龍 鳳， 戶萌菲， 陳 勝， 劉小珍， 陳水紅

(塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

目前，大多數(shù)關(guān)于作物脅迫的研究主要集中在鹽脅迫上，鹽堿混合脅迫研究相對(duì)較少。然而，在自然界中，高濃度的鹽和高pH值經(jīng)常同時(shí)發(fā)生，它們的協(xié)同作用可能比單獨(dú)使用任何一種脅迫的影響對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育更有害[1]。植物受到堿脅迫時(shí)，通常會(huì)改變自身根莖葉形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理過(guò)程去適應(yīng)環(huán)境。植物主要通過(guò)表皮的增厚、葉片肉質(zhì)加厚、葉片縮小和改變濃密短柔毛的覆蓋等變化來(lái)增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[2]。有研究表明，能夠在高濃度堿脅迫下生長(zhǎng)的耐鹽植物，是由長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)改變特定的形態(tài)組織結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)逆境，降低鹽離子帶來(lái)的傷害[3]。了解禾草植物如何改變形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)應(yīng)對(duì)堿脅迫帶來(lái)的傷害，有助于為后期在飼用牧草和鹽堿地的改良方面提高理論基礎(chǔ)。

禾草內(nèi)生真菌是指在宿主禾草體內(nèi)度過(guò)部分或者全部生命周期，但不引起宿主植物任何癥狀的一類真菌[4]。目前，關(guān)于禾草內(nèi)生真菌的研究主要集中在子囊菌門(Ascomycota)麥角菌科(Clavicipitaceae)的香柱菌(Epichloё)屬[5]。在鹽堿脅迫下，禾草內(nèi)生真菌的侵染能夠提高宿主植物的對(duì)外界環(huán)境的耐受性和適應(yīng)性[6-8]。布頓大麥(Hordeumbogdanii)是一種耐鹽植物，它具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性以及競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，在作為飼用牧草和荒漠及鹽堿地改良草種等方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值[9]。目前關(guān)于布頓大麥-內(nèi)生真菌共生體的研究主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育[10-13]、生理生化[12,14]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[15]等方面，但該共生體在非生物脅迫下細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的響應(yīng)研究較少。因此，為了探究?jī)?nèi)生真菌侵染對(duì)宿主布頓大麥在堿脅迫條件下的顯微結(jié)構(gòu)是否有影響，本研究運(yùn)用石蠟切片技術(shù)觀察內(nèi)生真菌侵染對(duì)布頓大麥根、莖、葉在不同堿處理下各個(gè)顯微結(jié)構(gòu)的變化，為內(nèi)生真菌提高宿主布頓大麥耐堿性的生理機(jī)制提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室前期處理得到的溫宿縣E+與E-布頓大麥種子[15]，并鑒定種子中帶有內(nèi)生真菌屬于Epichloё屬[16]后，將種植在塔里木大學(xué)動(dòng)科試驗(yàn)站的試驗(yàn)田(80°76′E,41°58′N,海拔1 514 m)繁種子，收獲種子作為試驗(yàn)的材料。分別挑取E+，E-飽滿的種子進(jìn)行清水萌發(fā)，長(zhǎng)出子葉后，移栽入4 L水培盒中，每盆19孔，每孔1個(gè)苗。每盆連接一個(gè)充氧泵，每天定時(shí)進(jìn)行換氣，每3 d更換一次1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。溫室的晝/夜溫度為(28±2)℃/(15±3)℃，日照時(shí)長(zhǎng)約為12 h。待布頓大麥分蘗3～5株時(shí)，用李春杰等[17]的莖髓苯胺藍(lán)鏡檢法檢測(cè)布頓大麥?zhǔn)欠窈袃?nèi)生真菌，不帶菌的為E-，帶菌為E+。

1.2 堿脅迫處理

混合堿(Na2CO3∶NaHCO3=1∶1)處理，濃度梯度為50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，每個(gè)處理重復(fù)4次，為了減少堿沖擊效應(yīng)，每12 h遞增50 mmol·L-1堿(將前一次的堿溶液換成增加后的溶液)，直到所有處理達(dá)到預(yù)定濃度，未加混合堿的處理作為試驗(yàn)的對(duì)照，每7 d更換一次對(duì)應(yīng)濃度的混合堿溶液，至21 d取樣，進(jìn)行后期指標(biāo)測(cè)定。

