王瀾，曾帆，黃榮鳳，林樹，張志輝，李旻典

研究報告

脂肪細胞促進高脂飲食誘導(dǎo)肥胖

王瀾，曾帆，黃榮鳳，林樹，張志輝，李旻典

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，代謝生物鐘與心血管病中心，重慶 400038

脂肪組織的神經(jīng)支配與調(diào)節(jié)在能量代謝穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)肽Y (neuropeptide Y, NPY)及其脂肪細胞受體信號通路促進高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，其中NPY受體1 (NPY receptor Y1, NPY1R)與受體2(NPY2R)是主要的NPY外周受體。NPY受體4 (NPY4R)也在脂肪組織表達，然而尚不清楚其是否參與肥胖的發(fā)生發(fā)展機制。本研究建立了NPY及其受體的免疫熒光成像技術(shù)和脂肪細胞回復(fù)性表達小鼠。根據(jù)對不同部位脂肪組織的熒光顯微術(shù)觀察，發(fā)現(xiàn)NPY在肩胛間棕色脂肪和皮下脂肪的圍繞血管區(qū)域以點狀形式表達，NPY系統(tǒng)的各受體在脂肪組織的空間分布上具有明顯的組織特異性：NPY1R在棕色脂肪、主動脈周圍脂肪和性腺脂肪較為富集，NPY2R在棕色脂肪和主動脈周圍脂肪較為富集，NPY4R在棕色脂肪與性腺脂肪較為富集。繼而通過比較脂肪細胞回復(fù)性表達小鼠與全身基因靜默小鼠在高脂喂食下的體重與糖代謝，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞促進高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖(< 0.0001)。本研究明確了NPY及其受體NPY1R、NPY2R和NPY4R在不同部位脂肪組織的蛋白水平與分布，進而用脂肪細胞特異性地回復(fù)表達小鼠模型揭示脂肪細胞具有促進高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的作用。

條件性基因回復(fù)表達；loxP-STOP-loxP；脂肪細胞；脂肪組織；肥胖

脂肪組織與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相互作用在能量代謝穩(wěn)態(tài)的維持過程中發(fā)揮著重要作用。長期以來，以脂肪組織分泌的脂肪因子(adipokine)為媒介進行從“脂肪到下丘腦”的體液調(diào)節(jié)機制研究受到了人們的廣泛關(guān)注[1]。其中，瘦素(leptin)和脂聯(lián)素(adiponectin, adipoq)是經(jīng)典的脂肪因子[2]，而白脂素(asprosin)與內(nèi)源大麻素(endocannabinoid)是新近發(fā)現(xiàn)的分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)食欲與高脂誘導(dǎo)食欲的脂肪因子[3,4]。同時，脂肪組織還存在神經(jīng)末梢的交聯(lián)[5]。脂肪組織的交感神經(jīng)末梢沿血管分布，與脂肪細胞接觸，并且在褐色脂肪、米色脂肪與白色脂肪之間存在明顯的交感神經(jīng)末梢分布密度與細胞間接觸點數(shù)量的不同[6～8]。相反，感覺神經(jīng)末梢也與脂肪細胞存在接觸，前者與交感神經(jīng)末梢存在拮抗作用[9]。

神經(jīng)肽Y (neuropeptide Y，NPY)是已知最有效的促進基礎(chǔ)食欲的肽類信號分子[10,11]。與NPY結(jié)構(gòu)相似的肽類信號分子還包括肽YY (peptide YY，PYY)與胰多肽(pancreatic polypeptide，PP)。NPY、PYY、PP及五個主要識別受體(NPY1R、NPY2R、NPY4R、NPY5R、NPY6R)組成NPY受體信號通路，是能量穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制的重要組成部分[12]。NPY受體與上述肽類信號分子的結(jié)合能力不盡相同且存在細胞表達特異性。NPY與PYY具有相似的受體親和力，即NPY2R>NPY1R>NPY5R>>NPY4R～NPY6R；相反胰多肽的高親和力受體是NPY4R～NPY6R[12]。脂肪細胞表達多個NPY受體的轉(zhuǎn)錄本，如與。脂肪組織與轉(zhuǎn)錄本與體重呈正相關(guān)，且脂肪細胞特異性敲除促進棕色脂肪和米色脂肪的適應(yīng)性產(chǎn)熱能力，進而抑制高脂誘導(dǎo)肥胖(飲食性肥胖)[13]。敲低脂肪特異性基因可抑制脂肪組織血管的生長、脂質(zhì)沉積與機體能量代謝，從而減輕飲食性肥胖[14,15]。因此，基于PYY-NPY1/2R信號通路的受體抑制劑在小鼠與非人靈長類的肥胖疾病模型中取得顯著的減重效果[13,16]。

