孟喚男 郭曉冬△ 周小翠△ 陳 舲 王立玉 呂 英 徐振曄

（1 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤科，上海 200437；2 上海市黃浦區(qū)打浦橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務中心，上海 200020；3 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200032）

肺癌是最常見和最致命的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌所占比例近85%，并且經(jīng)常擴散到骨骼(30%～40%)，遠處骨轉移已成為肺癌終末期病人死亡的主要原因[1]。肺癌骨轉移病人長期遭受著骨癌痛折磨，生活質量和生存期顯著降低[2]。目前針對肺癌骨轉移治療方案，最新《肺癌骨轉移診療專家共識》推薦[3]首選骨改良藥物第三代雙磷酸藥物唑來膦酸為基礎用藥，通過抑制破骨細胞的活性，誘導其凋亡，有效抑制破骨細胞的骨吸收等機制治療骨轉移、控制疼痛[4]。但長期使用唑來膦酸易產(chǎn)生發(fā)熱等流感樣癥狀、疲勞、腹瀉、便秘等不良反應，使癌痛治療被迫終止，影響鎮(zhèn)痛效果。骨轉移癌痛是目前腫瘤治療領域的一個難點問題，因此尋求更加有效的鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。

惡性腫瘤發(fā)生骨轉移疼痛主要機制為“腫瘤細胞-破骨細胞-腫瘤微環(huán)境”變化誘發(fā)癌痛：腫瘤細胞在骨骼著床，引起破骨細胞大量增殖，骨吸收活性增強，導致骨質破壞，同時引起骨髓微環(huán)境呈酸性，H+激活初級感覺神經(jīng)元上的酸敏感性離子通道，從而引起痛覺過敏[5,6]。近年來的研究顯示，在破骨細胞表面呈現(xiàn)高表達αvβ3 整合素，可以介導由肌動蛋白構成的微絲結構通過聚合作用形成偽足小體，緊密附著于骨表面，并在附著區(qū)形成封閉腔，破骨細胞在該腔內釋放氫離子和各種酶類進行骨質溶解[7]。破骨細胞的黏附和偽足小體形成是破骨細胞進行骨溶解的前提和關鍵。在此過程中，αvβ3 整合素的連接和信號轉導作用以及足突小體的形成起著關鍵性的作用。而且研究表明，使用αvβ3 整合素抑制劑可以抑制破骨細胞的活躍[7]。

骨痛靈方以中醫(yī)補腎堅骨為理論指導，以補腎養(yǎng)精，破瘀通絡為治療原則，是我科根據(jù)上海市名中醫(yī)腫瘤專家徐振曄教授治療肺癌骨轉移疼痛的經(jīng)驗制訂的協(xié)定方。在我們前期的臨床對照研究中發(fā)現(xiàn)，骨痛靈聯(lián)合唑來膦酸治療惡性腫瘤骨轉移疼痛的療效確切[8,9]。此外，課題組還發(fā)現(xiàn)骨痛靈方可通過抑制RANKL/RANK/OPG 通路對破骨細胞生成的干預作用，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛療效[10]。破骨細胞骨吸收直接反映了骨溶解的狀態(tài)，骨溶解所帶來的炎性反應和神經(jīng)損傷，是造成骨轉移疼痛的關鍵。目前骨痛靈方對破骨細胞骨吸收機制尚不清楚。本研究為進一步分析骨痛靈治療肺癌骨轉移疼痛的具體機制，擬在前期研究基礎上，采用Lewis 肺癌細胞建立C57BL/6 小鼠肺癌骨轉移癌痛模型，用骨痛靈方進行治療，以破骨細胞的骨吸收關鍵分子αvβ3整合素作為切入點，為其更廣泛的臨床應用提供理論依據(jù)。

方 法

1.動物及細胞株

C57BL/6 雄性小鼠，周齡4～6 周，50 只，重量 (20±2) g，Specific pathogen-free (SPF) 級，購自上海靈暢生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003 。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2018-0040。飼養(yǎng)條件：SPF 級屏障環(huán)境中，每日10 h 人工照明，室內溫度為25℃，濕度為70%。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準(YYLAC-2019-002)。

熒光素酶標記小鼠肺癌Lewis 細胞系 (2LL-LUC)，批號為GF401，購自上海歌凡生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)方法：2LL-LUC 細胞用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

