蔡燁琳，景欣悅，朱丁香，胡化廣，張振銘

（鹽城師范學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224007）

0 引言

在長期的進(jìn)化過程中，植物個(gè)體進(jìn)化出兩種方式適應(yīng)干旱脅迫，一種是避旱[1]，某些植物在土壤及其本身發(fā)生嚴(yán)重水分虧缺之前完成生活史，如沙漠中某些短命植物只在雨季生長；另一種更廣泛的適應(yīng)方式是耐旱[2]，通過在干旱時(shí)體內(nèi)物質(zhì)如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，抗氧化保護(hù)酶活性的升高，根系的適應(yīng)性生長等方式適應(yīng)干旱脅迫。

自然界資源往往呈現(xiàn)斑塊狀分布，這些資源在空間分布上具有斑塊性、梯度性，呈現(xiàn)空間異質(zhì)性[3]?？寺≈参镏干L在自然環(huán)境中，通過自身的無性繁殖，衍生出多個(gè)相同個(gè)體，這些個(gè)體從外觀和生理上具有相似性[4,5]?？寺≌鲜强寺≈参镒钔怀龅奶匦訹6]，在面臨如干旱[7]、遮陰[8]、鹽脅迫[9]、重金屬[10]等脅迫環(huán)境時(shí)，克隆植物相連分株間通過整合機(jī)制，實(shí)現(xiàn)信息、資源與能量的共享，從而緩解異質(zhì)性環(huán)境脅迫對植物生長和發(fā)育造成的不利影響，提高克隆植物對異質(zhì)環(huán)境的適應(yīng)性[11]。在大多數(shù)研究中，發(fā)現(xiàn)母株對子株具有生理整合，但子分株對母株沒有生理整合[12-14]。然而，一些研究表明，生理整合可以導(dǎo)致庫和源之間的關(guān)系發(fā)生變化，并且存在反饋機(jī)制[15,16]。此外，其他研究發(fā)現(xiàn)，母株和子株之間沒有生理整合[17]。這些研究表明，克隆整合可能存在物種特異性，整合的方向可能會(huì)根據(jù)不同的植物而改變。

溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）又名馬尼拉草，是結(jié)縷草屬（ZoysiaWilld.）多年生草本植物，分布于中國臺(tái)灣、廣東、海南；亞洲和大洋洲的熱帶地區(qū)亦有分布。溝葉結(jié)縷草通過地下莖和匍匐莖的無性繁殖形成的草坪低矮平整，莖葉纖細(xì)美觀，又具一定的彈性，加上侵占力強(qiáng)，易形成草皮，所以常栽種于花壇內(nèi)作封閉式花壇草坪或作草坪造型供人觀賞。因其耐踐踏性強(qiáng)，也可用作運(yùn)動(dòng)場、飛機(jī)場及各種娛樂場所的美化植物。在結(jié)縷草屬植物克隆整合研究上，何月對水分異質(zhì)性對克隆植物日本結(jié)縷草（Zoysia japonica）光合和抗氧化酶的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在水分異質(zhì)情況下，日本結(jié)縷草存在生理整合現(xiàn)象[18]。前人對溝葉結(jié)縷草個(gè)體適應(yīng)干旱脅迫的機(jī)理進(jìn)行了一些研究[19-21]，但是在群體上研究的較少，特別是克隆整合在其適應(yīng)干旱脅迫中的作用還未見報(bào)道。本文通過研究水分異質(zhì)生境下溝葉結(jié)縷草分株的生理和生長指標(biāo)變化，以期揭示克隆植物溝葉結(jié)縷草是否存在生理整合及其整合特點(diǎn)，研究結(jié)果對于豐富克隆植物生理整合理論，揭示溝葉結(jié)縷草群體適應(yīng)干旱的機(jī)理具有非常重要的理論意義；同時(shí)，對于溝葉結(jié)縷草的建植和養(yǎng)護(hù)管理也具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和培養(yǎng)

2021年5月，從鹽城師范學(xué)院生物園選擇生長一致的24個(gè)溝葉結(jié)縷草克隆片段，每個(gè)片段帶有6個(gè)節(jié)，基端和頂端分別種在裝有河沙的塑料盆中，塑料盆高20 cm，盆口直徑15 cm，基質(zhì)填沙量為塑料盆體積的4/5。植株在室外培養(yǎng)，光照范圍為600～1 780 mmol/（m2·s），溫度范圍為14.3～32.5 °C，平均溫度為21.7 °C，相對濕度為73 ±10%，植株每3 d 澆一次水，每周澆灌200 mL 1/2 Hoagland 營養(yǎng)液一次。待基端母株和頂端子株長出足量的葉片后，植株莖葉蓋度為盆口面積的90%以上時(shí)，開始干旱處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理，一個(gè)為干旱處理，另一個(gè)為匍匐莖剪斷或者連接處理。干旱設(shè)4 個(gè)水分水平，母株正常澆水，子株分別處于正常含水量的100%、60%、40%和20%，采用每天稱重，補(bǔ)充水分的方法保持土壤含水量恒定。

