勾蒙蒙，朱震宇,2*，趙 雨，閆秋林，王 穎

(1.陜西科技大學 化學與化工學院 天然產物穩(wěn)定同位素組學實驗室, 陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 陜西省輕化工助劑重點實驗室，陜西 西安 710021)

0 引言

植物、藻類和原核生物通過太陽能來合成有機物的整個過程被稱作“光合作用”(photosynthesis).這一過程產生的有機物質，除了滿足自養(yǎng)生物自身的需要外，對其它異養(yǎng)物種的生存也必不可少[1].植物中C、H、O同位素組成綜合反應了植物光合作用過程中氣孔導度和CO2的固定，可以作為植物在環(huán)境中生理機能變化的指標，用于研究植物生理與生態(tài)環(huán)境之間的關系.降水、溫度、光照、土壤鹽度、大氣CO2濃度等因素都會在不同程度上影響植物葉片氣孔導度和CO2的固定，從而引起植物合成有機質中δ13C、δ2H、δ18O發(fā)生改變[2-8].

在植物中，大氣中的CO2通過氣孔進入細胞，源水由根部運輸到葉片，并受濕度、空氣溫度以及光照的影響蒸發(fā)富集.同時在光合作用下首先合成糖類化合物，一部分糖類化合物運輸到莖部結合成纖維素，另一部分糖類化合物通過磷酸化、異構化為三碳糖并轉變?yōu)楸?，在丙酮酸脫氫酶復合體的催化下，丙酮酸被轉化為乙酰-CoA，乙酰-CoA經縮合、還原、脫水、再還原等鏈延長步驟生成脂肪酸，最終脂肪酸脫羧形成正構烷烴[9-13].部分生物標志物的合成路徑如圖1所示.

生物標志物(Biomarkers)是由生物體產生，在生物死亡后經氧化、還原、裂解、加/去氫、異構化等一系列化學變化后，仍可保持源生化成分的特征結構[14,15].自20世紀50年代開始測定植物碳同位素豐度比以來，隨著質譜測定技術的改進，穩(wěn)定同位素分析在生態(tài)學領域取得了很大進展.Chad S.Lane[16]記錄了正構烷烴的豐度、分布以及正構烷烴的δ13C和δ2H.Erika J.Freimuth等[17]等研究了溫帶森林中五種落葉被子植物的正構烷烴和正構烷酸產生的時間和數量的差異，以及葉蠟和水源水δ2H組成的季節(jié)變化.Xia Z Y等[18]表明了纖維素和降水δ18O之間的表觀富集因子隨著氣溫降低而增加.目前大部分的研究主要集中在植物樣品中單一生物標志物穩(wěn)定同位素與環(huán)境氣候的響應關系，而對于植物特定器官特定位置中不同生物標志物的系統性同位素測定研究報道相對較少.網狀脈的荷葉葉片具有尺寸大的優(yōu)勢，可以在同一葉片的不同片段中(<500 mg)提取葉片水、正構烷烴、α-纖維素以及脂肪酸，并通過單一葉片不同生物標志物的穩(wěn)定同位素空間分布樣式，進一步研究葉片水分同位素富集信號如何通過光合作用和后光合作用的復雜生物化學反應，進入合成的不同有機質當中(圖1)，為葉片中不同生物標志物同位素信號用于氣候、環(huán)境和代謝研究提供理論基礎.

圖1 部分生物標志物的合成圖

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

1.1.1 化學試劑

二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯，均為色譜純，Adamas-beta；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、亞氯酸鈉均為分析純，天津大茂化學試劑廠；200-300目柱層析用硅膠，青島海洋化工有限公司；14%三氟化硼-甲醇，Sigma-Aldrich；十八烷酸，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；十六烷酸，河北百靈威超精細材料有限公司.

1.1.2 儀器設備

冷凍干燥機，Alpha 2-4 LD plus，CHRIST；超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；真空線路；真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；層析柱，欣維爾玻璃儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)冷卻器，鄭州長城科工貿有限公司；磁力攪拌器，鞏義市子華儀器有限責任公司；全自動研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；超純水制造系統，西安優(yōu)普儀器設備有限公司；氣相色譜，Agilent technologies 7890B；Trace 1300/ISQ氣質聯用儀，ThermoFisher Scientific；同位素比質譜儀，MAT 253 Plus IRMS.

