徐文杰，陳雪婷，馮健英，李潔環(huán)，李智勇，張建軍

（廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州，510095）

布渣葉（microctis folium），為椴樹科植物破布葉Microcos paniculataL.的干燥葉，具有消食化滯，清熱利濕的功效，臨床常用于治療飲食積滯，感冒發(fā)熱，濕熱黃疸等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明布渣葉總黃酮提取物有保護心血管以及降血脂的藥理作用[2,3]。課題組前期藥效學(xué)實驗證實布渣葉總黃酮能顯著降低高脂血癥小鼠模型血清中總膽固醇和甘油三酯含量，且無明顯的肝腎損傷等不良反應(yīng)，提示其安全且調(diào)脂作用明確[4～6]。目前布渣葉總黃酮的體內(nèi)活動活性成分方面的報道主要集中在牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷等，為了對布渣葉總黃酮提取物發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)進行深入研究，需將中藥血清藥物化學(xué)研究與藥理學(xué)研究相結(jié)合起來，本課題采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)聯(lián)合化學(xué)模式識別，以大鼠口服布渣葉總黃酮給藥后血清為樣品，從血清中分離、鑒定移行成分，研究血清中移行成分，旨在揭示布渣葉總黃酮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 液相色譜儀（ExionLC AC型，日本，島津公司）；質(zhì)譜儀（X500R QTOF型，美國，AB Sciex公司）；動物電子天平（JJ 3000型，G&C公司）；電子分析天平（XS205DU型，瑞士，Mettler-Toledo公司）；渦旋混合儀（上海青浦滬西儀器廠）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水器（milli-Q advantage型，密理博中國有限公司）；微量離心機（Legend Micro 17R型，美國，Thermo Scientific公司，離心半徑8.6cm）；氮吹儀（HSC-12A型，天津Hengao公司）；超低溫冰箱（MDF-382型，日本，SANYO公司）。

1.2 試藥 布渣葉總黃酮提取物為實驗室自制。牡荊苷、香蒲新苷、異夏佛塔苷、紫云英苷對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號分別為M-023-120429、X-020-120305、Y-153-190626、Z-020-171205，純度均>98.0%），異佛萊心苷對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號AF802613，純度>98.0%），銀椴苷對照品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號PRF9101501，純度>98.0%）。甲醇、乙腈為質(zhì)譜純，甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析級。

1.3 動物 雄性SD大鼠，SPF級，體重180～220g，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0002，合格證號：44007200011927，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。所有大鼠均遵循實驗動物倫理學(xué)要求飼養(yǎng)及實驗操作。控制室內(nèi)溫度為22±2℃，相對濕度40～50%，大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，于室內(nèi)保持12小時光照、12小時避光循環(huán)飼養(yǎng)。動物實驗環(huán)境：廣東省中醫(yī)研究所SPF級動物實驗室，環(huán)境設(shè)施使用許可證號：SYXK（粵）2010-0059。

2 方法與結(jié)果

2.1 布渣葉總黃酮提取物制備[4]取布渣葉藥材適量，60%乙醇回流提取2次，第1次14倍，第2次12倍，每次1小時，濾過，合并濾液。濾液于60℃，-0.08mpa減壓濃縮至每毫升0.5g生藥的濃縮液。取2BV濃縮液，以2BV·h-1的速度通過D101大孔吸附樹脂，再用1.5BV的水，以2BV·h-1速度洗脫，再用2.25BV 80%乙醇，以2BV·h-1速度洗脫，得到洗脫液。洗脫液于60℃，-0.08mpa減壓濃縮至無醇味，再置于60℃，-0.08mpa真空干燥，粉碎，即得。按照參考文獻[6]方法測定提取物中總黃酮含量≥80%。

2.2 動物分組、給藥與取材[5]SPF級SD大鼠預(yù)先適應(yīng)1周后開始實驗。隨機分為兩組，分別為空白對照組、布渣葉總黃酮提取物給藥組，每組6只?？瞻讓φ战M給予正常飼料。布渣葉總黃酮提取物加雙蒸水配制成溶液，給藥組大鼠每天口服灌胃布渣葉總黃酮提取物（0.25g/kg），每天2次，連續(xù)4周。兩組大鼠均自由飲水。實驗過程中觀察大鼠行為學(xué)特征的變化。給藥組大鼠于給藥后的第4周末下午開始禁食不禁水12小時，第二天上午空白對照組與給藥組大鼠均從眼眶后靜脈叢采1mL，置肝素化的離心管中，搖勻，3000r·min-1離心10 min，分離血漿，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析樣品的制備 布渣葉總黃酮樣品溶液：稱取布渣葉總黃酮提取物適量，加乙腈超聲提取30min，3000rpm離心10 min，取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，供進樣分析。

