吳仲勝，高譽(yù)，杜勇濤，黨頌，何康敏

實(shí)驗(yàn)操作指南

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)源蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)操作

吳仲勝1,2，高譽(yù)1,2，杜勇濤1,2，黨頌1，何康敏1,2

1. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，分子發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

CRISPR-Cas9是目前廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)，可對(duì)目的基因進(jìn)行高效精準(zhǔn)編輯，快速實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引導(dǎo)下對(duì)靶序列進(jìn)行剪切并造成DNA雙鏈斷裂，在與剪切位點(diǎn)兩端同源的DNA模板序列存在時(shí)，可通過同源重組修復(fù)方式引入外源序列，實(shí)現(xiàn)熒光蛋白或其他標(biāo)簽在基因組上的精準(zhǔn)敲入，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)簽的融合標(biāo)記。通過基因編輯技術(shù)對(duì)內(nèi)源目的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，可避免由于過表達(dá)造成蛋白質(zhì)定位、動(dòng)力學(xué)或功能等的潛在影響，可顯著提升細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。本文重點(diǎn)介紹了利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行熒光蛋白或自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽標(biāo)記的方法與操作流程，為構(gòu)建內(nèi)源蛋白熒光標(biāo)記的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系提供參考。

CRISPR-Cas9基因編輯；活細(xì)胞；內(nèi)源蛋白；熒光蛋白；自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽

蛋白質(zhì)的定位與功能密切相關(guān)。通過對(duì)各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)特別是活細(xì)胞內(nèi)的定位、動(dòng)力學(xué)、分子間互作等進(jìn)行精準(zhǔn)表征和分析，進(jìn)而研究蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制等具有重要意義。目前已經(jīng)發(fā)展了多種在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，包括熒光蛋白(fluorescent protein)、自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽(self-labeling protein tag)、熒光共價(jià)標(biāo)記的配體或多肽、非天然氨基酸標(biāo)記等[1,2]。熒光蛋白標(biāo)記是最常用的可遺傳編碼的蛋白質(zhì)標(biāo)記方法，目前已經(jīng)發(fā)展了多種熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性質(zhì)優(yōu)異的熒光蛋白，其熒光發(fā)射光譜實(shí)現(xiàn)了從藍(lán)到紅外光譜的覆蓋，可基本滿足激光共聚焦顯微鏡成像、單分子成像和超分辨率成像等不同需求和成像目的[3,4]。HaloTag等自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽的標(biāo)記，是另外一種廣泛應(yīng)用的可遺傳編碼的活細(xì)胞蛋白標(biāo)記方法，通過與相應(yīng)熒光染料標(biāo)記的配體進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白進(jìn)行特異熒光標(biāo)記[5,6]。對(duì)目的蛋白進(jìn)行熒光蛋白或自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽的融合表達(dá)，可通過質(zhì)粒瞬時(shí)外源過表達(dá)、隨機(jī)插入基因組的穩(wěn)定過表達(dá)或者基因編輯精準(zhǔn)插入目的基因等方式實(shí)現(xiàn)。CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯體系，通過對(duì)目的基因進(jìn)行精準(zhǔn)剪切，在含有熒光蛋白或自標(biāo)記標(biāo)簽蛋白cDNA序列的修復(fù)模板的介導(dǎo)下，采用同源重組的方式在目的基因上精準(zhǔn)敲入(knock-in)熒光標(biāo)簽的DNA序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源目的蛋白的熒光標(biāo)記[7]。通過基因編輯技術(shù)對(duì)內(nèi)源蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，可有效避免蛋白質(zhì)過表達(dá)可能造成目的蛋白的定位或功能的異常。此外，基因編輯細(xì)胞具有更好的均一性和穩(wěn)定性，有效提升了細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，也更有利于對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。目前已經(jīng)發(fā)展了多種不同的基因編輯方法和策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的熒光蛋白或自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽的標(biāo)記[8～10]，本文重點(diǎn)闡述了利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特定目的蛋白進(jìn)行熒光蛋白或自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽標(biāo)記的方法與操作流程。