2. 藥物制備

骨痛靈方由淫羊藿(8030721097) 15 g，骨碎補(8010861097) 15 g，煅自然銅(8090321157) 9 g，炙蜈蚣(8080981017) 2 g，制川烏（8010671037）9 g，制草烏(8010681037) 9 g 組成，由上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房提供，按照國中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3 號《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》要求煎煮中藥，保證中藥煎藥質量。稱取3 劑中藥處方量加入10 倍冷水浸泡30 min，武火煮開后5 min，改文火煎45 min，冷卻，紗布過濾；將藥渣再次加入5 倍水量，重復第1 次煎煮方法；取2 次濾液混勻后置于旋轉蒸發(fā)儀濃縮至148 ml，配成含生藥1.2 g/ml 的中藥液，4℃?zhèn)溆谩Ｗ⑸溆眠騺盱⑺徕c（規(guī)格4 mg，H20041953）溶于0.9% NaCl 溶液中，配置濃度為0.01 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 主要試劑及儀器

αvβ3 抗體（MAB1976，1:1000，美國Sigma-Al drich 公司）；PyK2 抗體（sc-1514，1:600，美國Santa Cruz Biotechnology 公司）；Scr 抗體(ab230914，1:100)，Cbl 抗體（ab32446，1:200，美國Abcam 公司）；TRIzol RNA 分離試劑（批號T9424，美國Sigma-Aldrich 公司）；反轉錄試劑盒（R232-01，南京諾唯贊生物科技有限公司）；RT-PCR 試劑盒（11203ES03，上海翊圣生物科技有限公司）；Actin-Tracker Green-488 試劑盒(C2201S)，DAPI 染色液(C1006)，上海碧云天生物技術有限公司；增強型DAB 顯色試劑盒(DA1016)，Harris 蘇木素染色液(G1150)，北京索萊寶科技有限公司；D-熒光素鉀鹽（40902ES03，上海翊圣生物科技有限公司）。

CellXpert C170i 細胞培養(yǎng)箱，德國Eppendorf公司；TCS SP8 共聚焦顯微鏡，德國Leica 公司；QuantStudio 3 實時熒光定量 PCR 儀，美國Thermo Fisher 公司；vonFrey 纖維絲測痛儀，美國Stoelting公司；IVISLuminaL T Series III 小動物活體成像儀，美國PerkinElmer 公司；Pannoramic 250 全景切片掃描儀，CaseViewer 2.4 掃描瀏覽軟件，匈牙利3DHIESTECH 公司。

4. 分組及造模

50 只小鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為假手術組（Sham組）、模型組（Model組）、骨痛靈組（GTL組）、唑來膦酸組（ZA 組）、骨痛靈+唑來膦酸組（GTL +ZA 組），每組10 只。除Sham 組給予接種PBS 溶液外，其余各組均予鼠源肺腺癌細胞2LL-LUC 懸液造模。參照肺癌骨轉移模型建立方法造模[11]：鼠源肺腺癌細胞2LL-LUC 進行大量擴增培養(yǎng)，收集細胞懸液，37℃，1000 rpm 離心5 min（離心半徑為12.8 cm），重懸，PBS 多次清洗，最后稀釋至細胞密度為2×108個/ml；小鼠吸入異氟烷麻醉后，用1 ml 注射器針頭經(jīng)小鼠左后肢脛骨平臺刺入脛骨骨髓腔，然后換用吸有腫瘤細胞的25 μl 微量進樣器（注入前，微量進樣器內依次吸入1 μl 明膠海綿水溶液，1 μl 空氣和10 μl 腫瘤細胞懸液），注射完稍留針后緩慢拔出。Sham 組給予等量的PBS 溶液代替造模。1 周后小鼠腹腔注射D 熒光素鉀鹽溶液(150 mg/kg)，15 min 后行小動物熒光活體成像，可觀察到肺癌骨轉移模型鼠內有熒光顯像（見圖1），即可判斷為造模成功。

圖1 小鼠熒光活體成像圖(A) Sham 組；(B) Model 組Fig. 1 Fluorescence in vivo imaging of mice(A) The Sham operation group; (B) The Model group.

