張 娜, 尚金星, 龍 平, 王立平

(1. 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 河北 滄州, 061000; 2. 河北省滄州市中心醫(yī)院 神經(jīng)外科, 河北 滄州, 061000)

膠質(zhì)瘤屬顱內(nèi)常見的原發(fā)性腫瘤，起自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，惡性程度較高[1]。腦膠質(zhì)瘤通常預(yù)后較差，中位生存時(shí)間甚至不超過1年，且復(fù)發(fā)率高[2]。近年來，人們對(duì)于血液生物標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值越來越關(guān)注，腫瘤患者的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療指導(dǎo)等都是血液生物標(biāo)志物使用時(shí)的重要考慮因素。骨橋蛋白(OPN) 屬于分泌性鈣結(jié)合糖磷酸化蛋白，可結(jié)合受體整合素及CD44, 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生趨化、黏附、遷移、增殖等促進(jìn)作用，與惡性腫瘤侵襲關(guān)系密切[3]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)對(duì)神經(jīng)元具有支撐與營(yíng)養(yǎng)作用，參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖、分裂以及血腦屏障生理功能維護(hù)、自噬、神經(jīng)遞質(zhì)平衡維持等生物功能[4]。本研究分析腦膠質(zhì)瘤患者血清OPN、GFAP水平變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月—2021年5月83例腦膠質(zhì)瘤患者為研究對(duì)象(腦膠質(zhì)瘤組)，其中男44例，女39例; 年齡37～75歲，平均(56.66±7.19)歲; 腫瘤部位為額葉46例，顳葉22例，頂葉8例，其他7例; 腫瘤≤3 cm者12例，>3～5 cm者39例，>5 cm者32例; 病理分級(jí)為Ⅰ級(jí)20例，Ⅱ級(jí)21例，Ⅲ級(jí)23例，Ⅳ級(jí)19例。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)手術(shù)及組織病理學(xué)檢查證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤者; ② 預(yù)計(jì)生存期3個(gè)月以上者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并腦外傷或有腦手術(shù)病史者; ②合并血管畸形、顱內(nèi)占位者; ③ 合并嚴(yán)重顱內(nèi)壓增高或腦疝者; ④ 合并免疫或血液系統(tǒng)疾病者; ⑤ 入組前接受化療、免疫治療者。將2019年3月—2021年5月顱內(nèi)良性腫瘤住院患者20例納入顱內(nèi)良性腫瘤組，男11例，女9例; 年齡36～76歲，平均(55.91±7.03)歲; 疾病種類為垂體瘤6例，腦膜瘤7例，神經(jīng)鞘瘤5例，中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤1例，海綿狀血管瘤1例。另外選擇進(jìn)行體檢的健康人群20例為對(duì)照組，其中男11例，女性9例; 年齡37～74歲，平均(57.03±7.40)歲; 腦膠質(zhì)瘤組、顱內(nèi)良性腫瘤組、對(duì)照組性別及年齡資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

腦膠質(zhì)瘤組患者均行顯微鏡下腦膠質(zhì)瘤全切或次全切除術(shù)，近距離充分暴露瘤體，顯微鏡下切除非功能區(qū)瘤體，術(shù)后Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者次全切除者術(shù)后給予放射治療; Ⅲ～Ⅳ級(jí)者聯(lián)合放化療。術(shù)后2周行放射治療，靶區(qū)行60Co射線照射, 1.5～2.0 Gy/次, 5次/周，放射治療5周，靶區(qū)總劑量50 Gy。同時(shí)行化學(xué)治療，替莫唑胺(Merck Sharp & Dohme Ltd, 批準(zhǔn)文號(hào)H20120420)口服劑量為150 mg/m2, 第1周1次/d, 第2周開始根據(jù)患者不良反應(yīng)程度逐步遞增至200 mg/m2, 28 d為1個(gè)周期，共治療6個(gè)周期。