1 CRISPR-Cas9基因編輯knock-in實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 熒光標(biāo)簽的選擇

目前已經(jīng)發(fā)展了多種熒光蛋白及變體，包括自身發(fā)光的熒光蛋白如EGFP、拆分熒光蛋白(split fluorescent protein)[11,12]、二聚化依賴熒光蛋白[13]和光激活/光轉(zhuǎn)化熒光蛋白[14]等。常用的自發(fā)光綠色熒光蛋白有EGFP[15]、mEGFP[16]和mNeonGreen[17]，常用的紅色自發(fā)光熒光蛋白有mCherry[18]、TagRFP[19]以及新近發(fā)展的mScarlet/mScarlet-H/ mScarlet-I[20]以及FusionRed-MQV等[21]。其中mNeonGreen、mScarlet-I和FusionRed-MQV等具有較高的量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度且均為單體，適合于活細(xì)胞成像和追蹤。FPbase網(wǎng)站(https://www.fpbase. org/)收錄了目前發(fā)表的各種熒光蛋白的詳細(xì)信息，可對(duì)各種熒光蛋白的序列、光學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)等進(jìn)行查詢和比較。

拆分熒光蛋白如拆分GFP (split GFP)是將GFP拆分為GFP11(β-折疊鏈11，殘基215～230)和GFP1-10(β-折疊鏈1～10，殘基1～214)兩個(gè)片段，其中GFP11用柔性linker連接到目的蛋白上，GFP1-10單獨(dú)表達(dá)。GFP11和GFP1-10單獨(dú)存在時(shí)均不發(fā)光，當(dāng)共存時(shí)會(huì)自組裝成為完整可發(fā)光的GFP分子[11]。該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是GFP11片段較小，降低了對(duì)目的蛋白的影響，此外也減少了用于同源重組的模板的長度，使得高通量熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)源蛋白成為可能[22]。該系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是降低了背景熒光。

自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽如HaloTag[23]、SNAP-tag[24,25]和CLIP-tag[26]，是近些年使用逐漸廣泛的一類熒光標(biāo)記工具。其自身不發(fā)光，但通過與熒光染料標(biāo)記的配體進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)，可對(duì)目的蛋白進(jìn)行熒光染料的標(biāo)記。新近發(fā)展的Janelia Fluor系列熒光染料，具有亮度高、光穩(wěn)定性高和可穿過細(xì)胞膜等優(yōu)異性質(zhì)，適合用于活細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)標(biāo)簽蛋白的熒光成像和動(dòng)態(tài)追蹤，也十分適合于活細(xì)胞單分子成像和追蹤[27]。此外，通過選擇結(jié)合不同激發(fā)/發(fā)射波長熒光染料的配體，可對(duì)目的蛋白進(jìn)行不同顏色熒光的標(biāo)記，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多色活細(xì)胞成像的目的。

1.2 熒光標(biāo)簽插入位置以及l(fā)inker的選擇

熒光標(biāo)簽插入目的蛋白的位置，可位于其N端、C端或中間，具體由該蛋白質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)和功能等性質(zhì)決定。通常情況下，通過調(diào)研已發(fā)表文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫中蛋白結(jié)構(gòu)等，或者在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上進(jìn)行多種插入位點(diǎn)嘗試，以確保熒光標(biāo)簽的插入不會(huì)對(duì)目的蛋白的定位、動(dòng)力學(xué)和功能造成影響。此外，為了保證目的蛋白和熒光標(biāo)簽蛋白的正確折疊以及減少熒光標(biāo)簽對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，通常會(huì)在目的蛋白和熒光標(biāo)簽之間插入一段linker蛋白序列，如常用的富含甘氨酸的柔性linker如(GGGGS)3[28]和(GGS)n[29]。在本實(shí)驗(yàn)操作流程中選取(GGS)3作為融合蛋白的linker。