相比NPY1R與NPY2R受體信號通路，NPY4R信號通路在脂肪細胞的功能尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)全身敲除的小鼠在正常飲食條件下減少體重，抑制脂肪堆積，并伴隨著較高的能量代謝率，但沒有發(fā)生攝食量的改變[12,17]。Npy4r ob/(leptin，瘦素基因)小鼠較/更加肥胖，這表明NPY4R依賴瘦素信號通路發(fā)揮體重調(diào)節(jié)功能[17]。盡管全身敲除不影響小鼠基礎(chǔ)攝食行為，但外源胰多肽可通過下丘腦弓狀核團NPY4R激活POMC神經(jīng)元從而抑制食欲[18]。全身敲除或與的雙敲除小鼠抵抗高脂誘導(dǎo)肥胖，并且抑制高瘦素血癥的發(fā)生[19]。上述研究提示NPY4R可能與NPY2R類似也通過脂肪細胞的受體信號通路參與飲食性肥胖的發(fā)生機制。鑒于既往研究依賴轉(zhuǎn)錄本水平研究脂肪組織的NPY受體信號通路，本研究建立了針對NPY、NPY1R、NPY2R與NPY4R的免疫熒光成像方法，明確NPY及其受體在脂肪組織的蛋白含量與分布。繼而用loxP-STOP-loxP條件性轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)建的條件性基因靜默小鼠，通過與脂肪細胞特異性的Adipoq-Cre工具小鼠雜交獲得脂肪細胞特異性回復(fù)表達小鼠，初步發(fā)現(xiàn)脂肪細胞促進高脂誘導(dǎo)的肥胖發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究動物實驗方案獲得陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理審查委員會批準。實驗小鼠飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系SPF級動物中心，適應(yīng) 12 h光照/12 h黑暗循環(huán)(8：10開燈，20：10分熄燈)1～2周，期間保證自由飲食和自由飲水。6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠來自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。在小鼠適應(yīng)1周后斷頸處死取腹股溝皮下脂肪(簡稱皮下脂肪)、腎周脂肪性腺脂肪、肩胛間棕色脂肪、主動脈周圍脂肪、腸系膜脂肪、性腺脂肪用于免疫熒光實驗。

基因的條件性靜默(loxP-STOP-loxP/+)小鼠采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在C57BL/6J小鼠受精卵的基因的第2號外顯編碼區(qū)起始密碼子ATG上游7～10堿基位置原位插入“l(fā)oxP-PGK-Neo-6*SV40 pA-loxP”(loxP-STOP-loxP)序列構(gòu)建(Cyagen Biosciences Inc，美國)。將基因的gRNA(TGGTAGGTGTGAGAAGATCCAGG)、Cas9 mRNA和loxP-STOP-loxP核酸序列的供體載體共注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，篩選獲得條件性回復(fù)表達的全身性基因靜默雜合子(loxP-STOP-loxP/+)C57BL/6J小鼠。