5. 給藥方法

造模后第2 日各組開始給藥干預，根據(jù)實驗動物用藥劑量換算[12]，小鼠用藥劑量為成人用藥劑量的12.33 倍，即為臨床等效劑量。GTL 組給予骨痛靈12 g/(kg·d)灌胃，每日1 次，共21 天；ZA 組給予唑來膦酸50 μg/(kg·d) 腹腔注射，每3 日1 次，共7 次；GTL + ZA 組給予骨痛靈灌胃和唑來膦酸腹腔注射，劑量和次數(shù)同上；Model 組和Sham 組給予同體積的生理鹽水灌胃或腹腔注射。

6. 觀察指標與方法

給藥結束后第2 天，使用頸椎脫臼法將小鼠處死，立即分組迅速取出左后肢脛骨骨組織標本，每組隨機選取6 只骨組織標本放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫黄溆? 只骨組織標本，清洗后放入4%多聚甲醛溶液固定。

（1）vonFrey 纖維絲測痛儀評價小鼠足底機械痛閾值

將小鼠置于具有鐵絲網(wǎng)格的特殊架上，取5 cm×8 cm×11 cm 的無底透明玻璃盒將小鼠罩住，在室溫安靜的環(huán)境下適應30 min 后，采用不同規(guī)格的vonFrey 細絲 (0.16 g, 0.4 g, 0.6 g, 1 g, 1.4 g, 2 g)按照從輕到重的順序用相同力度垂直方向刺激小鼠左后肢腳掌中部皮膚，每根需刺激5 次，刺激停留時間為1～2 s，同一細絲2 次不同刺激間隔5 s，不同纖維絲刺激間隔5 min，觀察小鼠縮足反應。小鼠機械痛閾值計分規(guī)則：若5 次刺激有3 次以上（含3 次）小鼠有縮足動作，該規(guī)格的vonFrey 細絲為疼痛閾值，若刺激至最大規(guī)格2 g 仍無縮足反應，則2 g 記為小鼠機械痛閾值。分別于造模前1 天，造模后第7 天、14 天、21 天進行檢測。

（2）激光共聚焦觀察破骨細胞偽足小體F-actin環(huán)形態(tài)

取石蠟固定的各組小鼠左后肢脛骨骨組織連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，微波抗原修復后用10%山羊血清室溫封閉孵育2 h；棄去血清，PBS 清洗3 次后加入Actin-Tracker Green-488 (5 μg/ml) 染色1 h；洗滌2 次后，加入DAPI (5 mg/ml)進行細胞核染色，室溫避光孵育10 min；洗滌后用50%甘油封片，打開共聚焦顯微鏡，設置波長參數(shù)，觀察熒光圖像及時拍照并將圖像存儲后進行分析。

（3）實時熒光定量PCR 實驗

運用NCBI 網(wǎng)站及在Primer Bank 軟件獲取目的基因引物，由上海生物工程有限公司合成。本研究中用于檢測目的基因mRNA 的實時熒光定量PCR引物序列見表1 所示。采用Trizol 法提取各組小鼠左后肢脛骨骨組織總RNA，并及時反轉錄成穩(wěn)定的cDNA；設置qPCR 反應條件：預變性—95℃ 5 min；變性—95℃ 10 s；退火延伸—60℃ 30 s；擴增—40個循環(huán)；將GAPDH 設置為對照內參基因，數(shù)據(jù)分析使用2-ΔΔCt法，統(tǒng)計分析目的基因相對表達水平。

表1 qPCR 引物序列Table 1 qPCR primer sequences

（4）免疫組化法檢測骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cbl 蛋白表達

將各組小鼠左后肢脛骨骨組織石蠟切片脫蠟至水后置于微波爐內進行抗原修復，待切片在室溫下冷卻后，PBS 清洗3 次（每次5 min）后，加入阻斷內源性過氧化物酶溶液常溫避光孵育25 min，PBS 清洗3 次（每次5 min）；向切片加入3% BSA PBS 溶液，室溫封閉30 min；棄封閉液后，加入適當比例的一抗，4℃搖床孵育過夜。次日，回收一抗后，加入相應二抗，室溫搖床孵育50 min；棄二抗后加入DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，自來水終止顯色；用Harris 蘇木素復染細胞核3 min 左右，自來水洗，氨水返藍，脫水封片，倒置顯微鏡下觀察，Pannoramic 250 全景切片掃描儀圖像采集，并用V1.8.0.112 版Image J 軟件半定量分析蛋白（棕色點）累計光密度 (integrated optical density, IOD)。

