王彬，何沖，刑遼

陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（西安 710048）

食品添加劑因具有防止食品腐敗變質(zhì)、改善食品感官品質(zhì)、提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]、增加食品種類(lèi)[2-3]等功能，被譽(yù)為現(xiàn)代食品工業(yè)的靈魂。近年來(lái)，食品添加劑產(chǎn)業(yè)迅速壯大[4]。糖精鈉，學(xué)名鄰苯甲?；酋啺封c，為白色結(jié)晶性粉末，易溶于水，是常用的有機(jī)化工合成甜味劑，其甜度為蔗糖的300～500倍，可部分代替蔗糖用于飲料、蜜餞涼果、焙烤食品等。糖精鈉不被人體分解吸收，作為食品添加劑僅具備提供甜味的功能，少劑量攝入短時(shí)會(huì)隨尿液排出體外，但短時(shí)間內(nèi)大量攝入糖精鈉會(huì)造成急性大出血、多臟器損害等中毒現(xiàn)象[5-6]。因此，精準(zhǔn)檢測(cè)食品中糖精鈉含量的技術(shù)優(yōu)化尤為關(guān)鍵。

糖精鈉含量檢測(cè)最常采用GB 5009.28—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》[7]中的液相色譜法，但受樣品成分、樣品性狀的干擾，按照現(xiàn)有色譜條件并不能準(zhǔn)確測(cè)量果汁飲料中的糖精鈉含量。隨檢測(cè)技術(shù)的迅速提高，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、離子色譜串質(zhì)譜法等技術(shù)的運(yùn)用可大幅提升糖精鈉檢測(cè)的準(zhǔn)確性。但由于大多數(shù)檢測(cè)設(shè)備欠缺及成本限制，新型技術(shù)無(wú)法普及，液相色譜法仍是測(cè)定糖精鈉含量的常規(guī)首選方法。研究表明色譜柱是液相色譜的核心技術(shù)，選擇適宜的色譜柱可達(dá)到較好的分離效果，極大程度提高檢測(cè)的精密度[8-9]。流動(dòng)相的正確選擇可有效分離待測(cè)物與雜質(zhì)，縮短目標(biāo)物的保留時(shí)間[10]。盧連登等[11]對(duì)比等度洗脫和梯度洗脫對(duì)黑蒜中蒜氨酸及相關(guān)硫化物含量測(cè)定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等度洗脫出峰時(shí)間適宜、峰形更好、分離效果更佳。

參考GB 5009.28—2016，通過(guò)測(cè)定不同色譜柱、流動(dòng)相、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍、洗脫方式對(duì)糖精鈉定量的影響，優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定果汁飲料中糖精鈉含量的色譜條件，以便于更精準(zhǔn)進(jìn)行定量測(cè)定。該色譜條件的建立對(duì)常規(guī)果汁飲料中糖精鈉定量測(cè)定技術(shù)精密度的提高具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果汁飲料（北京匯源飲料食品集團(tuán)有限公司）；甲醇[色譜級(jí)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；甲酸（優(yōu)級(jí)純，上海麥克林生化科技有限公司）；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；糖精鈉（1 000 μg/mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；0.22 μm親水型PES濾頭（天津博納艾杰爾科技有限公司）；色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；島津ODS-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ACE柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取1.0 mL 1 000 μg/mL糖精鈉儲(chǔ)備液，加水定容至10 mL，配制成100 μg/mL糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，冷藏避光保存。

1.3.2 流動(dòng)相配制

乙酸銨溶液（20 mmol/L）：稱(chēng)取1.54 g乙酸銨，加水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。

甲酸乙酸銨溶液（2 mmol/L甲酸+20 mmol/L乙酸銨）：稱(chēng)取1.54 g乙酸銨，吸取75.2 μL甲酸，加水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.3 樣品前處理

稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g）樣品，加20 mL超純水超聲溶解，移至50 mL離心管，振蕩5 min，按4 000 r/min離心10 min取上清液，再次于沉淀中加入20 mL超純水重復(fù)提取，均質(zhì)離心取上清液。合并2次上清液并定容至50 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱采用ACE柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為甲醇-水（95∶5，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃；采用等梯度洗脫。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用高效液相色譜儀LabSolutions軟件采集數(shù)據(jù)及繪制譜圖，采用JMP Pro 14.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同色譜柱對(duì)糖精鈉定量測(cè)定的影響

試驗(yàn)選取5種常見(jiàn)色譜柱，即Plus C18柱、XDB-C18柱、Poroshell 120 EC-C18柱、島津ODS-C18柱和ACE柱，參照GB 5009.28—2016的色譜條件進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖1。樣品通過(guò)5種色譜柱分離，Poroshell 120 EC-C18柱因粒徑較小，流速較低，糖精鈉出峰最晚，峰形較寬，且出峰位置基線(xiàn)較不平穩(wěn)。XDB-C18柱，糖精鈉出峰位置出現(xiàn)明顯干擾峰，分離效果不佳。Plus C18柱、島津ODS-C18柱和ACE柱，糖精鈉峰形均呈對(duì)稱(chēng)尖銳狀，且出峰時(shí)間無(wú)明顯差異。

圖1 5種色譜柱測(cè)定糖精鈉的色譜圖

糖精鈉定量測(cè)定結(jié)果如表1所示。在不同色譜柱下糖精鈉含量的測(cè)定結(jié)果存在較大差異，最大兩組差異偏差超過(guò)10%。Plus C18柱，糖精鈉定量結(jié)果偏高，可能是由于樣品在428 nm存在吸收，無(wú)法將雜質(zhì)與糖精鈉有效分離引起。ACE柱色譜柱分離測(cè)定的糖精鈉含量與真實(shí)值的偏差最小，效果最佳。其次為XDB-C18柱。

表1 5種色譜柱測(cè)定的樣品中糖精鈉含量結(jié)果（n=6）

圖2 Plus C18柱光譜對(duì)比圖

2.2 不同流動(dòng)相對(duì)糖精鈉定量測(cè)定的影響

國(guó)標(biāo)測(cè)定糖精鈉含量常用甲醇乙酸銨作為流動(dòng)相，存在干擾峰時(shí)加入甲酸可有效分離干擾峰[12]。分別以甲醇乙酸銨溶液、甲醇+甲酸乙酸銨溶液為流動(dòng)相，在相同的色譜條件下測(cè)定糖精鈉含量。結(jié)果顯示以甲醇乙酸銨、甲醇+甲酸乙酸銨作為流動(dòng)相測(cè)得的糖精鈉含量與實(shí)際含量（14.486 mg/L）的偏離程度差異不大。由圖3和圖4可知，兩種流動(dòng)相峰形均較好。與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖對(duì)比，甲醇+甲酸乙酸銨作為流動(dòng)相保留時(shí)間為10.438 min，加酸使糖精鈉的出峰時(shí)間提前，可縮短檢測(cè)時(shí)間。甲醇乙酸銨作為流動(dòng)相，與雜質(zhì)峰分離效果更好，基線(xiàn)也較為平穩(wěn)，且SRSD較小，穩(wěn)定性更好，因此選用甲醇乙酸銨溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行果汁飲料中糖精鈉的定量測(cè)定。

表2 不同流動(dòng)相測(cè)定的樣品中糖精鈉含量結(jié)果（n=6）

圖3 甲醇乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品對(duì)比圖譜

圖4 甲醇+甲酸乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品對(duì)比圖譜

2.3 不同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍對(duì)糖精鈉定量測(cè)定的影響

分別配制1，5，10，20，50，100，200 μg/mL系列和5，10，15，20，30，50 μg/mL系列的糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，以這2種標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，XDB-C18柱和ACE柱均在5～50 μg/mL線(xiàn)性范圍內(nèi)糖精鈉含量測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值偏差較小，為保障測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，應(yīng)適當(dāng)縮小線(xiàn)性范圍，且嚴(yán)格控制待測(cè)樣品濃度在線(xiàn)性范圍內(nèi)。