基因靜默雜合子小鼠(loxP-STOP-loxP/+)經(jīng)人工授精自交獲得純合子小鼠。通過F0：成熟脂肪細胞特異性表達的脂聯(lián)素啟動子驅(qū)動的Cre重組酶工具小鼠(B6；FVB-Tg(Adipoq-cre)1Evdr/J，Adipoq-Cre)[4,20,21]與條件性靜默純合子小鼠雜交，獲得子代F1：Adipoq-CreTg/+；loxP-STOP-loxP/lox-STOP-loxP(雄性6只，雌性6只)與同窩出生的loxP-STOP-loxP/lox-STOP-loxP對照小鼠(雄性7只，雌性6只)。雌性實驗小鼠用于檢測在脂肪細胞回復(fù)表達的DNA分析實驗。雄性實驗小鼠在12周齡開始稱量體重，15周齡開始喂養(yǎng)高脂飼料，每周稱量體重至31周齡。其中12周齡(喂食高脂前)、22周齡(高脂7周)和32周齡(高脂17周)分別死亡1只基因靜默純合子小鼠。在高脂進食12周與14周時開展葡萄糖耐受實驗；最后，高脂進食19周的34周齡小鼠禁食 6 h (12:00～18:00)，收集脂肪組織，并在速凍后儲存在–80℃冰箱中用于后續(xù)實驗。

1.2 實驗材料

Co60輻照實驗鼠生長繁殖飼料(貨號：1010083，江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)，高脂飼料(貨號：D12492，美國Research Diets公司)，蛋白酶K消化液(貨號：MK539480，美國Merck公司)，2×Taq Master Mix(貨號：P222，南京諾唯贊生物科技公司)，葡萄糖(貨號：G6172，上海麥克林生化科技公司)，OCT膠(貨號：4583，日本SAKURA公司)。

抗體：NPY (1:100，貨號：12833-1-AP，美國Proteintech公司)，NPY1R(1:100，貨號：bs-1070R，RRID:AB_10856532，北京博奧森生物技術(shù)公司)，NPY2R(1:100，貨號：PA5-77517，RRID:AB_2736253，美國Invitrogen公司)，NPY4R(1:150，貨號：PA5-77518，RRID:AB_2736254，美國Invitrogen公司)，Anti-rabbit IgG (H+L)-F(ab') 2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) (1:500，貨號：4412，RRID:AB_ 1904025，美國Cell Signaling Technology公司)。5%牛血清白蛋白封閉液(貨號：AR0004，武漢博士德生物工程公司)。

1.3 小鼠基因分型

將待鑒定的小鼠取一側(cè)性腺脂肪組織置于EP管中，每管添加蛋白酶K消化液200 μL，將組織在56℃孵育過夜，然后再98℃孵育15 min，使蛋白酶變性，采用5000 ×離心15 min，取上清液用于PCR(引物序列見表1)?；蚍中统绦颍?5℃變性30 s，60℃退火35 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次，最后72℃延伸20 min，4℃保溫，擴增產(chǎn)物用于DNA凝膠電泳鑒定。

1.4 葡萄糖耐量實驗

在9:00更換新墊料后禁食6 h，并測量禁食前初始體重。禁食6 h后，取小鼠尾血檢測空腹基礎(chǔ)血糖。以對照組平均體重計算葡萄糖注射量，每只實驗小鼠按照1.5 g/kg (12周高脂喂食)或1 g/kg (14周高脂喂食)腹腔注射10%葡萄糖溶液，并檢測注射葡萄糖后15、30、45、60、90、120 min血糖值(檢測血糖期間保持小鼠飲水)，檢測完后恢復(fù)小鼠進食。血糖數(shù)據(jù)使用曲線面積分析(area of the curve，AOC)：即曲線下面積(area under curve，AUC)減去起始葡萄糖基線以下的面積[22]。