1.3 顯微切片制作與觀察

將各堿處理E+和E-布頓大麥，分別根(分生區(qū))、莖(根頸)、葉(中央)剪成約1 cm小段，放裝有70% FAA(70%酒精∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5)青霉素小瓶中，然后用注射器抽取瓶中空氣使樣品沉入瓶底固定24 h。參照黃倩[18]的石蠟切片制作方法，固定完成后將材料取出進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚度為10 μm)、粘片、脫蠟、染色(番紅-固綠雙重染色)、封片(加拿大樹(shù)膠，solarbio公司CAS:8007-47-4)，最后用研究級(jí)正置生物顯微鏡(日本，尼康Nikon Eclipse Ci-L)觀察，利用NIS-Elements軟件進(jìn)行拍照并測(cè)量根的維管束面積、表皮厚度、內(nèi)皮層厚度和導(dǎo)管直徑，測(cè)量莖的維管束面積、氣腔直徑和表皮厚度，測(cè)量葉片的維管束面積、泡狀細(xì)胞面積、氣孔直徑和導(dǎo)管直徑。每個(gè)樣品測(cè)量3個(gè)樣本，每個(gè)樣本測(cè)量8個(gè)視野，以平均值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(IBM SPSS Statistics 26)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用雙因素方差分析方法檢測(cè)堿處理和內(nèi)生真菌對(duì)布頓大麥根莖葉顯微結(jié)構(gòu)的影響，采用單因素ANOVA方差分析法檢測(cè)不同堿濃度處理對(duì)E+和E-布頓大麥根莖葉顯微結(jié)構(gòu)的影響。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)同一堿濃度下E+和E-根莖葉顯微結(jié)構(gòu)的影響。統(tǒng)計(jì)顯著性差異定義在95%置信水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對(duì)布頓大麥植株根的顯微結(jié)構(gòu)影響

由圖1可知，布頓大麥根部結(jié)構(gòu)主要由維管束、內(nèi)皮層和表皮組成。堿脅迫對(duì)布頓大麥根的細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響較為明顯。隨著堿濃度的升高，根部細(xì)胞外皮層從50 mmol·L-1開(kāi)始出現(xiàn)皺縮和破裂，到100 mmol·L-1處根部細(xì)胞外表皮層皺縮加深。另外，E+植株根中的導(dǎo)管數(shù)明顯高于E-植株。由表1可知在0 mmol·L-1時(shí)維管束面積E+顯著高于E-(P<0.05)；堿處理后布頓大麥的維管束面積在縮小，在50 mmol·L-1處E+與E-的維管束面積差異不顯著，但在100 mmol·L-1處E+的維管束面積顯著高于E-(P<0.05)。堿脅迫導(dǎo)致對(duì)根的導(dǎo)管直徑增加，E+的導(dǎo)管直徑長(zhǎng)于E-。堿脅迫對(duì)根的表皮厚度的影響，在無(wú)堿處理下表皮厚度E+與E-無(wú)顯著差異，但在堿脅迫下E+的表皮厚度顯著高于E-；同時(shí)，布頓大麥內(nèi)皮層隨著堿濃度的升高植株根內(nèi)皮層在不斷加厚，在50 mmol·L-1處E+顯著高于E-的(P<0.05)。雙因素方差分析后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌和堿處理顯著影響維管束面積、導(dǎo)管直徑、表皮厚度和內(nèi)皮層厚度；除了導(dǎo)管直徑以外，上述指標(biāo)的內(nèi)生真菌與堿處理兩者之間存在交互作用(P<0.05)。

表1 堿脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)布頓大麥根結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of endophytic fungi on root structure of Hordeum bogdanii under alkali stress

