 伸縮峰位置，也表明有不飽和基團(tuán)存在，可能為雙鍵或炔烴或芳烴及羥基。

圖17 苯酚降解中間產(chǎn)物的FTIR分析

（3）JHFS?1降解苯酚的機(jī)理

根據(jù)JHFS?1降解苯酚過(guò)程中間產(chǎn)物的GC?MS分析和FTIR 分析，微生物降解苯酚的可能途徑如圖18所示。其中，羥基化途徑（如降解途徑Ⅰ和Ⅱ）是主要途徑，羧基化途徑（途徑Ⅲ）是次降解途，降解途徑Ⅰ、Ⅱ的產(chǎn)物量積累較多且具有高度的同步性，表明兩種途徑共存，途徑Ⅰ、Ⅱ是苯酚加羥基生成鄰苯二酚后開(kāi)環(huán)裂解，最終分別生成甲酸、丙酸、丁酸、乙二酸、琥珀酸和乙酰輔酶A。此外，從表5可以看出，只有在48h的樣品中檢測(cè)到苯甲酸。在降解36h時(shí)，降解途徑Ⅰ、Ⅱ的產(chǎn)物積累隨著反應(yīng)進(jìn)行達(dá)到高峰，由于產(chǎn)物積累，羥基化途徑的降解速率受到抑制，這可能刺激了苯酚的第3種降解途徑。由于苯甲酸的含量較低，且只存在于苯酚降解的后期，說(shuō)明降解途徑Ⅲ為次降解途徑，途徑Ⅲ將苯酚轉(zhuǎn)化為苯甲酸，并進(jìn)入苯甲酸降解路徑。

圖18 JHFS?1降解苯酚的途徑

2.4 JHFS-1對(duì)煤氣洗滌水的降解效果

將JHFS?1游離菌株按照上述實(shí)驗(yàn)條件投加到模擬固定床氣化煤氣洗滌水中（TOC值為278.83mg/L），間隔一定時(shí)間取樣，并測(cè)定水樣的TOC值及菌株生長(zhǎng)量的變化，結(jié)果如圖19所示。從圖19可以看出，在整個(gè)降解過(guò)程中TOC呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，經(jīng)過(guò)JHFS?1降解72h，煤氣化廢水中TOC濃度降低為115.92mg/L，降解率達(dá)到58.43%，此后TOC 值基本保持不變。從菌株生長(zhǎng)量（OD600）的變化曲線可以看出，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，JHFS?1 菌株逐漸消耗煤氣化廢水中的有機(jī)物，菌株也不斷生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)72h降解后，細(xì)菌生長(zhǎng)逐漸衰減，可能是溶液中有機(jī)物數(shù)量不足所致。菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)與煤氣化廢水中TOC的變化能較好地對(duì)應(yīng)起來(lái)。另外，煤氣洗滌水中含有的多種重金屬離子可能影響菌株對(duì)有機(jī)污染物的降解，致使TOC 降解率不太高，但仍達(dá)到58.43%，研究也說(shuō)明該菌株一定程度上可以處理有機(jī)和無(wú)機(jī)污染物共存的煤氣洗滌水。

圖19 JHFS?1對(duì)煤氣洗滌水中TOC的降解及生長(zhǎng)曲線

3 結(jié)論

（1）以焦化廢水和氣化廢水為菌源，苯酚為唯一碳源，采用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)馴化，馴化篩選出苯酚高效降解菌株JHFS?1，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)分析和基因測(cè)序，確定JHFS?1 為醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）。該菌株對(duì)苯酚（初始濃度為500mg/L）的降解率可達(dá)94.31%。

（2）根據(jù)苯酚降解中間產(chǎn)物的GC?MS 和FTIR分析，研究發(fā)現(xiàn)JHFS?1對(duì)苯酚的降解途徑有3種：主要遵從羥基化途徑，苯酚加羥基生成鄰苯二酚，然后開(kāi)環(huán)裂解；次降解途徑為羧基化途徑，苯酚羧基化生成苯甲酸，繼續(xù)降解為富馬酸和丙酮酸。

（3）JHFS?1 菌對(duì)模擬固定床氣化煤氣洗滌水中有機(jī)污染物具有較好的處理效果，TOC降解率可達(dá)58.43%。