1.3 CRISPR-Cas9體系的選擇

在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，Cas9 (SpCas9)蛋白在gRNA (guide RNA)的引導(dǎo)下完成對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。Cas9蛋白行使功能需crRNA (crispr RNA)與tracrRNA (trans-activating crRNA)共同參與[30]。通過將crRNA和tracrRNA融合形成sgRNA (single guide RNA)，而后在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9酶定位于特定DNA序列上，進(jìn)行DNA雙鏈切割和對(duì)目的基因進(jìn)行編輯[7]（圖1）。在利用CRISPR-Cas9體系對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行knock-in基因編輯時(shí)，其體系成分具有多種選擇，但最終目的是將Cas9核酸酶(可為質(zhì)粒、mRNA、重組蛋白、或者已經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞系等)、sgRNA (可為質(zhì)?；虬瑂gRNA的DNA片段等)、同源重組修復(fù)模板(可為質(zhì)粒、單鏈DNA或者雙鏈DNA等)遞送進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[31]。

在本實(shí)驗(yàn)流程中，將以溶酶體的標(biāo)志分子LAMP1蛋白為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和流程介紹。本文分別選擇了紅色熒光蛋白mScarlet-I和HaloTag為熒光標(biāo)簽，選擇的linker為(GGS)3。編碼mScarlet-I和HaloTag的cDNA長度分別為696 bp和891 bp，將以pUC19 (Addgene plasmid #50005)為載體構(gòu)建同源重組修復(fù)模板(以下稱之為供體質(zhì)粒)[32,33]。考慮到實(shí)驗(yàn)的簡捷和穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)流程利用pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene plasmid #62988)或pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid #48138)質(zhì)粒遞送Cas9和sgRNA。

圖1 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行熒光標(biāo)簽基因敲入的示意圖

1.4 同源重組供體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)

供體質(zhì)粒對(duì)同源重組的效率具有重要的影響，在實(shí)驗(yàn)過程中需要注意以下幾點(diǎn)：

1.4.1 目的基因的基因組DNA (genomic DNA, gDNA)和CDS (Coding DNA Sequence)序列的查找：根據(jù)目的基因種屬、基因名稱、轉(zhuǎn)錄本(transcript variant)等信息，在Ensembl、NCBI或者其他網(wǎng)站進(jìn)行查詢。

1.4.2 插入位點(diǎn)的確定：在確定好熒光標(biāo)簽插入目的蛋白的位置后，還應(yīng)注意DNA雙鏈斷裂處與插入位點(diǎn)之間的距離不應(yīng)超過100 bp，理想的距離是在10 bp以內(nèi)，這樣可以最大限度地提高同源重組修復(fù)的效率[34]。

1.4.3 供體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)：供體質(zhì)粒內(nèi)包含了三段拼接的DNA序列，分別是(1)目的基因插入位點(diǎn)上游的DNA序列、(2)插入標(biāo)簽的DNA序列，(3)目的基因插入位點(diǎn)下游的DNA序列。若插入的是熒光蛋白或自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽，通常選取插入位點(diǎn)上下游長度約為600～800 bp作為兩側(cè)的同源臂序列。以靶細(xì)胞的基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增上下游同源臂的序列，亦可直接合成。

在本實(shí)驗(yàn)流程中，通過查閱文獻(xiàn)以及基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的測(cè)試結(jié)果，將熒光標(biāo)簽插入到目的基因的C端。由于熒光蛋白mScarlet-I和自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽HaloTag的基因片段較長，供體質(zhì)粒包含的同源臂為的gDNA終止密碼子上下游各約800 bp。同源修復(fù)的供體質(zhì)粒設(shè)計(jì)如圖2A和2B所示。

1.5 sgRNA序列設(shè)計(jì)

sgRNA在CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)揮著引導(dǎo)作用，對(duì)knock-in的特異性和效率至關(guān)重要?？山柚癈RISPOR”[35]和“CRISPick”[36]等網(wǎng)站設(shè)計(jì)sgRNA，選取特異性和效率俱佳的序列。sgRNA的靶向序列可以位于正義鏈，也可以位于反義鏈，但sgRNA的靶向序列應(yīng)避免4個(gè)以上的T結(jié)尾，以防止形成終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)，且GC含量最佳為40%～60%。為了盡可能提高實(shí)驗(yàn)效率和減少脫靶效應(yīng)，可挑選切割效率高、特異性好的兩條或以上的sgRNA同時(shí)測(cè)試和開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)將mScarlet-I或HaloTag序列插入至LAMP1基因C端的設(shè)計(jì)