1.2 生理指標(biāo)測定方法

脅迫14 d 后，取子株成熟的葉片測定生理指標(biāo)，包括葉片超氧陰離子產(chǎn)率、過氧化氫含量、丙二醛（MDA）含量和相對電導(dǎo)率（RC）、過氧化氫酶（CAT）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性、過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性。具體測定方法如下。

1.2.1 超氧陰離子產(chǎn)率的測定

參照陸巍等[22]人的方法。具體如下：取各處理溝葉結(jié)縷草子株葉片0.5 g，然后依次加入3 mL 磷酸緩沖鹽溶液、1 mL羥胺溶液、1 mL 0.1 mol/L EDTA，暗環(huán)境下冰浴研磨至勻漿。勻漿液在12 000g下離心30 min，吸取1 mL 上清液，依次加入1 mL 對氨基苯磺酸、1 mLα-萘胺溶液后振蕩混勻。置于37 ℃下保溫10 min，加入3 mL 乙醚并充分混勻，隨后將所有混合液在2 000g下離心5 min，吸出上清液后在530 nm 處測其吸光度，然后以亞硝酸鈉溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定超氧陰離子產(chǎn)率。

1.2.2 H2O2含量的測定

參照Loreto 和Velikova 的方法[23]。取各處理溝葉結(jié)縷草子株葉片0.5 g，加入5 mL 0.1%(W/V)三氯乙酸冰浴研磨成勻漿。將勻漿在12 000g下離心15 min，取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL 10 mM 磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）和1 mL 1M 碘化鉀，振蕩后取混合物在390 nm 處測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2含量。

1.2.3 MDA含量的測定

采用硫代巴比妥酸法，取各處理子株葉片1.0 g，加入10 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂研磨至勻漿。將勻漿在4 000g下離心10 min，提取上清液保存。吸取2 mL 上清液，與0.6%TBA溶液充分混勻后，置于沸水浴上反應(yīng)15 min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532 nm、600 nm 和450 nm 波長下的吸光度。MDA 濃度計(jì)算公式（1）和MDA 含量計(jì)算公式（2）如下：式中：C為MDA濃度，μmol/L；A為吸光度。

式中：Y為MDA 含量，nmol/g；V為提取液體積，mL；W為植物組織鮮重，g。

1.2.4 葉片相對電導(dǎo)率的測定

取各處理溝葉結(jié)縷草子株葉片1.0 g，用雙蒸水沖洗3 次，隨后用濾紙將表面水分擦拭干凈、剪碎，每處理取0.1 g，分別加入到含10 mL 去離子水的試管中，于室溫下加蓋浸泡12 h。用電導(dǎo)儀測定提取液電導(dǎo)率（R1），隨后用沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定電導(dǎo)率（R2）。用公式R1/R2×100%計(jì)算相對電導(dǎo)率[24]。

1.2.5 酶的提取和活性測定

參照Li 等[25]人的方法，先將0.5 g 的葉片冰浴研磨，然后在3.0 mL 含有0.2 M EDTA 和2%聚乙烯吡咯烷酮（W/V）的50 mM 磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）中勻漿，然后4 °C，12 000g離心20 min，上清液用于酶活性測定。POD、SOD、CAT 活性采用張志忠等[26]人的方法測定，GPX 活性采用張景萍[27]的方法測定。

1.3 生物量測定

生理指標(biāo)測完后，把溝葉結(jié)縷草從盆中取出，用自來水把河沙沖洗干凈，把根系和地上部分分開，將水分吸取干凈，在105 °C 下殺青15 min，然后在80 ℃烘箱內(nèi)烘干24 h至恒重，用電子天平測量干重并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析采用SAS（Version 9.42）軟件；平均值采用Duncan 多重比較法，顯著水平P≤0.05；繪圖用Microsoft Excel 2010軟件。

2 結(jié)果分析

2.1 克隆整合對溝葉結(jié)縷草子株活性氧及膜完整性的影響

表1 水分異質(zhì)處理和匍匐莖連接對溝葉結(jié)縷草活性氧及膜完整性影響的F值Tab.1 F values of water heterogeneity and stolon connection on active oxygen and membrane integrity of Z.matrella.