表1 基因分型引物

F:正向引物；R：逆向引物；WT：野生型；Adp-Y4：脂肪細胞回復(fù)表達；Y4-KO：全身基因靜默。

1.5 免疫熒光成像

將脂肪組織浸泡在4℃的4%多聚甲醛中過夜，過夜后組織在新鮮PBS洗滌3次后，換新鮮PBS在4℃中過夜，取出組織浸泡在PBS-15%蔗糖溶液中4℃過夜。組織預(yù)處理后，用濾紙吸干組織表面水分，OCT膠包埋組織，脂肪在–45℃條件下進行切片，切片厚度30 μm。將含有切片組織的玻片放入預(yù)冷的50%乙醇中孵育30 min后，用免疫組化筆在組織切片周圍做一個疏水屏障；切片在PBS中孵育5 min，用新鮮的PBS重復(fù)二次；用1%牛血清白蛋白(BSA)在室溫中孵育1 h，阻斷非特異性抗體結(jié)合；用1%牛血清白蛋白(BSA)稀釋一抗，滴加一抗覆蓋組織切片，室溫孵育2 h；切片在PBS中孵育5 min，用新鮮的PBS重復(fù)二次；用1%牛血清白蛋白稀釋二抗，滴加二抗覆蓋組織切片，室溫孵育60 min；切片在PBS中孵育5 min，用新鮮的PBS重復(fù)二次；抗熒光淬滅劑封片，最后按300 ms曝光時間進行熒光成像(NI-U，日本Nikon公司)。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

免疫熒光數(shù)據(jù)使用Adobe Illustrator CS6作圖。計量資料以平均值±標準誤差(mean ± SEM)表示，使用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖，采用雙因素方差分析(2-way ANOVA)或非配對檢驗進行統(tǒng)計分析，< 0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪組織NPY及受體蛋白的免疫熒光成像分析

為了明確NPY受體信號通路在小鼠脂肪組織的表達與分布情況，本研究采用免疫熒光成像技術(shù)，觀察NPY及其受體1、2和4等蛋白在6個有代表性的小鼠脂肪組織的免疫熒光信號。這些脂肪組織包括3個褐色脂肪組織(肩胛間棕色脂肪inter-sca-pular brown adipose tissue、主動脈周圍脂肪peri- aortic fat和腎周脂肪peri-renal fat)、2個白色脂肪(腸系膜脂肪mesenteric fat和性腺脂肪perigonadal fat)和1個米色脂肪(皮下脂肪subcutaneous fat)。目前尚不具備可以用來做免疫熒光實驗的NPY5R受體，因此沒有檢測NPY5R蛋白。結(jié)果顯示NPY在肩胛間棕色脂肪與皮下脂肪的血管區(qū)域以點狀分布(圖 1)。NPY的點狀分布可能反映了神經(jīng)末梢的形態(tài)結(jié)構(gòu)，這與外周NPY來源于交感神經(jīng)末梢有關(guān)。繼而觀察到NPY1R在肩胛間棕色脂肪、主動脈周圍脂肪和性腺脂肪表達較強(圖2)。NPY1R在肩胛間棕色脂肪與主動脈周圍脂肪的信號較為彌散，但陰性對照(未孵育一抗組)的對應(yīng)組織區(qū)域沒有信號，表明這些較為彌散的信號與NPY1R抗體識別的肽段相關(guān)，不是背景信號。

研究繼而觀察識別PYY與NPY肽類信號分子的NPY2R蛋白在脂肪組織的分布。結(jié)果顯示NPY2R在肩胛間棕色脂肪與主動脈周圍脂肪表達量最高，其次是腸系膜脂肪與皮下脂肪，在性腺脂肪與腎周脂肪表達量最低(圖3)。NPY4R蛋白在肩胛間棕色脂肪表達量最高，其次是性腺脂肪、腸系膜脂肪和主動脈周圍脂肪，在皮下脂肪與腎周脂肪的表達量最低(圖4)。由此可以看出，NPY系統(tǒng)的各受體在脂肪組織的空間分布上具有解剖學(xué)區(qū)域特異性：NPY1R在性腺脂肪、肩胛間棕色脂肪和主動脈周圍脂肪較為富集，NPY2R在肩胛間棕色脂肪和主動脈周圍脂肪較為富集，NPY4R在肩胛間棕色脂肪與性腺脂肪較為富集。