A: 基因編輯表達(dá)LAMP1-mScarlet-I的序列設(shè)計(jì)；B: 基因編輯表達(dá)LAMP1-Halo的序列設(shè)計(jì)；C: pUC19載體的多克隆位點(diǎn)。

2 試劑與材料

實(shí)驗(yàn)相關(guān)的主要試劑與耗材信息詳見表1。

3 基因編輯相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建

3.1 供體質(zhì)粒的構(gòu)建

3.1.1 gDNA的提?。簩⑴囵B(yǎng)皿中的細(xì)胞消化并收集后，使用TIANamp Genomic DNA試劑盒提取gDNA，保存于4℃或–20℃以備后續(xù)使用。

3.1.2 線性化質(zhì)粒的制備：選擇合適的限制性內(nèi)切酶如I在模板質(zhì)粒pUC19的多克隆位點(diǎn)(圖2C)處進(jìn)行酶切，膠回收后得到線性化的質(zhì)粒。

3.1.3 三段DNA序列的制備：熒光蛋白的編碼序列以已含有該序列的質(zhì)粒為模板，上下游同源臂的堿基序列可直接合成，也可以3.1.1步驟制備的gDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增和膠回收處理后得到上下游同源臂的DNA片段。需要注意的是，這三段DNA序列彼此連接的區(qū)域以及與質(zhì)粒連接的區(qū)域存在一個(gè)片段大小為18～30 bp的同源臂，該片段是通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后添加的。PCR引物的Tm值以56～65℃為宜。

表1 試劑與耗材信息

3.1.4 線性化質(zhì)粒和DNA片段的連接：利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit將3.1.3制備的DNA片段和線性化的pUC19載體進(jìn)行同源重組，得到包含熒光蛋白的供體質(zhì)粒。建議連接時(shí)線性化載體與三個(gè)DNA片段加入量的摩爾比≥1∶3，三個(gè)DNA片段間的摩爾比為1∶1。分子質(zhì)量摩爾數(shù)的轉(zhuǎn)換可借助在線工具NEBiocalculator (https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation)進(jìn)行測(cè)算。

3.1.5 轉(zhuǎn)化和克隆篩選：按常規(guī)方法對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，37℃培養(yǎng)12～14 h后，挑取單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)測(cè)序鑒定后獲得插入序列正確的供體質(zhì)粒。

3.2 sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)流程采用的是美國麻省理工學(xué)院張峰實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的pSpCas9(BB)-2A-Puro或pSpCas9(BB)- 2A-GFP載體，引物設(shè)計(jì)和詳細(xì)操作步驟可參考Target Sequence Cloning Protocol (https://media.addgene.org/data/plasmids/62/62988/62988-attachment_KsK1asO9w4owD8K6wp8.pdf)。

3.2.1 線性載體的制備：用限制性核酸內(nèi)切酶將pSpCas9(BB)-2A-Puro或pSpCas9(BB)-2A-GFP質(zhì)粒進(jìn)行酶切與去磷酸化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和膠回收后得到線性化的質(zhì)粒。

3.2.2 sgRNA寡核苷酸雙鏈的制備：根據(jù)選擇的sgRNA，在引物合成時(shí)，正向寡核苷酸的5′端加上粘性末端CACCG，同時(shí)在反向寡核苷酸的3′端加上堿基C和5′端加上粘性末端CAAA。引物合成后，上下游引物在T4多聚核苷酸激酶的作用下后經(jīng)梯度降溫后得到sgRNA寡核苷酸雙鏈。

3.2.3 sgRNA寡核苷酸雙鏈和線性化質(zhì)粒的連接：將得到的sgRNA寡核苷酸雙鏈加入3.2.1步驟制備的線性化質(zhì)粒中，在連接酶的作用下得到包含sgRNA的重組質(zhì)粒。按常規(guī)方法對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)測(cè)序鑒定后得到含有正確sgRNA序列的質(zhì)粒。

