侯燕紅， 生小燕， 韓 博， 姜 華， 何承剛

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650201)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種適口性好，蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)價值全面，利用年限長，分布極其廣泛的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草。隨著全球氣候變暖并伴隨著降水量減少的形勢不斷加劇，高溫和干旱已經(jīng)成為制約紫花苜蓿生產(chǎn)的一個難題。在中國南方，紫花苜蓿生長主要受高溫的限制，因此，突破高溫限制是實現(xiàn)其在該地區(qū)的開發(fā)與利用的關(guān)鍵[1]。同時，干旱也嚴重影響著苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，研究表明干旱和高溫在自然環(huán)境中通常會伴隨出現(xiàn)，兩者同時出現(xiàn)對植物生長和產(chǎn)量的危害比單獨出現(xiàn)更大[2]。光合作用是植物生長發(fā)育過程中極其重要的生理過程[3]，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)是C4植物光合作用的重要關(guān)鍵酶之一，其功能是催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpymvate，PEP)和碳酸氫根離子的反應(yīng)，生成草酰乙酸(Oxaloacetate，OAA)和無機磷酸(Inorganic phosphate，Pi)，這是C4植物和景天酸代謝植物同化與固定CO2的重要步驟，是植物光合作用必不可少的一步[4]。PEPC在高等植物、藻類、細菌中廣泛存在[5]，目前，PEPC基因相繼在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)、大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)、水稻(OryzasativaL.)、玉米(ZeamaysL.)、甘蔗(Saccharumofficinarum)等植物中得到鑒定[6～9]。研究表明，PEPC參與了植物逆境脅迫的應(yīng)答[10]，關(guān)于這方面的研究近年來也有很多。丁在松等[11]研究轉(zhuǎn)PEPC基因水稻在不同程度干旱脅迫下的光合特性，發(fā)現(xiàn)PEPC增強了干旱脅迫下水稻抵御強光脅迫的能力。Jeanneau等[12]研究發(fā)現(xiàn)，玉米在適度干旱條件下，PEPC基因過表達能使其水分利用率和干物質(zhì)積累量增加。方立鋒等[13]研究轉(zhuǎn)PEPC基因水稻苗期抗旱性，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力均高于對照。趙晉峰等[14]從谷子基因中篩選出6個PEPC基因，得出SiPEPC基因廣泛參與了谷子苗期非生物逆境脅迫應(yīng)答。張慶琛等[15]研究了強光脅迫下玉米PEPC基因等對擬南芥光合特性的影響，發(fā)現(xiàn)強光處理下PEPC轉(zhuǎn)基因擬南芥的光合速率顯著高于正常處理，進而獲得較高的生物量。另外也有研究表明，植物在面對干旱、冷害、強光、鹽和低磷等非生物逆境脅迫時[16-20]，PEPC基因均能夠被強烈誘導(dǎo)并表達，說明植物在面對非生物逆境脅迫時PEPC在其中發(fā)揮著一定作用。

當前，對于各種植物在逆境脅迫下的研究比較廣泛，有關(guān)于紫花苜蓿在干熱脅迫下Rubisco羧化酶和活化酶活性變化及其基因表達的研究[21]，也有紫花苜蓿的耐鹽基因[22]、抗逆基因[23]等的研究，但是對于紫花苜蓿在干旱和高溫脅迫下PEPC基因的研究比較缺乏。因此，本研究以抗逆性均較強的‘阿爾岡金’紫花苜蓿和云南省德欽縣野生紫花苜蓿為材料，測定兩者在高溫脅迫和干旱脅迫下的PEPC酶活性，并擴增了PEPC基因，對PEPC蛋白進行了生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，為提高高溫和干旱條件下紫花苜蓿的生物產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的2個材料為采集于云南省迪慶州德欽縣奔子欄鄉(xiāng)干熱河谷區(qū)的野生紫花苜蓿和引自加拿大的‘阿爾岡金’紫花苜蓿，前者在云南干熱河谷地區(qū)干熱條件下能夠繁衍后代，能較好適應(yīng)類似云南迪慶的生態(tài)條件，具有較強的抗旱性，后者抗逆性強，適應(yīng)性廣。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用盆栽方式，每盆種植20～30粒均勻飽滿的紫花苜蓿種子，放置于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實習(xí)基地溫室內(nèi)，選取3～4片葉期的幼嫩葉片存放于-80℃冰箱中用于DNA的提取及PEPC基因的擴增。每個品種隨機選取生長150 d并且長勢一致的6盆材料，每盆10株。其中3盆進行干旱脅迫處理，將其置于室內(nèi)并在常溫(溫度23℃，濕度40%)下處理，開始處理后不再澆水；另外3盆進行干熱脅迫處理，將其放入人工氣候箱，空氣濕度設(shè)定為30%，白天溫度為32℃保持14 h，夜間溫度為28℃保持10 h。分別于脅迫處理前(對照)以及脅迫處理后第4 h，8 h，12 h，16 h，24 h，4 d，8 d，12 d以及復(fù)水(恢復(fù)為處理前的濕度和溫度，并澆水至花盆底部有水溢出為止)后2 d(在圖表中用r表示)，取相同部位葉片經(jīng)液氮處理后置于-80℃冰箱中，用于PEPC酶活性的測定(試驗做了3個技術(shù)重復(fù)，3個生物學(xué)重復(fù))。