所有研究對(duì)象均于疾病診斷后以及術(shù)后第14天、放射和化學(xué)治療完成后晨起空腹取肘靜脈血5 mL, 以3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后取上清液, -80 ℃保存。血清OPN、GFAP的檢測(cè)采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法。每個(gè)酶標(biāo)板孔加入稀釋液100 μL, 空白孔加樣品稀釋液50 μL, 標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品50 μL, 混勻，室溫孵育2 h。吸除液體，甩干，緩沖液洗滌(4次)，每孔分別加OPN、GFAP結(jié)合物2 000 μL, 酶標(biāo)板貼覆膜，室溫下孵育2 h, 吸除液體，甩干，緩沖液洗滌(4次)。依序每孔加底物2 000 μL, 室溫下孵育30 min, 酶標(biāo)板孔中溶液呈藍(lán)色，注意避光。以底物液相同順序加入終止溶液50 μL, 終止反應(yīng)，酶標(biāo)板孔中顏色由藍(lán)變黃。采用酶聯(lián)儀測(cè)量各孔光密度(OD)值。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程式，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)物水平，縱坐標(biāo)為OD值，實(shí)際水平=OD值×稀釋倍數(shù)。試劑盒購自美國R&D公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，多組間同一時(shí)點(diǎn)比較采用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率分析，通過受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估血清OPN、GFAP檢測(cè)對(duì)疾病的診斷和病理分級(jí)評(píng)估價(jià)值,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清OPN、GFAP水平比較

腦膠質(zhì)瘤組血清OPN、GFAP表達(dá)水平高于顱內(nèi)良性腫瘤組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 2組血清OPN、GFAP水平比較

2.2 血清OPN、GFAP水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤的評(píng)估價(jià)值分析

血清OPN、GFAP聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估發(fā)生腦膠質(zhì)瘤的ROC曲線下面積為0.883, 高于OPN(0.793)、GFAP(0.789)單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05), 見表2、圖1。

表2 血清OPN、GFAP水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤的評(píng)估價(jià)值分析

圖1 血清OPN、GFAP水平診斷腦膠質(zhì)瘤的ROC曲線

2.3 不同病理特征腦膠質(zhì)瘤患者血清OPN、GFAP水平比較

不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、卡氏評(píng)分法(KPS)評(píng)分患者血清OPN、GFAP水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 世界衛(wèi)生組織(WHO)分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)、腫瘤抑制基因P53基因型突變型、細(xì)胞增殖活性抗原Ki-67高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤患者血清OPN高于WHO分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)、P53基因型野生型、Ki-67低表達(dá)患者, GFAP水平低于WHO分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)、P53基因型野生型、Ki-67低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 不同病理特征腦膠質(zhì)瘤患者血清OPN、GFAP水平比較

2.4 血清OPN、GFAP水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)的評(píng)估分析

采用血清OPN、GFAP聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估腦膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)。聯(lián)合檢測(cè)診斷Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤ROC曲線下面積為0.792, 高于OPN(0.690)或GFAP(0.702)單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05), 見圖2、表4。

圖2 血清OPN、GFAP水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)評(píng)估的ROC曲線

表4 血清OPN、GFAP水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)的評(píng)估分析

2.5 不同WHO分級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者治療前后血清OPN、GFAP水平比較

WHO分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)和Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后第14天血清OPN、GFAP水平均較治療前降低，且放化療后患者血清OPN、GFAP水平進(jìn)一步降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); WHO分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者治療前、術(shù)后2周、術(shù)后6個(gè)月的血清OPN、GFAP水平均高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表5。

表5 不同WHO分級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者治療前后血清OPN、GFAP水平比較

3 討 論

膠質(zhì)瘤屬于較難治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，早期誤診率、漏診率較高，且缺乏特異性診斷方法。膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)特征是導(dǎo)致臨床治療效果較差和患者不良預(yù)后的主要原因，即使采用手術(shù)治療，其5年生存率也極低[5]。腦膠質(zhì)瘤侵襲受多種基因、蛋白共同調(diào)控，這一過程可能涉及腫瘤細(xì)胞黏附、增殖、基質(zhì)降解、遷移等環(huán)節(jié)[6]。