3.3 質(zhì)粒提取

建議使用可有效去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取供體質(zhì)粒和sgRNA質(zhì)粒，如利用NucleoBond Xtra Midi Plus試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分選和鑒定

在本實(shí)驗(yàn)流程中，使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)內(nèi)源蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)主要包括以下三個(gè)步驟：(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、(2)陽性細(xì)胞分選和富集、(3)單克隆細(xì)胞的鑒定(圖3)。

圖3 基因編輯細(xì)胞系構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)流程

4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞復(fù)蘇傳代一次后，轉(zhuǎn)染前16～24 h將細(xì)胞種在6孔培養(yǎng)板中，以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為70%～80%為宜。按照Lipofectamine? 3000試劑說明書，加入適量供體質(zhì)粒和sgRNA質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染(每孔推薦質(zhì)粒各600～800 ng)。8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后傳代至T75培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

4.2 細(xì)胞分選和富集

4.2.1 基因編輯陽性細(xì)胞的篩選方式：通常使用熒光(如熒光蛋白和熒光標(biāo)記后的自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽)或利用嘌呤霉素(puromycin)等藥物等對(duì)基因編輯的陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選和富集。若使用的供體質(zhì)粒帶有熒光蛋白或自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽，則在轉(zhuǎn)染后5～7天，利用流式細(xì)胞儀分選并富集帶有熒光的陽性細(xì)胞；若供體質(zhì)粒不攜帶熒光標(biāo)簽，但sgRNA質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)簽時(shí)，則在轉(zhuǎn)染24 h后，利用流式細(xì)胞儀分選并富集帶有熒光的陽性細(xì)胞。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)流程中構(gòu)建的基因編輯細(xì)胞系，其供體質(zhì)粒包含有紅色熒光蛋白mScarlet-I或者HaloTag，因此采用流式細(xì)胞儀對(duì)表達(dá)了mScarlet-I或者經(jīng)熒光標(biāo)記HaloTag配體染色后的細(xì)胞進(jìn)行富集。

4.2.2 細(xì)胞分選樣品準(zhǔn)備：將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)了5～7天的細(xì)胞進(jìn)行消化并離心收集，而后加入適量無酚紅的基礎(chǔ)培養(yǎng)基如a-MEM進(jìn)行重懸，經(jīng)過45 μm孔徑的細(xì)胞篩過濾后(去除細(xì)胞團(tuán))收集于流式管中。對(duì)于轉(zhuǎn)染了LAMP1-HaloTag供體質(zhì)粒的細(xì)胞，則需要在胰酶消化前進(jìn)行染色。例如可使用Janelia Fluor 549 HaloTag配體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行10～20 min染色(終濃度10～20 nmol/L)，使用PBS洗3遍后，再對(duì)其進(jìn)行消化并離心收集等上述步驟。

4.2.3 陽性細(xì)胞分選和富集: 在利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行陽性細(xì)胞分選時(shí)，首先利用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)置熒光陰性的對(duì)照區(qū)域，以此為基礎(chǔ)判斷熒光信號(hào)陽性區(qū)域。根據(jù)目的蛋白的不同，首次經(jīng)過流式細(xì)胞儀篩選的基因編輯細(xì)胞系，陽性率約為0.5%～5%左右，每次收集的陽性細(xì)胞數(shù)量可在20,000～50,000左右，隨后將收集于流式管中的陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)移到48孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到95%～100%后傳代至6孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

注意：在傳代過程中可將少許細(xì)胞接種在成像皿中，進(jìn)行首次成像鑒定，判斷基因編輯細(xì)胞的陽性率以及目的蛋白的表達(dá)和分布是否正確。若陽性率低于10%，可對(duì)陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行再次的分選富集；若陽性率較高且目的蛋白的表達(dá)和分布正確，可將單細(xì)胞分選至96孔板進(jìn)行培養(yǎng)；若首次成像鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)和定位異常，則停止分選并調(diào)整實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