1.3 試驗內(nèi)容與方法

1.3.1PEPC酶活性測定 酶液提取和活性測定參照BERVEILLER等的方法[22]。(1)提取液制備：0.01%(v/v)Triton X-100；1 mmol·L-1EDTA；50 mmol·L-1Tris-HCl,pH 7.8；10 mmol·L-1MgCl2；10 mmol·L-1dtt；(2)酶液提?。涸陬A(yù)冷研缽中放入稱好的0.25 g新鮮葉片后加入液氮迅速研磨，隨后加4 ml預(yù)冷提取液，在冰浴中研磨至勻漿，4℃、15 000 g離心15 min，取上清液保存于-20℃條件下備用；(3)酶活性測定：反應(yīng)體系為1 mL 100 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，0.1 mL酶提取液，1 mL 10 mmol·L-1MgCl2，1 mL 10 mmol·L-1NaHCO3，0.2 mL 40 mmol·L-1PEP，0.3 mL 1 mg·mol·mL-1NADH(pH 8.9)，0.3 mL 12 U·mL-1蘋果酸脫氫酶。反應(yīng)液混勻，28℃水浴10 min，用200 μL PEPC提取液啟動反應(yīng)，測定波長在340 nm處的吸光度。酶活性計算公式如下：

其中ΔA為反應(yīng)前后的差值，V為反應(yīng)體系總體積，d(cm)為比色光程，6.22為每微摩爾NADH在340 nm處的吸光度，2表示每固定1 mol CO2有2 mol NADH被氧化，Δt為測定時間，V酶為酶液體積。計算結(jié)果單位為μmol·g-1·min-1。

1.3.2DNA提取 取葉期的紫花苜蓿3～4幼嫩葉，采用上海生工生物工程股份有限公司的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取紫花苜蓿的DNA。

1.3.3PCR擴增 在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上搜索已知紫花苜蓿的PEPC基因序列，利用網(wǎng)站(sg.idtdna.com)進行引物設(shè)計：F(GACCTACCCATCTTGCTATCTTG)，R(CTCCAAAGCCCAACCATACT)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括上下游引物各1 μL，Taq PCR Mix預(yù)混液12.5 μL，模板DNA0.5 μL，ddH2O 10 μL。擴增程序為95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，33個循環(huán)，72℃延伸7 min。

1.3.4產(chǎn)物回收及測序 將經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后的PCR擴增產(chǎn)物進行回收純化并測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和折線圖采用Excel 2010軟件進行。采用單因素方差分析法對同一材料不同條件下的差異顯著性(P<0.05)進行分析，對不同材料同一處理條件之間顯著性差異(P<0.05和P<0.01)作獨立樣本T檢驗，單因素方差分析和獨立樣本T檢驗均采用SPSS 23.0軟件進行。采用DNAMAN 8.0軟件將本試驗的紫花苜蓿PEPC基因核酸序列翻譯成蛋白質(zhì)并作多序列比對，利用Protparam軟件分析并預(yù)測紫花苜蓿PEPC蛋白的理化性質(zhì)。在NCBI網(wǎng)站上將測序結(jié)果進行比對后，用DNAMAN 8.0軟件對本研究的兩個材料以及NCBI網(wǎng)站上下載的鷹嘴豆(Cicerarietinum，XM_004488973.2)、紫花苜蓿(Medicagosativa，M83086.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XM_003596337.4)和菜豆(Phaseolusvulgaris，XM_007133140.1)6個PEPC蛋白序列間同源關(guān)系進行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下紫花苜蓿PEPC酶活性變化

兩種紫花苜蓿PEPC酶活性變化隨脅迫時間的延長都呈現(xiàn)出先上升后下降、再上升再下降、復(fù)水后上升的趨勢(圖1)，在脅迫第12 h達到峰值，且顯著高于其他處理(P<0.05)，此時野生紫花苜蓿的PEPC酶活性是脅迫前的14.3倍，‘阿爾岡金’紫花苜蓿是脅迫前的9.2倍；兩種紫花苜蓿PEPC酶活性在復(fù)水后均顯著高于脅迫結(jié)束時(P<0.05)。野生紫花苜蓿PEPC酶活性在脅迫第16 h、4 d和復(fù)水后極顯著高于相同條件下的‘阿爾岡金’紫花苜蓿(P<0.01)，在脅迫第12 h和24 h顯著高于‘阿爾岡金’紫花苜蓿(P<0.05)，其他條件下兩種紫花苜蓿PEPC酶活性之間均無顯著差異。