OPN可促進(jìn)腫瘤侵襲，是一種新的腫瘤標(biāo)志物[7]。YU A Z等[8]研究在同一條件下檢測(cè)多種腫瘤OPN表達(dá)水平，結(jié)果顯示食管癌、胃癌、腸癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌中均發(fā)現(xiàn)OPN 過度表達(dá)。本研究也顯示，腦膠質(zhì)瘤患者血清OPN呈現(xiàn)高表達(dá)，血清OPN評(píng)估發(fā)生腦膠質(zhì)瘤的ROC曲線下面積為0.793, 可在一定程度上輔助臨床腦膠質(zhì)瘤的診斷。OPN通過非螯合物前體肽精-甘-天冬氨酸三肽序列(RGD)依賴方式與癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物血細(xì)胞簇分化抗原44(CD44)結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)特異性信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，破壞細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)新生血管形成，促使腫瘤向周圍趨化、黏附、增殖、遷移，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。本研究顯示, WHO分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、P53基因型突變型、Ki-67高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤患者血清OPN水平高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)、P53基因型野生型、Ki-67低表達(dá)患者，血清OPN評(píng)估腦膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)ROC曲線下面積為0.690, 提示OPN高表達(dá)有腦膠質(zhì)瘤不良生物學(xué)行為?？赡茉?yàn)? ① OPN依靠信號(hào)異常傳導(dǎo)并刺激正常細(xì)胞惡性生物行為轉(zhuǎn)化; ② 降解細(xì)胞外基質(zhì)，促使腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)遷移，刺激腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤惡性發(fā)展[10]。

缺血損傷發(fā)生會(huì)刺激成熟星形細(xì)胞GFAP的合成[11]。PINA-MEDINA A G等[12]研究顯示，膠質(zhì)瘤患者血清GFAP濃度高于顱內(nèi)非膠質(zhì)瘤組織以及正常腦組織機(jī)體血清水平，其濃度值在膠質(zhì)瘤診斷中具有重要價(jià)值，尤其是頗內(nèi)腫瘤來源診斷存在困難時(shí)，其陽性表達(dá)對(duì)于腫瘤組織屬于膠質(zhì)細(xì)胞來源評(píng)估具有重要參考價(jià)值。本研究也顯示，腦膠質(zhì)瘤患者血清GFAP呈高表達(dá)，且血清OPN評(píng)估發(fā)生腦膠質(zhì)瘤的ROC曲線下面積為0.789, GFAP異常不僅可引起細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，易于遷移、游動(dòng)，還能導(dǎo)致骨架系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化，干擾信號(hào)傳導(dǎo)，從而改變腫瘤細(xì)胞生物學(xué)性狀[13]。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示, WHO分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)、P53基因型突變型、Ki-67高表達(dá)的患者GFAP表達(dá)水平相較于Ⅰ～Ⅱ級(jí)、P53基因型野生型、Ki-67低表達(dá)患者更低，說明腦膠質(zhì)瘤患者血清GFAP水平隨著腫瘤惡性程度的增高而降低，血清GFAP評(píng)估腦膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)的ROC曲線下面積為0.702, 提示下調(diào)GFAP表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加，進(jìn)一步增高惡性程度，這可能與GFAP基因表達(dá)調(diào)控及高甲基化有關(guān)，整合素表達(dá)隨GFAP表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞骨架分離溶解，細(xì)胞黏附力下降，腫瘤易擴(kuò)散。研究[14]顯示，大部分惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中, GFAP低表達(dá)與該基因呈高甲基化狀態(tài)有關(guān)，高甲基化狀態(tài)可導(dǎo)致GFAP轉(zhuǎn)錄失活。

本研究結(jié)果顯示，惡性程度低的腦膠質(zhì)瘤患者與惡性程度高的患者放化療后血清OPN、GFAP水平低于治療前，提示治療過程中腫瘤細(xì)胞的增殖得到了一定抑制, OPN、GFAP合成及釋放減少。惡性程度低的腦膠質(zhì)瘤患者治療前血清GFAP水平高于腦膠質(zhì)瘤惡性程度高患者，但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，患者血清GFAP水平大幅度降低，且術(shù)后2周、術(shù)后6個(gè)月后其水平均低于惡性程度高的患者。本研究不足之處在于未對(duì)不同療效患者血清OPN、GFAP變化情況進(jìn)行探討，未分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，后續(xù)研究過程中可進(jìn)一步對(duì)比完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定、疾病進(jìn)展患者血清OPN、GFAP變化趨勢(shì)，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪，比較不同血清OPN、GFAP表達(dá)水平患者生存時(shí)間的差異。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤患者血清OPN、GFAP呈高表達(dá)，其高度惡性患者血清OPN水平高于低度惡性患者, GFAP水平低于低度惡性患者，患者治療后血清OPN、GFAP水平均較治療前降低，兩者在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，干擾OPN、GFAP表達(dá)或可成為腦膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)之一。