圖1 不同堿濃度對(duì)E+和E-布頓大麥根的橫切顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of different alkali concentrations on the transverse microstructure of E+ and E- Hordeum bogdanii roots注：A，B，C分別為E+ 0 mmol·L-1，E+ 50 mmol·L-1，E+ 100 mmol·L-1；D，E，F(xiàn)分別為E- 0 mmol·L-1，E-50 mmol·L-1，E- 100 mmol·L-1；En，內(nèi)皮層；VB，維管束；Ve，導(dǎo)管；EP，表皮；標(biāo)尺為200 μm，放大倍數(shù)為20×10Note:A,B and C are E+ 0 mmol·L-1,E+ 50 mmol·L-1 and E+100 mmol·L-1 respectively;D. E and F are E- 0 mmol·L-1,E- 50 mmol·L-1 and E- 100 mmol·L-1 respectively;En,endothelial layer;VB,vascular bundle;Ve,catheter;Ep,epidermis;Scale is 200 μm,the magnification is 20×10

2.2 堿脅迫對(duì)布頓大麥植株莖的顯微結(jié)構(gòu)影響

不同濃度堿脅迫對(duì)E+和E-布頓大麥莖的顯微結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖2和表2。由表2可知，堿脅迫對(duì)布頓大麥E+和E-維管束面積無(wú)顯著影響，并且E+與E-在維管束面積上無(wú)顯著差異。堿脅迫縮小了E+植株的氣腔直徑，對(duì)E-無(wú)顯著影響；在0 mmol·L-1和100 mmol·L-1堿脅迫發(fā)現(xiàn)E+的氣腔直徑顯著長(zhǎng)于E-(P<0.05)。隨著堿濃度的增加莖的表皮厚度在逐漸增加。由表2雙因素方差分析可知，堿脅迫和內(nèi)生真菌顯著影響表皮厚度，但兩者之間不存在交互作用。

表2 堿脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)布頓大麥莖結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of stem structure of Hordeum bogdanii by endophytic fungi under alkali stress

圖2 不同堿濃度對(duì)E+和E-布頓大麥莖的橫切顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of different alkali concentrations on the transverse microstructure of E+ and E- Hordeum bogdanii stems注：A，B，C分別為E+ 0 mmol·L-1，E+ 50 mmol·L-1，E+ 100 mmol·L-1;D，E，F(xiàn)分別為E- 0 mmol·L-1，E- 50 mmol·L-1，E- 100 mmol·L-1；En，內(nèi)皮層；VB，維管束；AC，氣腔；EP，表皮；標(biāo)尺為200 μm，放大倍數(shù)為10×10Note:A,B and C are E+ 0 mmol·L-1,E+ 50 mmol·L-1 and E+ 100 mmol·L-1 respectively;D,E and F are E- 0 mmol·L-1,E- 50 mmol·L-1 and E- 100 mmol·L-1 respectively;En,endothelial layer;VB,vascular bundle;AC,air chamber;Ep,epidermis;Scale is 200 μm,the magnification is 10 × 10

2.3 堿脅迫對(duì)布頓大麥植株葉的顯微結(jié)構(gòu)影響

從圖3葉片的顯微結(jié)構(gòu)圖可知，布頓大麥的上下表皮細(xì)胞大小不規(guī)則，上下表皮都存在氣孔，泡狀細(xì)胞只存在于上表皮。隨著堿濃度的升高，布頓大麥葉的維管束面積逐漸降低，泡狀細(xì)胞的細(xì)胞面積增大，同一堿濃度處理下E+的維管束面積和泡狀細(xì)胞面積高于E-，并且維管束面積達(dá)到顯著水平(P<0.05)。堿脅迫縮小了E-的導(dǎo)管直徑，但對(duì)E+的導(dǎo)管直徑無(wú)顯著影響，在100 mmol·L-1堿濃度下E+的導(dǎo)管直徑顯著大于E-(P<0.05)。在葉片氣孔直徑中發(fā)現(xiàn)50 mmol·L-1堿濃度處理下E+的顯著大于E-(P<0.05)。通過(guò)雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)堿脅迫顯著影響布頓大麥葉的維管束面積、泡狀細(xì)胞面積、導(dǎo)管直徑以及氣孔直徑；內(nèi)生真菌顯著影響葉片的維管束面積和氣孔直徑(P<0.05)，但內(nèi)生真菌和堿脅迫不存在交互作用(表3)。

表3 堿脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)布頓大麥葉結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of leaf structure of Hordeum bogdanii by endophytic fungi under alkali stress