圖1 高溫脅迫下紫花苜蓿PEPC酶活性變化Fig.1 Changes of PEPC activity in Alfalfa under high temperature stress注：大寫字母表示野生紫花苜蓿各項處理間的差異顯著性(P<0.05)，小寫字母表示‘阿爾岡金’紫花苜蓿各項處理間的差異顯著性(P<0.05)；*和**分別表示在相同條件下不同材料之間在0.05和0.01水平存在顯著性差異，下同Note:Lowercase letters indicated the significant difference between the treatments of Medicago stativa ‘Algonquin’ and wild alfalfa (P<0.05),uppercase letters indicated the significant difference between the treatments of Medicago stativa ‘Algonquin’ alfalfa(P<0.05). * and ** indicate significant differences between tested materials under same treatment time at the 0.05 and 0.01 level,respectively,the same as below

2.2 干旱脅迫下紫花苜蓿PEPC酶活性變化

野生紫花苜蓿PEPC酶活性變化隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)先上升、后下降、復(fù)水后上升的趨勢，而‘阿爾岡金’紫花苜蓿呈現(xiàn)先上升后下降、再上升再下降、復(fù)水后上升的趨勢(圖2)；兩種紫花苜蓿均在在脅迫第12 h達到峰值，且顯著高于其他處理(P<0.05)，此時野生紫花苜蓿的PEPC酶活性是脅迫前的14.8倍，‘阿爾岡金’紫花苜蓿是脅迫前的12.7倍；兩種紫花苜蓿PEPC酶活性在復(fù)水后均顯著高于脅迫結(jié)束時(P<0.05)。野生紫花苜蓿PEPC酶活性在脅迫第16 h，8 d，12 d和復(fù)水后極顯著高于相同條件下的‘阿爾岡金’紫花苜蓿(P<0.01)，在脅迫第8 h和12 h顯著高于‘阿爾岡金’紫花苜蓿(P<0.05)，其他條件下兩種紫花苜蓿PEPC酶活性之間均無顯著差異。

圖2 干旱脅迫下紫花苜蓿PEPC酶活性變化Fig.2 Changes of PEPC activity in Alfalfa under drought stress

2.3 紫花苜蓿PEPC基因PCR擴增結(jié)果

兩種紫花苜蓿PEPC基因PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測(圖3)均得到一條清晰明亮的條帶。野生紫花苜蓿和‘阿爾岡金’紫花苜蓿擴增序列長度分別為739 bp和750 bp，且兩份材料的序列均與Genbank中紫花苜蓿PEPC基因序列(M83086.1)相似率為100%，與蒺藜苜蓿PEPC基因序列(XM_003596337.4)相似率為99%。結(jié)果表明，獲得的兩份紫花苜蓿材料的目的片段均屬于PEPC基因家族。

2.4 紫花苜蓿PEPC蛋白理化性質(zhì)

表1可以看出，野生紫花苜蓿和‘阿爾岡金’紫花苜蓿的分子量分別為25.886和26.501 KDa，氨基酸總數(shù)分別為228和233 aa；理論等電點均大于7，為帶正電荷蛋白；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)均大于4，均屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性平均系數(shù)均為負數(shù)，預(yù)測均為親水性蛋白。

圖3 兩種紫花苜蓿PEPC基因PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis of PEPC gene in two alfalfa species注：1,‘阿爾岡金’紫花苜蓿;2,野生紫花苜蓿Note:1, Medicqgo stativa‘ Algonquin’;2,Native Medicago stativa

表1 兩種紫花苜蓿PEPC蛋白理化性質(zhì)Tab 1 Physicochemical properties of PEPC proteins in two alfalfa species

2.5 紫花苜蓿PEPC基因遺傳距離分析

紫花苜蓿PEPC蛋白同源性分析結(jié)果顯示(表2)，野生紫花苜蓿和蒺藜苜蓿與紫花苜蓿之間，以及紫花苜蓿和蒺藜苜蓿之間同源性較高，均為1；‘阿爾岡金’紫花苜蓿與野生紫花苜蓿、紫花苜蓿和蒺藜苜蓿之間一致性均大于0.9；菜豆與其他5個近緣種間相似性較低，均小于0.5。

表2 紫花苜蓿6個近緣種間PEPC蛋白同源性分析Tab 2 Homology of PEPC proteins sequences among 6 related species of alfalfa