7. 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 7 軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差(±SD)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用雙因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 各組小鼠機械痛閾值比較

四組造模小鼠于第10天左右出現(xiàn)自發(fā)痛行為，表現(xiàn)為左后肢跛行、舔足、自發(fā)抬足時間延長，出現(xiàn)輕微觸誘發(fā)痛。各組小鼠左后肢足底的機械痛閾值比較發(fā)現(xiàn)（見圖2），Sham 組小鼠機械痛閾值走勢平穩(wěn)，波動不明顯；其余4 組從第7 日開始均呈現(xiàn)下降趨勢，Model 組波動尤為明顯。經(jīng)統(tǒng)計分析，與Sham 組比較，Model 組小鼠造模后機械痛閾值下降(P< 0.05)。造模后第14、21 天：與Model 組比較，各給藥干預組機械痛閾值升高(P< 0.05)；ZA 組與GTL 組機械痛閾值相當(P> 0.05)。造模后第21 天：GTL + ZA 組機械痛閾值較GTL 組、ZA組明顯升高(P< 0.05)。

圖2 各組小鼠機械痛閾值變化曲線圖(±SD)*P < 0.05，與Sham 組相比；#P < 0.05，與Model組相比；△P < 0.05，與ZA 組相比Fig. 2 Changes in mechanical pain threshold of mice in each group (±SD)*P < 0.05, compared with group Sham; #P < 0.05,compared with group Model; △P < 0.05, compared with group ZA .

2. 各組小鼠脛骨組織中破骨細胞偽足小體F-actin 環(huán)比較

各組小鼠左后脛骨組織經(jīng)羅丹明標記的綠色熒光鬼筆環(huán)肽染色F-actin 與藍色熒光染料DAPI 染色液染細胞核共同孵育后，共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（見圖3），胞漿內可見大量綠色熒光肌動蛋白F-actin 與細胞縱軸平行排列，呈細絲狀或網(wǎng)狀表達。與Sham 組比較，Model 組中F-actin 環(huán)分布于細胞周邊，微絲分布較有序，破骨細胞偽足F-actin 環(huán)完整，周圍有大量應力纖維形成；與Model 組比較，各給藥組可見胞內F-actin 環(huán)數(shù)量減少，環(huán)形態(tài)不完整，斷裂、周圍伴有少量應力纖維形成；與ZA 組比較，GTL 組F-actin 環(huán)破壞程度類似，GTL + ZA組F-actin 環(huán)破壞程度較明顯。與GTL 組比較，GTL + ZA 組F-actin 環(huán)明顯破壞。

圖3 各組小鼠脛骨組織中破骨細胞偽足小體F-actin 環(huán)（標尺 = 100 μm）Nuclei 為破骨細胞細胞核；F-actin 為F-actin 骨架蛋白；Merge 為兩者融合后圖像；紅色箭頭所指為F-actin 環(huán)；黃色虛線為破骨細胞縱軸Fig. 3 F-actin ring of osteoclast pseudopodosomes in the tibial tissue of mice in each group (Scale bar = 100 μm)Nuclei refer to the nucleus of osteoclast; The F-actin is a F-actin skeletal protein; Merge refers to the merged image of the Nuclei and Factin rings; The red arrows refer to the F-actin ring; The yellow dash lines are the longitudinal axis of the osteoclast.

3.各組小鼠脛骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 mRNA 表達比較

各組小鼠左后脛骨組織RT-PCR 結果經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（見圖4），與Sham 組比較，Model 組αvβ3、

表達比較(±SD)*P<0.05，與Sham組相比；#P<0.05，與Model圖4 各組小鼠脛骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 mRNA組相比；△P <0.05，與ZA組相比；&P<0.05，與GTL 組相比Fig. 4 Comparison of αvβ3, PyK2, Scr, and Cb1 mRNA expressions in the tibial tissue of mice in each group(±SD)*P < 0.05, comparedwithgroup Sham;#P< 0.05,compared withgroup Model;△P< 0.05, comparedwith group ZA;&P< 0.05,comparedwith groupGTL.