2.2 脂肪細胞Npy4r基因回復(fù)表達小鼠模型構(gòu)建

為了明確脂肪細胞NPY4R在高脂誘導(dǎo)肥胖中的作用，研究采用在基因靜默小鼠實現(xiàn)脂肪細胞回復(fù)表達的技術(shù)策略，可以直接檢驗脂肪細胞NPY4R對飲食性肥胖作用的充分性。小鼠有2個外顯子，編碼區(qū)完全位于2號外顯子內(nèi)，因此通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠受精卵的基因的2號外顯子編碼區(qū)上游7～10堿基位置原位插入“l(fā)oxP-PGK-Neo-6*SV40 pA-loxP”(loxP-STOP-loxP)序列，攜帶loxP-STOP-loxP序列的純合小鼠將實現(xiàn)基因靜默，即Y4-KO (圖5A)。Y4-KO與脂肪細胞特異性表達的Adipoq-Cre工具鼠雜交[4,20]，獲得子代F1：Adipoq-CreTg/+；loxP-STOP-loxP/+，繼而F1與loxP-STOP-loxP/loxP-STOP-loxP純合小鼠雜交，獲得F2：Adipoq-CreTg/+；loxP-STOP-loxP/loxP-STOP-loxP(= 6)與loxP-STOP-loxP/loxP-STOP-loxP同窩對照小鼠(= 7)，分別標識為Adp-Y4與Y4-KO(圖5A)。

圖1 NPY在不同部位脂肪組織的免疫熒光圖

脂肪組織NPY的免疫熒光信號。EGFP標記顯示為綠色；DAPI染細胞核，顯示為藍色；曝光時間300 ms，標尺：100 μm。

圖2 NPY1R受體在不同部位的脂肪組織的免疫熒光圖

脂肪組織NPY1R的免疫熒光信號。EGFP標記顯示為綠色；DAPI染細胞核，顯示為藍色；曝光時間300 ms，標尺：100 μm。

研究采用基因組DNA的loxP剪接事件來明確Y4-KO與Adp-Y4是否實現(xiàn)。研究組提取了Y4-KO和Adp-Y4以及非同窩野生型雌鼠皮下脂肪組織的基因組DNA，進行PCR基因鑒定(= 6)。如圖5A所示，Y4-KO小鼠在258 bp出現(xiàn)攜帶loxP-STOP- loxP序列的特征條帶；Adp-Y4小鼠在258 bp和165 bp均出現(xiàn)了特征條帶，165 bp條帶表明Adp-Y4小鼠脂肪組織發(fā)生了loxP剪接，實現(xiàn)脂肪細胞回復(fù)表達Y4；野生型WT組僅在131 bp出現(xiàn)了特征條帶，表明其不攜帶loxP序列，符合預(yù)期。

此外，為了進一步明確成熟脂肪細胞的NPY4R蛋白表達情況，本研究設(shè)置了三組，即Y4-KO、Adp-Y4小鼠和WT小鼠，檢測NPY4R在肩胛間棕色脂肪和性腺脂肪的免疫熒光信號水平及其分布情況。結(jié)果表明，Y4-KO小鼠的棕色脂肪(圖5B)和性腺脂肪(圖5C)的成熟脂肪細胞NPY4R的熒光信號極為微弱，而Adp-Y4小鼠和WT小鼠在上述脂肪組織的成熟脂肪細胞具有相當強度的NPY4R熒光信號。上述結(jié)果表明，Adp-Y4小鼠實現(xiàn)脂肪細胞特異的回復(fù)性表達。