圖1 水分異質(zhì)處理和匍匐莖連接對溝葉結(jié)縷草抗氧化脅迫各指標(biāo)的影響Fig.1 Water heterogeneity and stolon connection on active oxygen and membrane integrity of Z.matrella

2.2 克隆整合對溝葉結(jié)縷草子株抗氧化酶活性的影響

葉片CAT、GPX、SOD活性均受水分脅迫、匍匐莖連接與否以及它們互做的極顯著的影響，而POD 活性僅受水分脅迫和互做的顯著影響，匍匐莖連接狀態(tài)對POD 活性沒有顯著影響（表2）。匍匐莖無論斷開或者連接，子株CAT 的活性隨土壤持水量的下降而顯著上升[見圖2（a）]，而SOD 活性也呈現(xiàn)相似的變化趨勢，不同的是，在匍匐莖連接狀態(tài)下，60%和40%土壤水分條件下子株葉片SOD 活性無顯著差異，在匍匐莖斷開的情況下，40%和20%水分條件下，子株葉片的SOD活性也無顯著差異[見圖2（b）]。在各土壤水分下，匍匐莖連接子株葉片CAT 和SOD 均小于匍匐莖斷開子株CAT 和SOD 活性[見圖2（a），圖2（b）]。子株GPX 和POD 活性隨著土壤持水量的下降呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在土壤持水量40%時(shí)，兩種酶的活性達(dá)到最大值，然后開始下降，這時(shí)，匍匐莖連接和斷開子株GPX 活性分別比對照增加了88.81%和149.78%[見圖2（c）]，而POD 活性分別增加了454.50%和619.47%[見圖2（d）]。在60%和40%土壤持水量情況下，匍匐莖連接子株的GPX 和POD 活性均小于匍匐莖斷開子株的GPX 和POD 活性，但是在20%土壤持水量下，無論匍匐莖斷開或者連接，子株GPX和POD活性沒有顯著差異[見圖2（c），圖2（d）]。

表2 水分異質(zhì)處理和匍匐莖連接對溝葉結(jié)縷草抗氧化保護(hù)酶活性影響的F值Tab.2 F values of water heterogeneity and stolon connection on antioxidant protective enzymes of Z.matrella.

圖2 水分異質(zhì)處理和匍匐莖連接對溝葉結(jié)縷草抗氧化酶的影響Fig.2 Water heterogeneity and stolon connection on antioxidant protective enzymes of Z.matrella

2.3 克隆整合對溝葉結(jié)縷草形態(tài)特征的影響

水分脅迫、匍匐莖連接以及它們的互做顯著影響子株的生物量積累，但對母株沒有顯著的影響，克隆片段的生物量只受水分脅迫和匍匐莖連接的顯著影響，但不受互做的影響（表3）。無論匍匐莖連接或者斷開，子株和克隆片段的生物量均隨著含水量的降低呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，子株和克隆片段在土壤含水量60%時(shí)生物量最大，顯著的高于其他各處理，且匍匐莖連接子株的生物量顯著的高于匍匐莖斷開子株的生物量（圖3）。在100%和40%土壤水分處理下，匍匐莖斷開與連接子株和克隆片段的生物量沒有顯著差異，但在20%的土壤含水量處理下，匍匐莖連接子株和克隆片段的生物量顯著的高于匍匐莖斷開子株的生物量（圖3）。

表3 水分異質(zhì)處理和匍匐莖連接對溝葉結(jié)縷草生物量積累和根冠比影響的F值Tab.3 F values of water heterogeneity and stolon connection on biomass accumulation and root/shoot of Z.matrella

圖3 水分異質(zhì)處理和匍匐莖連接對溝葉結(jié)縷草生物量積累的影響Fig.3 Water heterogeneity and stolon connection on biomass accumulation of Z.matrella

水分脅迫、匍匐莖連接以及他們的互做顯著影響子株的根冠比，但是對母株的根冠比沒有顯著的影響（表3）。無論匍匐莖斷開或者連接，子株的根冠比在40%土壤含水量時(shí)最大，且匍匐莖斷開的根冠比大于匍匐莖連接的根冠比。在100%含水量處理下，子株的根冠比沒有顯著差異，但是在60%和20%的土壤水分處理下，匍匐莖斷開的根冠比均顯著大于匍匐莖連接的根冠比（圖4）。

圖4 水分異質(zhì)處理和匍匐莖連接對溝葉結(jié)縷草生物量積累的影響Fig.4 Water heterogeneity and stolon connection on root/shoot of Z.matrella