1.2 樣品采集

野外種植的荷葉葉片于2021年7月～2021年9月在陜西科技大學(陜西，西安)進行采摘.從莖部切下完整葉片，由中心向邊緣分為6圈，每圈細分為4個小段，總計24個片段(如圖2所示，每段編號細分并按字母順序從中心到邊緣標記).

圖2 荷葉葉片切割圖

1.3 實驗方法

用于水提取的葉片段立即密封在預先標記和預冷卻的塑料管中，并在野外用干冰冷凍，在水提取前放入實驗室冰箱中冷凍保存.提水完畢后，再提取烷烴，脂肪酸和α-纖維素，實驗流程如圖3所示.

圖3 實驗流程圖

1.3.1 葉片水提取

使用真空提取線路進行冷凍蒸餾提取葉片水.通常在提取的初始和最后階段達到<1 Pa的真空，確保葉片水提取完全，以降低由于冷卻蒸餾所導致的同位素分餾效應.提取的水通過0.22 μm PTFE過濾器，以去除可能干擾同位素分析的雜質顆粒.

1.3.2 樣品制備

將提水完畢的荷葉片段(采集于陜西科技大學)使用全自動研磨儀將樣品磨成粉狀.

研磨基本參數：研磨預設頻率，60 Hz；研磨運行時間，30 s；2次.

1.3.3 烷烴提取

(1)超聲法[19]

稱取300 mg的荷葉粉末于50 mL具塞離心管中，加入15 mL二氯甲烷-甲醇(2∶1，v/v)溶液，室溫下超聲三次，每次40 min過濾收集上清液，將收集到的上清液進行旋蒸，得到蠟質總提取物.提取物以正己烷做淋洗劑，經活化后的硅膠柱(200～300目)，將其分離為烷烴組分和其他組分，其他組分用乙酸乙酯淋洗后進行保存.

(2)索氏抽提法[20]

取250 mL二氯甲烷-甲醇(2∶1，v/v)溶液，倒入500 mL平底燒瓶中，搭建索氏抽提裝置，取300 mg樣品用濾紙包裹起來放置在抽提管中，75 ℃加熱24 h.汽化的溶劑被冷凝循環(huán)水冷卻，在索氏提取器中儲存，實現對有機質的反復提取，接著用柱層析的方法分離烷烴組分.

1.3.4 混合脂肪酸提取及甲酯化

(1)皂化法[21]

取100 mg荷葉樣品，加入10 mL 1 mol/L NaOH-CH3OH溶液，于70℃加熱回流1 h，得到脂肪酸鈉鹽.待冷卻至室溫后，離心取上清液.轉移至分液漏斗中，加入少量正己烷反復洗滌水相3次以除去小極性物質.使用1 mol/L的HCl溶液將水相pH調節(jié)至1-2，轉移至分液漏斗中加入正己烷萃取3次，合并有機相.用飽和NaCl溶液反洗有機相，隨后在有機相中加無水硫酸鈉干燥，旋蒸，得到混合脂肪酸.

(2)系統性提取皂化法

在章節(jié)1.3.3中，正己烷淋洗過后的硅膠柱，再用乙酸乙酯淋洗出剩余的有機質及色素，置于50 mL圓底燒瓶中，旋蒸，再加入10 mL 1mol/L NaOH-CH3OH溶液，于70 ℃加熱回流1 h.待冷卻至室溫后.轉移至分液漏斗中，加入少量正己烷反復洗滌水相3次以除去小極性物質.使用濃度為1 mol/L的HCl溶液將水相pH調節(jié)至1-2，轉移至分液漏斗中加入正己烷再進行反復3次的萃取，合并有機相.用飽和NaCl溶液反洗有機相，隨后在有機相中加無水硫酸鈉進行干燥，將上清液盛放至旋蒸瓶中旋蒸除去溶劑，得到混合脂肪酸.

(3)脂肪酸甲酯化

向混合脂肪酸樣品中加入1mL 14% BF3-CH3OH溶液，在75 ℃下回流攪拌30 min，反應結束冷卻至室溫，加入1 mL超純水淬滅過量的BF3，再用正己烷萃取，反復2次.收集合并有機相得到混合脂肪酸甲酯.

1.3.5 α-纖維素提取

利用Zhou等[22]開發(fā)的方法提取纖維素.向1.3.3中超聲后剩余的沉淀物里加入30 mL 17%NaOH溶液，室溫下超聲40 min，離心去除上清液，反復3次.用1%的鹽酸將該體系的pH調節(jié)為中性，離心去除上清液.向該體系中加入NaClO2溶液(亞氯酸鈉∶冰醋酸∶水=1.2∶1∶105)，放入烘箱中60 ℃條件下烘1 h，反復3次.最后將該體系中的pH調節(jié)為中性，進行凍干，得到高純度α-纖維素.