圖3 NPY2R受體在不同部位的脂肪組織的免疫熒光圖

脂肪組織NPY2R的免疫熒光信號。EGFP標記顯示為綠色；DAPI 染細胞核，顯示為藍色；曝光時間300 ms，標尺：100 μm。

2.3 脂肪細胞Npy4r促進高脂誘導(dǎo)肥胖

為了初步探明Adp-Y4對體重穩(wěn)態(tài)與飲食性肥胖的影響，本研究追蹤Y4-KO與Adp-Y4小鼠在高脂喂食下的體重變化規(guī)律。通過對15周齡小鼠喂食17周高脂飼料，同時每周測量體重，Adp-Y4顯著增加體重(圖6A)與體重增量(圖6B)(2-way ANOVA，體重：< 0.0001，體重增量：< 0.0001)。飲食性肥胖伴隨糖耐量受損的發(fā)生。研究開展了兩次葡萄糖耐受實驗。在高脂喂食12周后，用1.5 g/kg劑量進行葡萄糖腹腔注射，采集小鼠尾靜脈血檢測血糖；發(fā)現(xiàn)近一半的小鼠在某些時間點的血糖值超出量程。休息2周即在高脂進食14周后，用較低的1 g/kg劑量行腹腔注射葡萄糖，檢測尾靜脈血糖；結(jié)果表明Adp-Y4與Y4-KO不具有統(tǒng)計學(xué)意義上顯著的差異，但提示一種趨勢，即Adp-Y4較Y4-KO小鼠表現(xiàn)出更大的糖耐量受損(圖6C)。

圖4 NPY4R受體在不同部位的脂肪組織的免疫熒光圖

脂肪組織NPY4R的免疫熒光信號。EGFP標記顯示為綠色；DAPI染細胞核，顯示為藍色；曝光時間300 ms，標尺：100 μm。

3 討論

本研究通過免疫熒光成像分析，首次揭示NPY及其外周主要受體在脂肪組織的蛋白表達水平與分布。NPY在肩胛間棕色脂肪和皮下脂肪的圍繞血管區(qū)域以點狀形式表達，這可能與NPY來自血管附近的神經(jīng)末梢釋放有關(guān)。NPY系統(tǒng)的各受體在脂肪組織的空間分布上具有明顯的不同：NPY1R在性腺脂肪、肩胛間棕色脂肪和主動脈周圍脂肪較為富集，NPY2R在棕色脂肪較為富集，NPY4R在肩胛間棕色脂肪與性腺脂肪較為富集。既往研究表明外周NPY1R與NPY2R分別通過抑制脂肪組織的能量代謝或血管與炎癥微環(huán)境重構(gòu)促進飲食性肥胖[13～15]。本研究免疫熒光成像實驗的結(jié)果在支持既往研究的基礎(chǔ)上，提示肩胛間棕色脂肪細胞與主動脈脂肪細胞可能是NPY1R和NPY2R信號通路促進飲食性肥胖的重要靶細胞。本研究免疫熒光實驗使用的抗體在免疫熒光、免疫組化和免疫印跡實驗得到較多應(yīng)用，并且除NPY抗體都具有研究資源識別碼(research resource identification code，RRID)，是目前檢測NPY受體信號通路蛋白的主流試劑。免疫熒光實驗盡管簡潔直觀，但屬于定性或半定量實驗，對這些蛋白受體的精確定量方法仍然有待于繼續(xù)研究與開發(fā)。

圖5 脂肪細胞Npy4r基因回復(fù)表達小鼠的構(gòu)建

A：左圖為Y4-KO小鼠以及脂肪細胞回復(fù)表達小鼠Adp-Y4構(gòu)建原理；右圖為PCR分析小鼠皮下脂肪組織DNA鑒定Y4-KO小鼠(Y4-KO，258 bp)、脂肪細胞特異性突變小鼠未發(fā)生Cre-loxP位點剪接的細胞(Y4-KO，258 bp)和發(fā)生Cre-loxP位點剪接的脂肪細胞(Adp-Y4，165 bp)、野生型小鼠(非同窩小鼠，Wild-type，WT，131 bp)。B和C：Y4-KO、Adp-Y4和WT小鼠的脂肪組織NPY4R免疫熒光圖。肩胛間棕色脂肪(B)和性腺脂肪(C)，WT小鼠為非高脂喂養(yǎng)的非同窩小鼠，EGFP標記顯示為綠色；DAPI 染細胞核，顯示為藍色；曝光時間200 ms，標尺：100 μm。