血清樣品溶液：取給藥血漿樣品（或空白血漿）室溫解凍，渦旋混合30s，精密吸取100μL血漿樣品（或空白血漿）置離心管中，加入300μL乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩2min，13000rpm離心10min，取上清液300μL，水浴（40℃）氮氣吹干。殘渣加300μL乙腈復(fù)溶，0.22μm微孔濾膜濾過，供進樣分析。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18柱（150mm×2.1mm，1.6μm）；流動相：乙腈（A）-0.01%甲酸水溶液（B）梯度洗脫（見表1）；進樣室溫度：15℃；柱溫：40℃；流速：0.5mL/min；進樣量：1μL。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 質(zhì)譜條件 正、負(fù)離子模式掃描，掃描范圍m/z100～1500，霧化氣壓力350.3kPa，輔助氣壓力350.3kPa，氣簾氣壓力241.1kPa，霧化溫度500℃，電噴霧離子源（ESI）；正離子模式下，毛細(xì)管電壓5.5kV，裂解電壓100V，碰撞能量35eV，碰撞能量疊加15eV；負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓4.5kV，裂解電壓-80V，碰撞能量35eV，碰撞能量疊加15eV。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取同一份布渣葉總黃酮樣品溶液，按照2.4項下方法操作制備供試品溶液，按照2.5項下分析條件方法連續(xù)進樣6次，選取若干豐度較大的峰為考察對象，記錄各峰峰面積（A），計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6），結(jié)果顯示各峰峰面積RSD值均小于5%，該方法精密度尚可。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取同一份布渣葉總黃酮樣品溶液，按照2.4項下方法平行操作制備6份供試品溶液，按照2.5項下測定方法進樣，選取若干豐度較大的峰為考察對象，記錄各峰峰面積（A），計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6），結(jié)果顯示各峰峰面積RSD值均小于5%，表明該制備方法可靠。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份布渣葉總黃酮樣品溶液，按照2.4項下方法操作制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20、24小時按照2.5項下測定方法進樣，選取若干豐度較大的峰為考察對象，記錄各峰峰面積（A），計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果顯示各峰峰面積RSD值均小于8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCAP14.1軟件進行統(tǒng)計分析，通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀觀察三組樣品的化學(xué)成分差異；在主成分分析（PCA）基礎(chǔ)上，以正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）分別對各樣品進行分析，通過VIP值評價并獲得3組樣品潛在的差異化學(xué)成分。采用SPSS22.0軟件對研究中得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗，驗證多維統(tǒng)計中找到的差異化學(xué)成分在單維統(tǒng)計中是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，按P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7 布渣葉總黃酮提取物化學(xué)成分分析 取2.3項下布渣葉總黃酮提取物樣品，按2.4項下分析條件進樣，進行UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，得到布渣葉總黃酮色譜圖（圖1）。鑒別出20個化學(xué)成分，包括1個苯駢色原酮類，9個黃酮碳苷類，10個黃酮醇及其氧苷類。

圖1 布渣葉總黃酮提取物UPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖

2.8 大鼠口服布渣葉總黃酮后血中移行成分分析取2.3項下空白血清及給藥血清樣品，按2.4項下分析條件進行UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，通過對比研究空白血清、給藥血清、布渣葉總黃酮提取物三組樣品的色譜圖（圖2，圖3），根據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析化合物保留時間、一級質(zhì)譜精確的質(zhì)荷比與二級質(zhì)譜碎片離子特征，并結(jié)合對照品比對和文獻比對成分進行鑒定，比較鑒定大鼠血中移行成分及其來源。對VIP>1且P<0.05的化學(xué)成分進行結(jié)構(gòu)鑒定。鑒定大鼠口服布渣葉總黃酮提取物后有14個血中移行成分（見表2）。1、2、3、4、5號成分為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，除此之外，其余9個血中移行成分為布渣葉總黃酮所含原型成分直接吸收入血形成。

圖2 UPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖（正離子模式）

圖3 UPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖（負(fù)離子模式）

4 討論

為了加速中藥高質(zhì)量控制體系的建立，提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，加速中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展，劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)質(zhì)物（Q-marker）的概念和質(zhì)量標(biāo)志物的五原則基本要求[7、8]：質(zhì)量傳遞與溯源、成分特有性、成分的有效性、成分可測性、復(fù)方配伍環(huán)境。藥物給藥進入體內(nèi)經(jīng)過消化、吸收、代謝等各種過程后，能發(fā)揮藥效的成分一定是能被吸收入血的成分，而入血的有效成分（或有效成分群）可能是中藥原型成分、代謝產(chǎn)物或中藥中各成分間相互反應(yīng)形成的新成分，還可能是機體在藥物作用下生成的新的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。這些生理活性物質(zhì)均以血液為介質(zhì)輸送到作用靶點才能產(chǎn)生效用，因而給藥后的血清才是真正起作用的“制劑”[9]。這些入血成分真實地反映了中藥在體內(nèi)的變化過程，能體現(xiàn)各成分對機體的協(xié)同作用，可代表中藥及復(fù)方的整體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。因此，分析入血成分有助于尋找中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

由于中藥及復(fù)方所包含的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量龐大且復(fù)雜，UPLC-Q-TOF-MS/MS可以高效、高分辨地分離檢測化合物。目前，UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)合化學(xué)模式識別技術(shù)在中醫(yī)藥研究中得到廣泛應(yīng)用[11-12]，本研究應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)合化學(xué)模式識別技術(shù)對布渣葉總黃酮提取物的入血成分進行了分析，鑒定了14個血中移行成分，其中5個為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，9個成分為布渣葉總黃酮提取物的原型成分。

對血清樣品處理方法的選擇，在實驗中血清處理時考察了有機溶劑（甲醇，乙腈）沉淀法，正丁醇或乙酸乙酯或乙醚液液萃取法等多種方法，結(jié)果乙腈沉淀法處理后的樣品其色譜圖背景較高，信息量較大，因此最終選擇了乙腈沉淀法對樣品進行處理。

布渣葉總黃酮提取物灌胃大鼠口服后的血中移行成分減少了，分析其可能原因：一是口服后經(jīng)胃腸道吸收的藥量少；二是口服后進入胃腸道藥物被胃腸道內(nèi)酶或腸道細(xì)菌所代謝；三是藥物雖可被胃腸粘膜吸收，但藥物被腸壁或肝臟的酶所代謝，即首過效應(yīng)。