討 論

PyK2、Scr、Cbl mRNA 表達上調(P< 0.05)；與Model組比較，各給藥組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl mRNA 表達下調(P< 0.05)；與ZA 組比較，GTL 組αvβ3、PyK2、 Scr mRNA 表達升高，GTL + ZA 組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl mRNA 表達下降(P< 0.05)；與GTL組比較， GTL + ZA 組αvβ3、 PyK2、Scr、Cbl mRNA表達下降明顯(P< 0.05)。

4. 各組小鼠脛骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 蛋白表達比較

免疫組化分析各組小鼠左后脛骨組織中αvβ3信號通路相關蛋白，αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 蛋白主要定位在破骨細胞膜上，胞質中呈陽性表達（見圖5A）。進一步對蛋白染色面積進行半定量統(tǒng)計分析（見圖5B），與Sham 組比較，Model 組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl 蛋白染色強度明顯升高(P< 0.05)；與Model 組比較，各給藥組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl蛋白染色強度減弱(P< 0.05)；與ZA 組比較，GTL組αvβ3、 PyK2、 Scr 蛋白染色強度增強，GTL + ZA組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl 染色面積降低(P< 0.05)；與GTL 組比較，GTL + ZA 組αvβ3、PyK2、Scr、染色面積明顯降低(P< 0.05)。

中醫(yī)藥在治療骨癌痛方面發(fā)揮著重要作用，具有安全性高、毒副作用小、無成癮性等獨特的優(yōu)勢。上海市名中醫(yī)徐振曄教授根據(jù)臨床多年抗腫瘤治療經(jīng)驗，認為肺癌骨轉移疼痛屬于中醫(yī)“骨痹”范疇，該病以腎虛為本，寒凝、瘀血、痰濕為標，脈絡阻滯[13]，則“不通則痛”和“不榮則痛”。以補腎養(yǎng)精，破瘀通絡為治則，創(chuàng)立經(jīng)驗復方骨痛靈方。本研究結果顯示，骨痛靈方、唑來膦酸及聯(lián)合用藥均能提高肺癌骨轉移模型小鼠機械痛閾值，破壞偽足小體結構，且聯(lián)合用藥優(yōu)于單藥干預效果，骨痛靈方與唑來膦酸結果類似，提示各給藥組均能破壞破骨細胞結構發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用。與前期的臨床研究結果一致[14]，骨痛靈聯(lián)合唑來膦酸治療惡性腫瘤骨轉移疼痛的鎮(zhèn)痛效果顯著。骨痛靈方主要成分有蜈蚣、骨碎補、川草烏、淫羊藿等組成?，F(xiàn)代藥理學研究證實，蜈蚣水提物可增加小鼠微血管的開放數(shù)目及增大其口徑，具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用[15]；川烏能抑制巴豆油所致的大鼠炎性肉芽腫增生，明顯提高小鼠熱板痛閾值[16]。因此，骨痛靈方抗骨癌痛作用可能與其方中的蜈蚣及川草烏有關。

骨吸收直接反映了骨溶解的狀態(tài)，骨溶解所帶來的炎性反應和神經(jīng)損傷，是造成骨轉移疼痛的關鍵。成熟的破骨細胞行使骨吸收功能時，必須形成一個特殊的肌動蛋白結構—偽足小體。偽足小體緊密附著于骨表面，并在附著區(qū)形成封閉腔，破骨細胞在該腔釋放氫離子和各種酶類進行骨質溶解[17]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，骨痛靈組、唑來膦酸組以及聯(lián)合用藥組可見胞內F-actin 環(huán)形態(tài)不完整，斷裂，且聯(lián)合用藥組F-actin 環(huán)破壞程度較明顯；骨痛靈組與唑來膦酸組F-actin 環(huán)形態(tài)相似。提示骨痛靈、唑來膦酸及聯(lián)合用藥均能抑制破骨細胞偽足小體結構形成，進而影響破骨細胞骨吸收功能，且聯(lián)合用藥效果更好。既往基礎研究發(fā)現(xiàn)骨碎補總黃酮對成骨細胞分化和增殖均有促進作用，具有抑制破骨母細胞向多核破骨細胞轉化的作用[18]，本研究結果推測骨痛靈方抑制破骨細胞骨吸收功能可能與其方中的骨碎補相關。

