沈柯辰，宋亞茹，高琳，張仁堂*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東棗尚好農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 泰安 271000）

紅棗為鼠李科棗屬植物，具有較高的營養(yǎng)價值和保健作用?，F(xiàn)在廣泛分布在黎巴嫩、印度、中國、韓國、朝鮮、美國等36個國家的亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]。根據(jù)相關(guān)文獻報道，我國大棗產(chǎn)量位居全球榜首，占世界產(chǎn)量的90%以上[2]。據(jù)國家統(tǒng)計局統(tǒng)計，2019年我國棗總產(chǎn)量達到746.40萬噸。

紅棗是我國居民日常膳食中的重要果品，因此研究紅棗中苯甲酸及農(nóng)藥殘留含量對消費者安全至關(guān)重要。

苯甲酸又稱安息香酸，是一類芳香族羧酸，在酸奶、果汁、蜂蜜、牛乳[3-6]等食品中作為添加劑應(yīng)用廣泛。孫屏等[7]在31份駿棗樣品中發(fā)現(xiàn)苯甲酸含量為74 mg/kg～95 mg/kg。蘇敏等[8]證實本底苯甲酸的存在，并測定122批干制紅棗樣品，初步明確了天然苯甲酸的本底值范圍普遍小于0.15 g/kg。李曉等[9]研究發(fā)現(xiàn)紅棗中苯甲酸含量受生長周期、品種、加工方式的影響。目前測定苯甲酸的方法主要有高效液相色譜法、衍生分光光度法、氣相色譜法及WinMLR程序等[10-16]，測定蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法及液相色譜-質(zhì)譜法等。Zhao等[17]以多壁碳納米管為吸附劑，采用氣相色譜和質(zhì)譜法對紅棗中的16種農(nóng)藥進行殘留分析。Liu等[18]測定我國紅棗中的殺蟲劑、殘留水平等，研究發(fā)現(xiàn)紅棗中最常檢測到的農(nóng)藥是有機氯農(nóng)藥且25%的樣品殘留量高于我國的最高殘留限量，目前針對紅棗的苯甲酸及農(nóng)藥殘留的研究較少。

紅棗經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵黑化技術(shù)處理得到新型紅棗加工產(chǎn)品。該技術(shù)主要與美拉德反應(yīng)有關(guān)，即紅棗自身含有的羰基與游離氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)[19]。經(jīng)固態(tài)黑化發(fā)酵后，黑棗中的蔗糖、果糖等營養(yǎng)成分、三萜酸、環(huán)磷酸腺苷、總酸、總酚含量及抗氧化能力等均有不同程度的增加[20-23]。目前國內(nèi)外的研究主要集中在感官特性、理化特性、抗氧化活性、多糖等方面[24-27]，但目前對黑化過程中內(nèi)源性苯甲酸及農(nóng)藥殘留的變化研究鮮少報道。因此，本文通過紅棗固態(tài)發(fā)酵黑化過程中苯甲酸及農(nóng)藥殘留含量的變化研究，明確加工過程中的安全性，為紅棗固態(tài)發(fā)酵黑化技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圓鈴棗、木棗、駿棗：山東國仁堂食品科技有限公司。

苯甲酸標準品（1 000 μg/mL）：上海源葉生物科技有限公司；21種農(nóng)藥標準品（毒死蜱、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、螺螨酯、吡唑醚菌酯、噻螨酮、甲維鹽、滅幼脲、戊唑醇、啶蟲脒、吡蟲啉、多菌靈、阿維菌素、甲基托布津、代森錳鋅可濕性粉劑、福美鋅、苯菌靈、氯蟲苯甲酰胺、螨死凈）（純度均≥98%）：天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：山東禹王和天下新材料有限公司；其它試劑均為分析純。

液相色譜儀（LC-20A）、InerSustain C18液相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMST8030）：日本島津公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent6460）：美國 Agilent公司；VF-Wax ms氣相柱（0.25 mm×60 m×0.25 μm）：美國瓦里安有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（101-2E3）：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE）：昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R-3HB）：瑞士Buchi公司。

1.2 方法

1.2.1 紅棗固態(tài)發(fā)酵黑化樣品制備

分別將圓鈴棗、木棗、駿棗洗凈，按料液比1∶5（g/mL）復(fù)水1 h（復(fù)水后水分含量約21%），取出后瀝干，分別放入透明密封袋后密封，放入恒溫鼓風干燥箱中，設(shè)定溫度70℃，3個品種紅棗每12 h各取出100 g[21]，去核后均質(zhì)，備用。

1.2.2 苯甲酸的測定

1.2.2.1 樣品前處理

準確稱取圓鈴棗、木棗、駿棗各2g（精確到0.001g）于50 mL離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50℃水浴超聲20 min，冷卻至25℃后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8 000 r/min離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘渣中加水20 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r/min離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