NPY1R與NPY2R是外周組織的主要NPY受體[12]，這兩種受體蛋白在脂肪組織的差異化表達為NPY系統(tǒng)多樣化復(fù)雜的時空調(diào)節(jié)機制提供了重要的分子基礎(chǔ)。最近靶向外周NPY1R的研究提示棕色脂肪和米色脂肪的適應(yīng)性產(chǎn)熱功能是阻斷外周NPY1R受體信號實現(xiàn)減重的主要機制[13]。值得一提的是白色脂肪的甘油三脂裂解是棕色脂肪適應(yīng)性產(chǎn)熱的直接游離脂肪酸來源，而棕色脂肪本身的甘油三脂裂解不是[23,24]。結(jié)合本研究的數(shù)據(jù)分析：白色脂肪細胞、肩胛間棕色脂肪細胞與主動脈周圍脂肪細胞的NPY1R可能是外周NPY1R抑制劑減重的主要靶點，尤其是相比于其他部位的棕色或米色脂肪細胞的NPY1R。外周NPY2R的功能有抑制能量代謝[15]與促進脂肪組織重構(gòu)[14]兩種觀點。本研究的數(shù)據(jù)顯示，NPY2R蛋白在經(jīng)典的肩胛間棕色脂肪和新近發(fā)現(xiàn)的主動脈棕色脂肪[1,25]都大量表達，提示棕色脂肪細胞的NPY2R可能比已經(jīng)報道的白色脂肪細胞的NPY2R發(fā)揮更重要的功能，因而在肯定兩種觀點的同時，支持能量代謝的調(diào)節(jié)是脂肪細胞NPY2R的主要功能。

圖6 高脂喂養(yǎng)小鼠的體重以及葡萄糖耐量檢測

A：小鼠體重-時間曲線(Y4-KO:= 6；Adp-Y4:= 6)；B：小鼠體重增量-時間曲線；C：葡萄糖-時間曲線(Y4-KO:= 4；Adp-Y4:= 6)。曲線面積(AOC)分析結(jié)果在右側(cè)：測量曲線下面積(AUC)減去起始葡萄糖基線以下的面積。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差。統(tǒng)計方法：雙因素方差分析或非配對檢驗(圖C右圖)。< 0.05時差異顯著，****< 0.0001。

NPY4R受體的外周調(diào)節(jié)功能研究較少，但與脂肪組織功能有一定聯(lián)系。例如的全身敲除抑制小鼠的飲食性肥胖[19]。通過卵子特異表達的Cre驅(qū)動的條件性敲除實現(xiàn)的全身敲除降低了體重與脂肪含量，顯著改善了生殖功能，不影響甚至增加瘦素基因()突變引起的肥胖[17]。本研究通過將最近在研究外周生物鐘功能中采用的條件性回復(fù)表達技術(shù)[26,27]應(yīng)用在脂肪細胞研究中，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞促進飲食性肥胖。既往研究認為白色脂肪表達基因[12]，而本研究發(fā)現(xiàn)NPY4R受體蛋白除了在白色脂肪，還在棕色脂肪有較高表達，提示棕色脂肪細胞的NPY4R可能具有代謝調(diào)節(jié)功能。NPY4R作為Class A/1 G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，通過結(jié)合Gi蛋白，抑制cAMP-PKA信號通路活性[28]。脂肪細胞Gi通過抑制cAMP-PKA信號通路活性，抑制甘油三酯分解，提高胰島素敏感性[29]。脂肪細胞Gi的敲除小鼠和化學(xué)小分子激活小鼠并沒有體重表型的差異，不過體重表型有待在長時程的飲食性肥胖模型中進一步明確。因此，NPY4R可能通過Gi抑制cAMP-PKA信號，促進脂肪積累，但不排除存在其他信號通路介導(dǎo)脂肪細胞NPY4R發(fā)揮的促進飲食性肥胖的作用，甚至后者是主要的脂肪細胞NPY4R下游通路。