圖3 不同堿濃度對(duì)E+和E-布頓大麥葉的橫切顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of different alkali concentrations on the transverse microstructure of E+ and E- Hordeum bogdanii leaves注：A，B，C分別為E+ 0 mmol·L-1，E+ 50 mmol·L-1，E+ 100 mmol·L-1;D，E，F(xiàn)分別為E- 0 mmol·L-1，E-50 mmol·L-1，E- 100 mmol·L-1；VB，維管束，Ve，導(dǎo)管；St，氣孔；MC，泡狀細(xì)胞；標(biāo)尺為200 μm，放大倍數(shù)為20×10Note：A,B and C are E+ 0 mmol·L-1,E+ 50 mmol·L-1 and E+ 100 mmol·L-1 respectively;D,E and F are E- 0 mmol·L-1,E- 50 mmol·L-1 and E- 100 mmol·L-1 respectively;VB,vascular bundle；Ve,catheter;St,air hole;MC,vesicular cells;Scale is 200 μm,the magnification is 20×10

3 討論

植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)總是與環(huán)境相適應(yīng)。逆境環(huán)境影響植物生長(zhǎng)，并可引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化[19]。維管束是主要輸水組織，堿脅迫導(dǎo)致根的維管束橫截面面積減小，韌皮部和木質(zhì)部的傳導(dǎo)能力明顯減弱[20]。趙海新等[21]的研究也證實(shí)了堿脅迫可促使植物根系維管束數(shù)目減少、木質(zhì)化程度加強(qiáng)、導(dǎo)管數(shù)量增加等方式來(lái)提高根的運(yùn)輸能力。此外，陳泰祥[22]研究發(fā)現(xiàn)堿脅迫對(duì)野大麥的生長(zhǎng)影響強(qiáng)于鹽脅迫；內(nèi)生真菌侵染減緩了宿主野大麥(Hordeumbrevisubulatum)在鹽脅迫下根和莖的皮層厚度的降低趨勢(shì)，增強(qiáng)了根的內(nèi)皮層厚度的增高趨勢(shì)；同時(shí)內(nèi)生真菌也減緩了葉片厚度、維管束的降低趨勢(shì)[23]。本研究與陳泰祥的研究結(jié)果相似，堿脅迫導(dǎo)致布頓大麥根維管束橫截面積減小，木質(zhì)化程度加深，導(dǎo)管直徑變大，這些結(jié)構(gòu)的變化可能是布頓大麥為了適應(yīng)堿脅迫帶來(lái)的損壞做出的響應(yīng)。同時(shí)，植物在受到外界環(huán)境的刺激下，植物會(huì)增加表皮厚度和內(nèi)皮層厚度來(lái)防止體內(nèi)水分過(guò)分的蒸騰，保持水分，并起著機(jī)械支持作用[24]。內(nèi)生真菌的存在對(duì)植物顯微結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，真菌侵染與葉片木質(zhì)部、葉片韌皮部、莖維管束、莖木質(zhì)部導(dǎo)管和根間木質(zhì)部面積顯著相關(guān)。在NaCl脅迫下，Epichlo?內(nèi)生真菌侵染對(duì)野大麥的葉脈、莖表皮、根皮層和根內(nèi)皮層厚度增加有關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，Epichlo?內(nèi)生真菌提高布頓大麥根的維管束面積、增加導(dǎo)管直徑、表皮厚度和內(nèi)皮層厚度，說(shuō)明堿脅迫條件下，Epichlo?內(nèi)生真菌的侵染對(duì)宿主細(xì)胞起到一定的保護(hù)能力，提高了宿主植物對(duì)水分和無(wú)機(jī)鹽的吸收能力，并減少水分的散失。