4.2.4 單克隆細(xì)胞分選：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可選擇構(gòu)建單克隆細(xì)胞，也可通過多次分選獲得高陽性率的細(xì)胞群。單克隆細(xì)胞系具有單一和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，而對(duì)于某些特殊的不適合單克隆生長的細(xì)胞系，可通過分選收集陽性細(xì)胞群。在本實(shí)驗(yàn)流程介紹中，希望獲得基因編輯單克隆細(xì)胞系，因此對(duì)熒光標(biāo)記的LAMP1細(xì)胞系進(jìn)行了單克隆分選。在分選時(shí)，流式細(xì)胞儀中mScarlet-I陽性細(xì)胞的信號(hào)區(qū)域分為高、中和低信號(hào)區(qū)域，分別代表了mScarlet-I純和敲入、雜合敲入以及未敲入的細(xì)胞群。為獲得mScarlet-I純和敲入的細(xì)胞系，將高信號(hào)區(qū)的陽性細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀的單細(xì)胞分選方式分選至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)(圖4)。

圖4 利用流式細(xì)胞儀分選富集基因編輯表達(dá)LAMP1-mScarlet-I的細(xì)胞

5 單克隆細(xì)胞系的鑒定

5.1 單克隆細(xì)胞的初步篩選

分選在96孔板中的單克隆細(xì)胞，經(jīng)過2～3周的培養(yǎng)后，在普通倒置顯微鏡的4倍物鏡下可看到明顯的細(xì)胞團(tuán)。選擇生長面積已經(jīng)占據(jù)孔面積1/3及以上的單個(gè)細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)胰酶消化和培養(yǎng)基中和后，對(duì)每個(gè)孔中的細(xì)胞進(jìn)行吹打混勻并將其中1/2至2/3細(xì)胞傳代至48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，其余細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中相應(yīng)位置，離心(2000×, 室溫10 min)后甩去液體，并倒扣于吸水紙上5 s以除去殘留液體，隨后每孔中加入10 μL QuickExtract DNA提取試劑并上下吹打30次重懸細(xì)胞，蓋上膠膜后置于PCR儀中進(jìn)行細(xì)胞裂解和gDNA獲取，反應(yīng)結(jié)束后將gDNA置于4 ℃或者–20 ℃長期保存。

5.2 PCR鑒定純合和雜合單克隆細(xì)胞系

5.2.1 基因型鑒定引物設(shè)計(jì)：本流程示例中使用的人乳腺癌細(xì)胞系SUM159為二倍體細(xì)胞，因此對(duì)目的基因的熒光標(biāo)簽敲入會(huì)得到純合和雜合兩種類型。由于本示例中是將mScarlet-I插入到目的基因的C端，因此在目的基因的gDNA的終止密碼子處上下游各選取400～500 bp左右的序列(不包含熒光蛋白)，將這段約800～1000 bp的gDNA序列復(fù)制并粘貼至NCBI-Blast-Primer-blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，按照設(shè)置(PCR片段大?。?50～700 bp；Database：Refseg representative genomes)并生成引物，挑選其中特異性較好的2對(duì)引物進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。

5.2.2 基因型鑒定引物的PCR條件測(cè)試：由于需要單克隆鑒定的樣品數(shù)量一般較多，同時(shí)對(duì)gDNA進(jìn)行PCR有一定的失敗率，因此可先對(duì)PCR引物和條件進(jìn)行測(cè)試。對(duì)基因鑒定引物的退火溫度進(jìn)行梯度溫度測(cè)試，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。PCR后進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)條帶的大小位置以及特異性等特征選擇合適的引物和退火溫度。

5.2.3 基因鑒定結(jié)果分析：利用預(yù)實(shí)驗(yàn)中得到的合適的PCR引物和條件，對(duì)挑選在96孔PCR板中的gDNA使用GoTaq酶進(jìn)行PCR鑒定。以在SUM159細(xì)胞上基因編輯表達(dá)LAMP1-mScarlet-I為例，通常會(huì)得到三種PCR結(jié)果(圖5A)：(1)未實(shí)現(xiàn)基因編輯的單克隆的PCR產(chǎn)物，只有分子量較小的一條帶(設(shè)計(jì)大小為403 bp)；(2)單等位基因敲入(雜合)單克隆的PCR產(chǎn)物有兩條帶，其中一條分子量小(設(shè)計(jì)大小為403 bp)的條帶為未插入mScarlet-I序列的PCR產(chǎn)物，另一條分子量較大的條帶為插入了mScarlet-I序列的PCR產(chǎn)物(設(shè)計(jì)大小為1126 bp)；(3)雙等位基因敲入(純和)只有一條分子量較大的條帶(設(shè)計(jì)大小為1126 bp)。