本研究采用一種新的基因改造小鼠模型研究脂肪細胞基因功能。通常采用脂肪細胞特異性敲除或者過表達目的基因研究某基因的生理或病理生理學(xué)功能?；蚯贸Ｐ湍軌驒z驗必要性，過表達模型檢驗充分性。然而過表達模型極可能因為基因表達水平遠超出生理范圍，而引起系統(tǒng)性誤差。化學(xué)遺傳學(xué)或光遺傳學(xué)方法提供一種替代過表達模型的方案。相比于這些替代模型，通過在目的基因插入條件性轉(zhuǎn)錄終止序列(loxP-STOP-loxP)，并在脂肪特異性Adipoq-Cre作用下，實現(xiàn)基因靜默小鼠的脂肪細胞特異性回復(fù)表達目的基因。該策略運用Cre工具小鼠激活靶細胞Cre活性，利用目的基因的內(nèi)源性啟動子實現(xiàn)生理范圍的回復(fù)表達，并維持其他細胞目的基因的靜默狀態(tài)。這樣的脂肪細胞回復(fù)性表達動物模型實現(xiàn)與基因敲除動物模型的完全互補，為檢驗?zāi)康幕蚬δ艿某浞中蕴峁┝烁玫倪x擇。然而本研究也存在不足，由于生物學(xué)重復(fù)數(shù)隨著Y4-KO小鼠的意外死亡減少，本研究觀察到糖耐量的差異趨勢，但沒有得出有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)論。這可能與本研究開始高脂喂養(yǎng)的小鼠周齡較大有關(guān)(15周齡，相比于通常的6周齡)。深入的研究需要設(shè)置野生型對照或全身回復(fù)表達的實驗組作為嚴謹?shù)馁|(zhì)量控制組，并根據(jù)統(tǒng)計效能分析結(jié)果增加實驗小鼠數(shù)量(≥12)。

總之，本研究揭示了NPY及其外周受體在脂肪組織的蛋白水平與分布，構(gòu)建了脂肪細胞回復(fù)表達的全身基因靜默小鼠模型，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞促進飲食性肥胖。組織或細胞特異性回復(fù)表達已靜默的基因?qū)榇x生物學(xué)研究提供新的研究方法和思路。

感謝澳大利亞Garvan醫(yī)學(xué)研究所石雁川教授的批評與指導(dǎo)；感謝本科室碩士研究生包鑫余同學(xué)對原始數(shù)據(jù)與作圖數(shù)據(jù)的完整性與一致性的核查。

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Adipocyte reconstitution ofgene insilenced mice promotes diet-induced obesity

Lan Wang, Fan Zeng, Rongfeng Huang, Shu Lin, Zhihui Zhang, Min-Dian Li

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Neural regulation of adipose tissue is crucial in the homeostasis of energy metabolism. Adipose tissue neuropeptide Y (NPY) and its receptors contribute to the development of diet-induced obesity. NPY1R and NPY2R are major receptors for NPY in peripheral tissues including the adipose tissue. NPY receptor 4 () gene is expressed in adipose tissue. However, it is unknown whetheris involved in the development of diet-induced obesity. Here, we established an immunofluorescence microscopy technique and generated an adipocyte-reconstitutedgene knockout mouse. Among six adipose depots, we found that NPY is highly expressed around the vasculature in a dot-like fashion in interscapular brown fat and subcutaneous fat, and NPY receptors are expressed in a depot-specific manner. NPY1R is highly expressed in epidydimal fat, interscapular and peri-aortic brown fat, NPY2R in both interscapular and peri-aortic brown fat, and NPY4R in both brown fat and epidydimal fat. Next, we showed that adipocyte-reconstituted expression ofpromoted diet-induced obesity in mice (< 0.0001). Overall, this study defines the abundance and distribution of NPY and its receptors 1, 2, and 4 in mouse adipose depots, and demonstrates in an adipocyte-reconstituted gene knockout model that adipocyteis sufficient to promote diet-induced obesity.

Conditionally reconstituted gene knockout; loxP-STOP-loxP; adipocyte; adipose tissue; obesity

2022-10-13;

2023-01-30;

2023-02-03

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(編號：81900776)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81900776)]

王瀾，碩士，研究實習(xí)員，研究方向：代謝生物鐘與心血管疾病。E-mail: 770944509@qq.com

李旻典，博士，研究員，科室副主任，研究方向：代謝生物鐘與心血管疾病。E-mail: mindianli@tmmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-302

(責(zé)任編委: 孟卓賢)