2 結果與討論

2.1 不同生物標志物的GC-MS分析

采用Trace 1300/ISQ氣質聯用儀(ThermoFisher Scientific)對烷烴和脂肪酸甲酯進行定性分析.

(1)氣相色譜條件

正構烷烴：采用HP-5(30 m×0.250 mm×0.25 μm)毛細管柱，進樣口溫度為300 ℃.該組分測定時程序升溫條件為：80 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速度升至240 ℃，之后以10 ℃/min的速度升至310 ℃，保持時間為10 min.載氣流速為1.2 mL/min.以He為載氣，進樣體積1 μL.

脂肪酸甲酯：采用HP-5(30 m×0.250 mm×0.25 μm)毛細管柱，進樣口溫度為300 ℃.該組分測定時程序升溫條件為：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速度升至210 ℃，之后以4 ℃/min的速度升至245 ℃，最后以10 ℃/min的速度升至310 ℃，保持時間為5 min.載氣流速為1.2 mL/min.以He為載氣，進樣體積1 μL.

(2)質譜條件

EI離子源；離子源溫度為280 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，電子能量為70 eV，發(fā)射電流為50 μA，電子倍增電壓為1818.8 V；質量范圍50～650 amu.

2.1.1 烷烴總離子色譜圖

烷烴GC-MS色譜如圖4所示.從分析譜圖可以獲得荷葉葉片內所含烷烴種類及其相對含量，具體見表1所示.

圖4 正構烷烴部分總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)

表1 荷葉葉片中正構烷烴的GC/MS結果

2.1.2 脂肪酸甲酯總離子色譜圖

脂肪酸甲酯GC-MS色譜如圖5所示.分析譜圖可以獲得荷葉葉片內所含脂肪酸種類及其相對含量，具體見表2所示.

圖5 混合脂肪酸甲酯部分總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)

表2 荷葉葉片中脂肪酸的GC/MS結果

2.2 不同提取方法對烷烴提取率的影響

為了用更少量的植物樣品提取出足夠的烷烴，我們對比了索氏抽提法以及超聲抽提法.各取300 mg葉片分別進行索氏法和超聲法提取正構烷烴，通過GC-MS檢測，并對每個色譜峰進行定性.考察不同提取方法對烷烴提取率的影響(圖6).結果發(fā)現，對于系統性提取荷葉中的水、正構烷烴、脂肪酸以及纖維素，超聲法提取率更高，對于后續(xù)測定GC-IRMS時更有優(yōu)勢.因此接下來的實驗過程中將使用超聲法進行正構烷烴的提取工作.

圖6 正構烷烴提取方法對比

2.3 十六烷酸、十八烷酸定量分析

采用氣相色譜(Agilent technologies 7890B)對混合脂肪酸中的十六烷酸、十八烷酸進行定量.

2.3.1 色譜條件

采用HP-5 MS(30 m×0.250 mm×0.25 μm)毛細管柱，進樣口溫度為300 ℃.該組分測定時升溫程序為：初始溫度70 ℃保持2 min；10 ℃/min升溫至300 ℃保持3 min.以N2為載氣，進樣體積1 μL.

2.3.2 標準曲線的繪制

分別配制十六烷酸、十八烷酸甲酯標準品1.1 mg/mL、1.2 mg/mL，分別移100 μL，150 μL，200 μL，250 μL標準儲備液，用正己烷定容至1 mL，然后進行氣相色譜分析.以標準液濃度(Concentration)為橫坐標，對應的色譜峰面積(Area)為縱坐標繪制標準曲線，分別得到十六烷酸甲酯、十八烷酸甲酯的標準曲線分別為Area=4 960.6*Concentration-366.82，R2=0.995 1，p<0.05，n=4；Area=3 560.9*Concentration-319.87，R2=0.991 4，p<0.05，n=4，如圖7、圖8所示.

