葉遠(yuǎn)征，付曉曉，馬曉蕓，范 平*

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.心功能科；2.省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.干部特診區(qū)，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000；3.烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000

高血壓(hypertension)是引起心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，也是慢性腎功能衰竭的主要原因之一。眾所周知，高血壓的病理生理學(xué)是多因素的，包括血流動(dòng)力學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞失調(diào)、血管平滑肌功能障礙、活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加、交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活以及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的激活等[1]。非編碼RNA已經(jīng)被越來(lái)越多的研究證實(shí)在多種細(xì)胞與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。MicroRNAs(miRNAs)是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，它能夠通過(guò)多種作用機(jī)制對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。miR-144-3p在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[2-4]。然而，miR-144-3p在高血壓中的作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)到。本研究前期已證實(shí)miR-144-3p在高血壓患者中低表達(dá)，提示其可能在高血壓的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。本研究的目的在于探討其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為高血壓病的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(均Gibco公司)；血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)(Sigma-Aldrich公司)；ROS試劑盒和TUNEL試劑盒(南京研拓生物科技有限公司)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(TaKaRa公司)；EdU試劑盒、annexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Keygen公司)；引物、miR-144-3p 模擬物(mimic)、miR-144-3p 陰性對(duì)照(NC)(由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè)miR-144-3p的表達(dá)：利用miRNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，加dd H2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 30 s，57 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。分析熔解曲線，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算Ct值。miR-144-3p上游引物序列:5′-GGCCGGCGTACAGTATAGATGA-3′，下游引物序列:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞的分組： 使用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件均為37 ℃恒溫及5% CO2濃度培養(yǎng)箱。構(gòu)建AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs損傷模型：待細(xì)胞匯合后，加入2 mL含血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，然后加入200 μL 10 nmol/L的Ang Ⅱ溶液誘導(dǎo)。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-144-3p mimic、miR-144-3p NC根據(jù)說(shuō)明書，使用 Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞調(diào)至(6～8)× 104個(gè)/mL，取100 μL接種于含有10% DMEM培養(yǎng)液的96孔板中，分別取第1、2、3、4、5天樣品進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。操作方法：檢測(cè)前4 h每孔加入20 μL MTT 貯存液，培養(yǎng)4 h后，棄去孔中培養(yǎng)液，各加150 μL DMSO，振蕩溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)(490 nm)各孔吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，吹勻后在Transwell小室的上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，取出小室，將Transwell小室基底膜完整切除，用無(wú)菌棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，多聚甲醛固定15 min，蘇木精染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

1.2.5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，冰PBS洗滌2次。采用annexin V-FITC/PI雙染，避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS活性：用冰PBS洗滌細(xì)胞，隨后與1 mmol/L DCHF-DA在37 ℃下避光溫育30 min。然后將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并再次用PBS洗滌并重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中(1×106個(gè)/ mL)，最后用于流式細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-144-3p的轉(zhuǎn)染效率

與對(duì)照組相比，模型組HUVECs中miR-144-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，轉(zhuǎn)染miR-144-3p模擬物組的細(xì)胞中miR-144-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.2 miR-144-3p對(duì)HUVECs增殖的影響

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞的增殖能力顯著降低(圖2A)。而與模型組相比，轉(zhuǎn)染miR-144-3p模擬物組的細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖2B)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.3 miR-144-3p對(duì)HUVECs凋亡的影響

與對(duì)照組相比，模型組HUVECs，凋亡率顯著升高(P<0.05)。而與模型組相比，轉(zhuǎn)染miR-144-3p模擬物組的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.4 miR-144-3p對(duì)HUVECs侵襲的影響

與對(duì)照組相比，模型組HUVECs侵襲能力明顯下降(P<0.05)。而與模型組相比，轉(zhuǎn)染miR-144-3p模擬物組的細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.5 miR-144-3p對(duì)HUVECs內(nèi)ROS活性的影響

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS活性顯著升高(P<0.05)。而與模型組相比，轉(zhuǎn)染miR-144-3p模擬物組細(xì)胞內(nèi)ROS活性明顯下降(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

3 討論

MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度在20個(gè)核苷酸左右的內(nèi)源性小非編碼RNA，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、黏附等多種生物學(xué)行為，在眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[5-6]。miRNAs一方面能夠從上游接受轉(zhuǎn)錄因子和(或)其他非編碼RNA的調(diào)控，另一方面，能夠通過(guò)吸附能力調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，其相互作用可以描繪出復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而影響細(xì)胞和疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。據(jù)報(bào)道，miR-122、 miR-96-5p、 miR-181b、miR-27a等通過(guò)靶向不同的基因參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖[8-11]。miR-144-3p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)miRNA分子，研究表明其在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且在不同腫瘤中通過(guò)多種作用機(jī)制雙向調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、放射性治療和化學(xué)藥物治療的敏感性等[12-14]。然而，miR-144-3p在高血壓中的表達(dá)和作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

前期研究中，通過(guò)收集高血壓患者和健康人外周血進(jìn)行microRNA芯片高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列差異表達(dá)的microRNAs。結(jié)果顯示miR-144-3p在新疆維吾爾人群原發(fā)性高血壓病人中顯著低表達(dá)，故選取miR-144-3p作為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著下降，而凋亡率和細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升；而過(guò)表達(dá)miR-144-3p后，細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力得到了一定程度的恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著下降。上述研究提示其可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷而參與高血壓的發(fā)生發(fā)展。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是心血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素，血管內(nèi)皮功能也是心血管疾病的研究熱點(diǎn)之一。越來(lái)越多的證據(jù)表明，血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖對(duì)于心血管疾病的發(fā)展和發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄和腹主動(dòng)脈瘤的形成[15]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)已被證實(shí)有助于血管重塑的發(fā)展。血管緊張素(Ang Ⅱ)是一種多功能激素，對(duì)血管緊張素Ⅱ受體1型或血管緊張素Ⅱ受體2型的血管穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。盡管一些研究表明，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖有助于血管重塑，但這一過(guò)程的分子機(jī)制仍有待闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-144-3p能夠在一定程度逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究為進(jìn)一步探索miR-144-3p在高血壓中的作用機(jī)制奠定了一定理論基礎(chǔ)。