注：圖中相同小寫字母表示子株根冠比無顯著差異（P<0.05）。

3 討論

與非克隆植物相比，克隆整合增加了克隆植物在異質(zhì)生境下的適應(yīng)能力[28]。正常生境下，活性氧的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)植物遭受干旱、淹水、重金屬和鹽脅迫時(shí)，活性氧的產(chǎn)生和清除的平衡被打破，導(dǎo)致活性氧積累。O2－·和H2O2是植物中兩種重要的活性氧[29]，在本研究中，水分脅迫誘導(dǎo)過量的O2－·和H2O2產(chǎn)生，并引起O2－·和H2O2的積累，過量的O2－·和H2O2導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化。MDA 是膜脂過氧化的產(chǎn)物[11]，膜質(zhì)過氧化破壞了細(xì)胞膜，導(dǎo)致電解質(zhì)擴(kuò)散，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率增加，因此O2－·產(chǎn)率、H2O2和MDA 含量和相對電導(dǎo)率可以反映細(xì)胞膜的損傷程度。本研究表明，水分異質(zhì)生境下，溝葉結(jié)縷草匍匐莖連接顯著降低了子株的O2－·產(chǎn)率和H2O2含量，有匍匐莖連接子株的MDA 含量和相對電導(dǎo)率也低于匍匐莖斷開子株的MDA 含量和相對電導(dǎo)率，說明水異質(zhì)生境下，克隆整合作用減輕了溝葉結(jié)縷草子株的氧化損傷。本研究的結(jié)果與何月[18]的研究結(jié)果不同，何月在研究結(jié)縷草水分生理整合時(shí)認(rèn)為無法推斷出結(jié)縷草母子株在水分異質(zhì)條件下，是否存在MDA 生理整合，他推測可能為生理整合發(fā)生在干旱條件下的單株受到傷害以后，此時(shí)單株體內(nèi)的 MDA 已產(chǎn)生，無法在發(fā)生生理整合傷害減輕后自行分解。

APX、GPX、SOD和POD是植物清除活性氧最重要的四種保護(hù)酶。抗氧化酶活性的變化已被廣泛用作植物抵御逆境傷害的指標(biāo)，一般來說，抗氧化酶活性與細(xì)胞傷害程度呈正相關(guān)[30]。本研究表明，在水分異質(zhì)生境下，4 種抗氧化酶活性顯著提高，有匍匐莖連接子株的APX、GPX 和SOD 活性均低于匍匐莖斷開子株的APX、GPX 和SOD 活性。胡俊靖等[31]在研究美麗箬竹（Indocalamus decorus）水分生理整合時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與高水勢、中水勢分株相連的低水勢分株葉片抗氧化酶增加明顯，且分株間水勢差越大，低水勢分株抗氧化酶活性變化越明顯，抗氧化系統(tǒng)清除活性氧能力越強(qiáng)。景雄[32]在研究毛竹（Phyllostachys edulis）水分生理整合時(shí)也發(fā)現(xiàn)相同現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn)匍匐莖斷開或者連接對POD 活性沒有顯著影響，說明水分異質(zhì)生境下，溝葉結(jié)縷草母株對子株的APX、GPX 和SOD活性有顯著的生理整合作用，而對POD無克隆整合作用。

本研究發(fā)現(xiàn)克隆整合促進(jìn)了溝葉結(jié)縷草子株和克隆片段的生長，影響了子株的根冠比，但克隆整合沒有影響母株的生長，這一結(jié)果與他人實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[33]。原因可能是，一方面，母株在不影響自身生長的情況下將其資源轉(zhuǎn)移到子分株上[34]，另一方面，克隆整合改變了分株間的源庫關(guān)系，刺激了母株的補(bǔ)償性生長[33]。李曉霞等[35]人在研究薇甘菊（Mikania micrantha）水分生理整合時(shí)發(fā)現(xiàn)，水分異質(zhì)生境下，克隆整合顯著提高了低水斑塊分株的生物量，這與本文的研究結(jié)果相一致；但是在她的研究中還發(fā)現(xiàn)，克隆整合對整個(gè)克隆片段的生物量沒有影響，并且克隆整合提高了高水斑塊分株的根冠比，這與本文的研究結(jié)果不同，這可能與克隆整合具有物種特異性有關(guān)[36]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，異質(zhì)性水分脅迫下，克隆整合緩解了水分脅迫對溝葉結(jié)縷草受脅迫分株的影響，存在著從母株到子株明顯的生理整合作用。在水分異質(zhì)生境下，溝葉結(jié)縷草通過匍匐莖或者地下莖實(shí)現(xiàn)養(yǎng)分、水分從母株到子株的重新分配，導(dǎo)致受脅迫子株APX、GPX 和SOD 活性增加，從而減輕了水分脅迫造成的溝葉結(jié)縷草子株的過氧化損傷，同時(shí)促進(jìn)了溝葉結(jié)縷草子株和克隆片段的生長，并提高了子株的根冠比，增加了子株對水分異質(zhì)生境的適應(yīng)。