圖7 十六烷酸甲酯標準回歸線

圖8 十八烷酸甲酯標準回歸線

2.4 皂化法與系統性提取皂化法之間的對比

衍生后對兩者分別進行GC分析，將測得的峰面積代入回歸方程，并計算出樣品中十六烷酸、十八烷酸的含量.皂化法提取的十六烷酸、十八烷酸分別為0.414 mg/g、0.262 mg/g；優(yōu)化后的皂化法提取的十六烷酸、十八烷酸分別為0.225 mg/g、0.183 mg/g.由于優(yōu)化后的方法與正構烷烴的提取具有連貫性，所使用的樣品依然為提正構烷烴的300 mg樣品，不需要重新取100 mg，所以優(yōu)化后的皂化法更符合系統性提取水、烷烴、脂肪酸以及α-纖維素的要求.

2.5 α-纖維素紅外分析

按照1.3.5的步驟，干燥后的纖維素通過Bruker-INVENIO傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)進行掃描測試，其掃描分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4 000～400 cm-1.荷葉的紅外光譜分析結果如圖9所示.

圖9 荷葉纖維素的紅外光譜分析

由圖9可知，1 064.63 cm-1和896.83 cm-1處的峰，是纖維素中β-D葡萄糖苷鍵的特征吸收峰，3 409.89 cm-1處的強寬峰與纖維素分子中羥基的氫鍵O-H伸縮振動有關，2 904.58 cm-1處的峰與纖維素分子中C-H伸縮振動有關.1 622.01 cm-1處的峰應來源于纖維素的吸附水，1 402.14 cm-1處的峰歸屬于纖維素C-H和C-O的彎曲振動.

2.6 不同生物標志物的IRMS分析

2.6.1 GC-C-IRMS分析

使用Trace GC 1300GC、MAT 253 Plus IRMS，Isolink轉換單元、Conflo IV通用接口和AS 1310自動進樣器組成的GC-C-IRMS對實驗樣品進行分析.氣相色譜升溫程序與2.1保持一致.分離后的化合物通過Isolink轉換單元在1 000 ℃的氧化還原管中轉換為CO2，然后通過Conflo IV通用接口將CO2和其他副產物氣體吹掃到IRMS中.在電離室中，CO2氣體被電離為[12C16O16O]+、[13C16O2，12C16O17O]+和[12C16O18O，13C16O17O]+.通過檢測m/z=44，45和46的信號，使用ISODAT 3.0數據處理軟件，確定荷葉中正構烷烴和脂肪酸的δ13C值.

圖10、圖11分別為荷葉中正構烷烴和脂肪酸甲酯的C同位素的GC-IRMS圖.可以看出，從少量荷葉樣品中提取出的正構烷烴以及脂肪酸的量是足夠用來分析的.

圖10 荷葉正構烷烴GC-C-IRMS圖

圖11 荷葉脂肪酸GC-C-IRMS圖

2.6.2 EA-IRMS分析

本研究中，植物氧(δ18O)同位素比率的質譜測定采用在線(online)分析測試系統完成，將葉片水和α-纖維素分別用液體以及固體自動進樣器進行進樣，用高溫裂解元素分析儀(TC/EA)連接MAT-253-Plus氣體穩(wěn)定同位素質譜儀，在1360℃高溫下分別將葉片水和纖維素樣品裂解轉化為CO，再通過ConFlo IV將CO引入穩(wěn)定同位素比質譜儀(IRMS)測定18O/16O的比率.測量結果以相對維也納標準平均海水(VSMOW)千分差(δ，‰或者mUr)表示，δ18O的誤差范圍控制在±0.5‰.

不同部位葉片水與纖維素的O同位素值趨勢如圖12所示.由圖可以觀察到，荷葉中葉片水與纖維素的O同位素值由葉心至葉邊緣明顯增加.

圖12 不同部位葉片水與纖維素O同位素值趨勢

3 結論

為了將單一荷葉葉片進行更細致的劃分從而對整個葉片的同位素空間分布有更精確的探究，本實驗提出了用極少量的荷葉葉片可以系統性提出盡可能多的且足夠的水、正構烷烴、脂肪酸以及α-纖維素的方法，并對其進行了表征以及同位素的測定.對比了提取正構烷烴的超聲法和索氏抽提法之間的差異，并對提取脂肪酸的皂化法進行了優(yōu)化，得到如下結論：

(1)在提取荷葉中烷烴時，相同用量超聲法的效果最佳.

(2)系統性提取的皂化法更適用于本實驗的流程，可以達到單個葉片利用的最大化.

(3)各個荷葉切片提出的正構烷烴和脂肪酸足夠用來測GC-IRMS.

(4)在荷葉中，葉片水與纖維素的O同位素值由葉心至葉邊緣明顯增加.