2.6 紫花苜蓿PEPC基因系統(tǒng)發(fā)育分析

對野生紫花苜蓿、‘阿爾岡金’紫花苜蓿及4個PEPC基因近緣種間轉(zhuǎn)錄蛋白同源關(guān)系進行比較，結(jié)果顯示(圖4)：野生紫花苜蓿、紫花苜蓿和蒺藜苜蓿以100%的支持率聚為一組，這一組與‘阿爾岡金’紫花苜蓿聚為一支，支持率為96%；四種苜蓿與鷹嘴豆的同源關(guān)系為78%，而與菜豆同源關(guān)系最遠，其關(guān)系距離為47%。

圖4 紫花苜蓿6個近緣種的PEPC蛋白同源關(guān)系樹Fig.4 PEPC proteins sequence homology tree of 6 related species of Alfalfa

3 討論

PEPC酶不同程度地增強了植物抵御和適應(yīng)外界脅迫的能力，幫助植物適應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫，同時，植物的PEPC酶活性在外界脅迫下可增強[25-27]。本研究中，兩種紫花苜蓿PEPC酶活性隨著脅迫時間的延長，大致呈先增加后降低的趨勢，當植物感應(yīng)到脅迫時，會啟動脅迫應(yīng)激機制來抵御和適應(yīng)外來影響[28]。兩種脅迫條件下，兩種紫花苜蓿均在脅迫第12 h出現(xiàn)峰值，可能是此時達到了紫花苜蓿自我調(diào)節(jié)所能承受的極限，PEPC酶活性在此之后則表現(xiàn)出下降的趨勢，當受脅迫的紫花苜蓿未到死亡極限時給予復(fù)水，紫花苜蓿植株受到的脅迫減輕并脫離脅迫臨界點后，PEPC酶活性又開始增強以便應(yīng)對脅迫。在相同處理條件下，‘阿爾岡金’紫花苜蓿的PEPC酶活性基本上都低于野生紫花苜蓿，可能因為野生紫花苜蓿原本就生長在干熱河谷極端惡劣的自然環(huán)境中[29]，已經(jīng)適應(yīng)了干熱環(huán)境下形成的特殊自我保護機制。兩種脅迫條件下在復(fù)水前均可觀察到一個滯緩期，表明紫花苜蓿PEPC酶對植株復(fù)水的反應(yīng)是一個長期反應(yīng)，這可能與基因表達強度的減弱有關(guān)[30]。兩種紫花苜蓿PEPC酶活性在復(fù)水后可完全恢復(fù)到脅迫前的水平，甚至高于脅迫前的水平，這說明植物PEPC酶對植物的作用是一個可逆過程，這與雷明月等[31]的研究結(jié)果一致。

本試驗獲得的野生紫花苜蓿和‘阿爾岡金’紫花苜蓿的PEPC核酸序列長度分別為739和750 bp，分別編碼228和233個氨基酸，在氨基酸序列比對中，兩種不同紫花苜蓿PEPC基因氨基酸序列極度保守，具有高度的一致性，這與趙晉鋒等[32]的研究結(jié)果一致。兩種紫花苜蓿PEPC蛋白的分子量、等電點、親水系數(shù)和蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，與在水稻[33]、大豆[34]和油菜(BrassicanapusL.)[35]等植物上的研究結(jié)論相似。

兩個紫花苜蓿材料與4個近緣種間PEPC蛋白同源性分析中，野生紫花苜蓿與蒺藜苜蓿和紫花苜蓿之間，以及紫花苜蓿與蒺藜苜蓿之間同源性均為1，相似性較高，說明其氨基酸結(jié)構(gòu)差異比較??；菜豆與其他5個近緣種間差異性較大，相似性均小于0.5，說明他們之間親緣關(guān)系較遠。將兩個紫花苜蓿材料聯(lián)合4個近緣種的PEPC蛋白進行系統(tǒng)進化分析，野生紫花苜蓿、紫花苜蓿和蒺藜苜蓿以100%的支持率聚為一組，但不能單純從它們的序列相似性來推測其PEPC基因具有相似功能，還需要考慮其啟動子順式作用元件和非編碼區(qū)的差異[36]。而‘阿爾岡金’紫花苜蓿可能適應(yīng)了相對獨立的環(huán)境條件，導(dǎo)致其PEPC蛋白發(fā)生改變，從而其蛋白活性及功能也隨之發(fā)生改變。四種苜蓿與鷹嘴豆和菜豆的同源關(guān)系均較遠，表明PEPC在進化過程中既保留了較強的保守性，又在不同種屬間產(chǎn)生了差異[37]。

4 結(jié)論

干旱脅迫與干熱脅迫都對紫花苜蓿光合酶PEPC活性產(chǎn)生了較大的影響，其中，兩種脅迫下野生紫花苜蓿的酶活性基本高于‘阿爾岡金’紫花苜蓿，兩種紫花苜蓿PEPC蛋白均為不穩(wěn)定蛋白和親水性蛋白，且氨基酸序列保守性較高。