5.3 PCR鑒定熒光標(biāo)簽插入位點(diǎn)的準(zhǔn)確性

對(duì)于5.2得到的陽性克隆(純合或者雜合單克隆細(xì)胞系)，還需要判斷熒光標(biāo)簽的cDNA是否插入了目的基因的正確位置。通常會(huì)設(shè)計(jì)檢測(cè)插入位置的引物進(jìn)行PCR鑒定，其中一條引物位于熒光蛋白的N或者C端，另外一條引物位于插入位置900～ 1200 bp之外的gDNA上(位于同源重組模板序列之外)。在本示例中，正向引物位于mScarlet-I的序列的C末端附近，而反向引物位于在終止密碼子的下游約900～1200 bp。經(jīng)過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳后，判斷是否有條帶以及得到的電泳條帶片段與預(yù)期大小是否相符。若擴(kuò)增出電泳條帶且片段大小符合預(yù)期，則可初步判定插入的熒光標(biāo)簽序列的位置位于目的基因的相應(yīng)位置(圖5B)，對(duì)這些克隆可進(jìn)一步測(cè)序鑒定插入是否準(zhǔn)確。

圖5 利用PCR鑒定基因編輯表達(dá)LAMP1-mScarlet- I的單克隆細(xì)胞的基因型

A：利用PCR鑒定純合和雜合單克隆細(xì)胞系的引物設(shè)計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；B：利用PCR鑒定基因插入位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

5.4 單克隆細(xì)胞生長和形態(tài)觀察

對(duì)于上述步驟鑒定出的陽性克隆，需要在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和鑒定。與野生型的細(xì)胞相比，選擇細(xì)胞大小、形態(tài)、生長速度等相似的基因編輯細(xì)胞克隆并做好標(biāo)記以備下一步鑒定，舍棄細(xì)胞形態(tài)等明顯異常的基因編輯細(xì)胞克隆。

5.5 單克隆細(xì)胞蛋白表達(dá)鑒定

本步驟的目的是在蛋白水平上驗(yàn)證基因編輯的準(zhǔn)確性以及檢測(cè)基因編輯細(xì)胞系中目的蛋白的表達(dá)是否受到影響。通過BCA法測(cè)量每個(gè)樣品的蛋白濃度并校準(zhǔn)上樣量后，采用Westen blot檢測(cè)特定抗體結(jié)合的蛋白條帶大小和條帶的灰度值，進(jìn)而判定基因編輯細(xì)胞系中目的蛋白是否與熒光蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)，以及基因編輯后目的蛋白的表達(dá)水平是否發(fā)生變化。本文中mScarlet-I標(biāo)記LAMP1的不同基因型的陽性克隆Westen blot鑒定結(jié)果如圖6A。

此外，根據(jù)目的蛋白的不同，還可進(jìn)行進(jìn)一步的相應(yīng)功能鑒定，以確?；蚓庉嫽驘晒鈽?biāo)簽的插入對(duì)目的蛋白的功能未造成影響。

5.6 單克隆細(xì)胞的成像鑒定和測(cè)序驗(yàn)證

將5.5步驟中挑選出的細(xì)胞克隆經(jīng)胰酶消化后，將大部分細(xì)胞傳代到6孔板進(jìn)行培養(yǎng)以備凍存；另傳代少許陽性細(xì)胞系克隆至成像皿上，16～24 h后在顯微鏡上進(jìn)行熒光成像鑒定分析(圖6B)。同時(shí)取少許細(xì)胞于PCR管中，進(jìn)行第二次基因型和插入位點(diǎn)準(zhǔn)確性的鑒定，操作流程同5.2和5.3。