破骨細胞偽足小體形成過程中αvβ3 整合素尤為重要，它可以介導由肌動蛋白構成的微絲結構通過聚合作用形成該結構。αvβ3 整合素在破骨細胞呈高表達，被認為是破骨細胞骨吸收過程中的核心分子，阻斷αvβ3 可影響偽足小體的形成、破骨細胞的運動和骨吸收[19]。研究表明[20,21]，整合素αvβ3的胞內信號可以通過誘導細胞內Ca2+的升高，而激活作為鈣調節(jié)蛋白的Pyk2，Pyk2 的活化可以誘導c-Src 的募集和Cbl 的磷酸化，即在αvβ3 的作用下形成PyK2/Src/Cbl 分子復合物，啟動骨架蛋白的改變，最終形成偽足小體。與上述研究結果一致，本研究肺癌骨轉移小鼠造模成功后，脛骨組織中αvβ3、PyK2、Src 及Cbl mRNA 表達及蛋白染色強度升高，偽足小體形態(tài)完整且數(shù)量多。各給藥組干預后，αvβ3、PyK2、Src 及Cbl mRNA 表達及蛋白染色強度均降低，且聯(lián)合用藥后降低明顯，提示骨痛靈、唑來膦酸及聯(lián)合用藥均能抑制αvβ3/PyK2/Src/Cb1 通路。

綜上所述，骨痛靈方及其聯(lián)合唑來膦酸可提高骨轉移癌痛機械痛閾值，破壞骨組織中F-actin 環(huán)結構，且兩藥聯(lián)用具有增效作用，其機制可能通過調控骨組織中αvβ3/PyK2/Src/Cbl 通路抑制破骨細胞偽足小體形成起到骨保護作用，從而治療肺癌骨轉移疼痛（見圖6）。

圖6 骨痛靈方通過抑制αvβ3 通路介導破骨細胞偽足小體形成治療肺癌骨轉移疼痛的示意圖肺癌骨轉移疼痛的發(fā)生有3 個過程：①肺癌腫瘤細胞在骨骼肌著床后引起破骨細胞高表達整合素αvβ3；②整合素αvβ3 胞內信號誘導細胞內Ca2+的升高，激活鈣調節(jié)蛋白PyK2，誘導c-Src 的募集和Cb1 的磷酸化，形成αvβ3/PyK2/Src/Cb1 分子復合物，啟動骨架蛋白的改變，最終形成足突小體；③破骨細胞釋放更多氫離子而產(chǎn)生痛覺過敏。骨痛靈方通過降低破骨細胞αvβ3 表達，抑制αvβ3/PyK2/Src/Cb1 通路，破壞偽足小體形成發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。Fig. 6 Schematic diagram of Gutongling Decoction alleviates pain induced by bone metastasis of lung cancer through inhibiting αvβ3 signaling pathway-mediated formation of osteoclast pseudopodosomes There are three processes for the occurrence of pain in bone metastasis of lung cancer:①Lung cancer tumor cells cause osteoclasts to express high integrin αvβ3 after skeletal muscle implantation; ②The intracellular signal of integrin αvβ3 induces the increase of intracellular Ca2+, activates the calcium regulatory protein PyK2, induces the recruitment of c-Src and phosphorylation of Cb1, forms a molecular complex of αvβ3/PyK2/Src/Cb1, and initiates the changes of skeletal proteins, finally forming podocytes;③Osteoclasts release more hydrogen ions to produce hyperalgesia. Gutongling Decoction exerts analgesic effect by reducing the expression of αvβ3 in osteoclasts, inhibiting the αvβ3/PyK2/Src/Cb1 pathway,and destroying the formation of pseudopodosomes.

本研究尚存在一定局限性，未用αvβ3 抑制劑或建立穩(wěn)敲αvβ3 肺癌骨轉移動物模型，后續(xù)將進一步完善相關實驗：明確骨痛靈方抗肺癌骨轉移疼痛的具體機制，借助現(xiàn)代分子生物學手段成功建立αvβ3 靶標肺癌細胞模型，驗證骨痛靈方對αvβ3 分子依賴功能，闡明αvβ3/PyK2/Src/Cbl 這條信號通路調控偽足小體形成影響骨吸收癌痛的具體作用機制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。