表3 不同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍測(cè)定的樣品中糖精鈉含量結(jié)果（n=6）

2.4 梯度洗脫和等度洗脫對(duì)糖精鈉定量測(cè)定的影響

采取GB 2760—2014檢測(cè)條件，選用ACE色譜柱對(duì)比等度洗脫和梯度洗脫，測(cè)定的糖精鈉含量結(jié)果見(jiàn)表5。實(shí)際工作中測(cè)定樣品種類(lèi)復(fù)雜，大批量進(jìn)樣時(shí)雜質(zhì)洗脫效果不佳，保留在色譜柱內(nèi)極大降低分離效率，且容易造成堵塞。而梯度洗脫可有效洗脫雜質(zhì)，延長(zhǎng)色譜柱壽命，改善待測(cè)物峰形，減少長(zhǎng)時(shí)進(jìn)樣保留時(shí)間漂移等問(wèn)題[13]。對(duì)比2種洗脫程序色譜圖發(fā)現(xiàn)，待測(cè)物均能較好地與雜質(zhì)峰分離，且峰形較好，基線(xiàn)均平穩(wěn)，保留時(shí)間差別不大。采用梯度洗脫及等度洗脫糖精鈉定量的結(jié)果偏差均小于0.5%，但梯度洗脫結(jié)果準(zhǔn)確性略高，且SRSD值較小，穩(wěn)定性更好。

表5 不同洗脫程序樣品中糖精鈉含量結(jié)果（n=6）

圖5 等度洗脫程序下測(cè)得的樣品色譜圖

圖6 梯度洗脫程序下測(cè)得的樣品色譜圖

表4 梯度洗脫程序

2.5 質(zhì)控樣品中糖精鈉含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比

質(zhì)控樣品測(cè)定是衡量檢測(cè)準(zhǔn)確性的重要標(biāo)準(zhǔn)，有助于進(jìn)行糾偏分析，提升實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力[14]。采用試驗(yàn)確定的最佳色譜條件，選用XDB-C18柱、ACE柱對(duì)質(zhì)控樣品中糖精鈉含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。ACE柱測(cè)得的結(jié)果更接近真實(shí)值，且偏差更小。但2種色譜柱測(cè)定的糖精鈉含量結(jié)果差異不大明顯，偏差約0.5%，證實(shí)所篩選的色譜條件具有穩(wěn)定可靠性。

表6 質(zhì)控樣品中糖精鈉含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.6 果汁飲料中糖精鈉加標(biāo)回收情況

選擇一款食品標(biāo)簽上不含糖精鈉的果汁飲料（匯源果汁），按照上述步驟制樣，在制得的樣液中分別加入7，14和28 mg/L的糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明不同加標(biāo)量水平的回收率均在95%～100%之間，SRSD均小于0.5%，表明該方法精確度高，準(zhǔn)確性好，能夠較準(zhǔn)確地對(duì)果汁飲料中糖精鈉進(jìn)行定量測(cè)定。

表7 果汁飲料中糖精鈉回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

在GB 5009.28—2016基礎(chǔ)上，通過(guò)測(cè)定不同色譜條件對(duì)糖精鈉定量的影響，優(yōu)化一系列可準(zhǔn)確定量果汁飲料中糖精鈉含量的色譜條件。選用ACE色譜柱，流動(dòng)相為甲醇乙酸銨溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)取值范圍5～50 μg/mL，采用梯度洗脫時(shí)，回收率在95%～100%之間，SRSD值小于0.5%。該色譜條件精確度高，能準(zhǔn)確對(duì)糖精鈉進(jìn)行定量測(cè)定，為日常果汁飲料中糖精鈉含量的實(shí)際測(cè)定提供一定理論支撐與技術(shù)保障。