6 結(jié)語

利用基因編輯技術(shù)，對(duì)內(nèi)源目的蛋白進(jìn)行快速準(zhǔn)確的熒光標(biāo)記，為研究蛋白質(zhì)的定位、動(dòng)力學(xué)和互作等提供了重要工具。例如，通過基因編輯技術(shù)技術(shù)對(duì)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記，結(jié)合活細(xì)胞單分子熒光成像，揭示了網(wǎng)格蛋白包被內(nèi)吞囊泡組裝、剪切和脫包被等過程中相關(guān)分子的動(dòng)力學(xué)特征和機(jī)制[37,38]。本文對(duì)利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行熒光蛋白或自適應(yīng)蛋白標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了梳理和介紹。基于本實(shí)驗(yàn)室在基因編輯細(xì)胞系構(gòu)建中總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞篩選富集和單克隆鑒定部分進(jìn)行了詳細(xì)介紹，以期為其他團(tuán)隊(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯細(xì)胞系的構(gòu)建提供參考，提高基因編輯細(xì)胞系構(gòu)建的效率。本文介紹的CRISPR-Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)流程，也適用于構(gòu)建如APEX2和Flag等標(biāo)簽敲入的細(xì)胞系。與此同時(shí)，多種其他的用于蛋白標(biāo)簽knock-in的基因編輯技術(shù)，例如利用Cas9D10A切口酶、CRISPR-Cpf1和非同源重組方法等[10,31,39]，也展現(xiàn)出了在特定應(yīng)用場景下的優(yōu)勢(shì)，研究者可根據(jù)研究的需要選取最合適的工具。

圖6 Western blot和共聚焦成像鑒定基因編輯表達(dá)LAMP1-mScarlet-I的單克隆細(xì)胞

A：利用Western Blot鑒定純合和雜合的單克隆細(xì)胞系；B：利用轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡對(duì)基因編輯表達(dá)LAMP1-mScarlet-I的單克隆細(xì)胞的中間層進(jìn)行成像。標(biāo)尺10 μm。

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The protocol of tagging endogenous proteins with fluorescent tags using CRISPR-Cas9 genome editing

Zhongsheng Wu1,2, Yu Gao1,2, Yongtao Du1,2, Song Dang1, Kangmin He1,2

The currently widely used CRISPR-Cas9 genome editing technology enables the editing of target genes (knock-out or knock-in) with high accuracy and efficiency. Guided by the small guide RNA, the Cas9 nuclease induces a DNA double-strand break at the targeted genomic locus. The DNA double-strand break can be repaired by the homology-directed repair pathway in the presence of a repair template. With the repair template containing the coding sequence of a fluorescent tag, the targeted gene can be inserted with the sequence of a fluorescent tag at the designed position. The genome editing mediated labeling of endogenous proteins with fluorescent tags avoids the potential artifacts caused by gene overexpression and substantially improves the reproductivity of imaging experiments. This protocol focuses on creating mammalian cell lines with endogenous proteins tagged with fluorescent proteins or self-labeling protein tags using CRISPR-Cas9 genome editing.

CRISPR-Cas9 genome editing; live cell; endogenous protein; fluorescent protein; self-labeling protein tag

2022-12-02;

2023-01-06;

2023-01-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：91957106，31970659)和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào)：2021YFA0804802，2022YFA1304500)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 91957106, 31970659), and the Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China (Nos. 2021YFA0804802, 2022YFA1304500)]

吳仲勝，博士研究生，專業(yè)方向：細(xì)胞脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。E-mail: zswu@genetics.ac.cn

高譽(yù)，博士研究生，專業(yè)方向：細(xì)胞脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。E-mail: gaoyu@genetics.ac.cn

杜勇濤，博士研究生，專業(yè)方向：細(xì)胞囊泡運(yùn)輸。E-mail: duyongtao@genetics.ac.cn

吳仲勝、高譽(yù)和杜勇濤并列第一作者。

何康敏，博士，研究員，研究方向：細(xì)胞囊泡運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。E-mail: kmhe@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-395

(責(zé)任編委: 史岸冰)