植物通過(guò)木質(zhì)部將根部吸收的水分和礦物質(zhì)往上運(yùn)輸?shù)降厣喜扛鳡I(yíng)養(yǎng)器官，地上部光合作用的產(chǎn)物則通過(guò)韌皮部向下運(yùn)輸至地下部，并將葉片產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)運(yùn)送到根內(nèi)或暫存莖內(nèi)[26]。據(jù)報(bào)道，堿脅迫導(dǎo)致草木犀(Melilotusofficinalis)莖稈側(cè)面的維管束大量減少和上、下表皮厚度增加[20]。本研究對(duì)E+和E-植株的莖在不同濃度堿脅迫下的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)莖中維管束與髓部薄壁細(xì)胞都發(fā)達(dá)。在堿脅迫下，莖通過(guò)表皮厚度、維管組織髓結(jié)構(gòu)的改變來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。莖的表皮厚度隨著堿濃度增大逐漸加厚，說(shuō)明植物通過(guò)增加表皮厚度減少機(jī)體水分的散失。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在0 mmol·L-1和100 mmol·L-1E+植株的氣腔直徑顯著高于E-，因氣腔主要功能是有利于器官中的細(xì)胞呼吸時(shí)的氣體交換，所以我們推測(cè)Epichlo?內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物在堿脅迫時(shí)細(xì)胞呼吸有促進(jìn)作用。

葉是植物進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官，因結(jié)構(gòu)特征的變化最能體現(xiàn)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)[27]，所以研究最多的器官是葉[28-29]。葉脈在水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸中發(fā)揮著重要的生理作用[30]。在堿脅迫下草木犀小葉的上、下表皮細(xì)胞壁增厚，減少了葉片非氣孔路徑的水分流失以及在200 mmol·L-1堿濃度處理后，木質(zhì)部導(dǎo)管直徑減少了47 %，增加了蒸騰阻力[20]。ARAFA等[31]發(fā)現(xiàn)，較高水平的鹽脅迫(3 000和6 000 ppm NaCl)降低了高粱木質(zhì)部和韌皮部組織厚度、葉片厚度、維管束尺寸以及后生木質(zhì)部導(dǎo)管直徑。本研究通過(guò)觀察堿脅迫下E+和E-植株葉片顯微結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨著堿濃度的增加葉片維管束面積變小，導(dǎo)致水分、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物質(zhì)的輸送能力減弱，使得葉肉細(xì)胞得不到充足的養(yǎng)分，所以在顯微結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出葉肉細(xì)胞體積變小。泡狀細(xì)胞與葉的卷曲和伸開(kāi)的作用有關(guān)，在水分吸收和保持細(xì)胞水勢(shì)中起一定的作用，本研究發(fā)現(xiàn)堿脅迫使泡狀細(xì)胞下陷較深，面積變大，使得在缺水時(shí)快速將葉片卷曲，減少水分的散失，這與鹽脅迫下小花堿茅(P.tenuiflora)葉片泡狀細(xì)胞的研究結(jié)果一致[32]，但E+植物較E-植株泡狀細(xì)胞下陷更深，面積變大，表明堿脅迫下Epichloё內(nèi)生真菌能有效的防止布頓大麥葉肉細(xì)胞內(nèi)水分的丟失。氣孔直徑的變化可以看出E+的先升后降，但堿處理后E+的氣孔直徑始終大于0 mmol·L-1時(shí)的氣孔直徑；E-無(wú)顯著影響，說(shuō)明Epichloё內(nèi)生真菌具有促進(jìn)布頓大麥氣體交換能力。

4 結(jié)論

在堿脅迫下，內(nèi)生真菌的侵染影響了布頓大麥的顯微結(jié)構(gòu)。堿脅迫下Epichloё內(nèi)生真菌的侵染提高了根的維管束面積、增加了導(dǎo)管直徑、表皮厚度和內(nèi)皮層厚度，提高了植物對(duì)水分和無(wú)機(jī)鹽的吸收能力，增加對(duì)細(xì)胞的保護(hù)和減緩水分的散失；Epichloё內(nèi)生真菌增加了莖中氣腔直徑、表皮厚度和促進(jìn)維管組織中髓的發(fā)育；同時(shí)，葉的泡狀細(xì)胞面積和氣孔直徑變大，使得葉片的失水能力減弱；從而有效的防止布頓大麥葉肉細(xì)胞內(nèi)水分的丟失，促進(jìn)氣體交換能力。本研究從形態(tài)結(jié)構(gòu)方面證明了堿脅迫下Epichloё內(nèi)生真菌提高了宿主布頓大麥的耐受性。