1.2.2.2 苯甲酸測定方法

苯甲酸參照GB 5009.28—2016《食品安全國家標準食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》[28]中的第一法測定。

1.2.3 農(nóng)藥殘留的測定

參照李安等[29]的研究方法，結(jié)合紅棗種植過程中常用農(nóng)藥品種的實際情況，選擇21種農(nóng)藥（毒死蜱、氯氰菊酯、噻螨酮、戊唑醇、吡唑醚菌酯、溴氰菊酯、螺螨酯、高效氯氟氰菊酯、啶蟲脒、高效氯氰菊酯、多菌靈、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅幼脲、吡蟲啉、阿維菌素、甲基托布津、福美鋅、苯菌靈、四螨嗪、氯蟲苯甲酰胺及代森錳鋅可濕性粉劑）作為研究對象。

1.2.3.1 樣品前處理

稱取圓鈴棗5.0g于50mL離心管中，加乙腈15mL，振蕩5 min，加氯化鈉1.5 g振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于另一離心管中，殘渣中加乙腈15 mL，重復(fù)提取2次，合并2次上清液，于45℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇2 mL溶解殘余物，加水4 mL，混勻備用，木棗、駿棗均按照上述步驟進行前處理，備用。

1.2.3.2 萃取柱萃取

石墨化碳黑柱用5 mL乙腈活化，將1.2.3.1得到的圓鈴棗提取液倒入活化好的石墨化碳黑柱中，用12 mL乙腈洗脫，收集洗脫液；過C18柱依次用甲醇5 mL、三氯甲烷5 mL、甲醇5 mL和甲醇水溶液5 mL活化，取備用液過柱，控制流速1滴/s。用甲醇水溶液5 mL淋洗，流干，加4 mL苯洗脫，收集洗脫液，備用；過氧化鋁柱用5 mL乙腈活化，取備用洗脫液過柱。加1 mL苯洗脫，重復(fù)3次。合并3次洗脫液于10 mL離心管中，用苯定容至5 mL，進行測定，木棗、駿棗提取液均按上述步驟進行萃取。

1.2.3.3 農(nóng)藥殘留測定方法

參照GB 23200.8—2016《食品安全國家標準水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》[30]、GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[31]、GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[32]、NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》中的方法進行測定[33]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22進行聚類分析和主成分分析并用Origin 2021軟件作圖，所有試驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標準差表示。聚類分析和主成分分析前對數(shù)據(jù)進行標準化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗黑化過程中苯甲酸的變化

3種紅棗黑化過程中苯甲酸含量變化見圖1。

圖1 3種紅棗黑化過程中苯甲酸含量變化Fig.1 Changes in benzoic acid content in three varieties of jujube during the process of blackening

由圖1可知，駿棗中初始內(nèi)源苯甲酸含量最高，達到79.62 mg/kg，其次為圓鈴棗、木棗。固態(tài)發(fā)酵黑化過程中，圓鈴棗在黑化前后苯甲酸含量明顯降低，由65.41 mg/kg降低至40.90 mg/kg，下降了37.47%。木棗中苯甲酸含量整體變化較小，到達黑化終點時降低不明顯，含量為27.50 mg/kg。駿棗在黑化的前12 h中，苯甲酸含量迅速升高，達到最大值后又迅速下降，到達終點時低于初始含量。

因此，3種紅棗經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵黑化后，內(nèi)源性苯甲酸含量均有所降低但降幅不同，圓鈴棗降幅最大。3種棗的苯甲酸含量經(jīng)黑化后均有不同程度地降低且黑化后含量均不超過80 mg/kg，符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織的規(guī)定，不超過每日最大允許攝入量5 mg/kg bw[34]。

2.2 紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留含量比較分析

3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留種類及含量變化見表1。

表1 3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留種類及含量變化Table 1 The pesticide residues of three jujube varieties during the process of blackening

續(xù)表1 3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留種類及含量變化Continue table 1 The pesticide residues of three jujube varieties during the process of blackening

由表1可知，3種紅棗中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅幼脲、吡蟲啉、阿維菌素、甲基托布津、福美鋅、苯菌靈、四螨嗪、氯蟲苯甲酰胺、代森錳鋅可濕性粉劑共10種農(nóng)藥在黑化前后含量均為0。另外，3種紅棗黑化前后毒死蜱含量未超過20 μg/kg、氯氰菊酯與噻螨酮含量未超過 200 μg/kg、戊唑醇含量未超過 50 μg/kg、螺螨酯含量未超過80 μg/kg、溴氰菊酯含量未超過5 μg/kg、吡唑醚菌酯含量未超過 100 μg/kg，這 7 種農(nóng)藥在3個品種紅棗黑化前后均存在但均符合GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[34]規(guī)定的最大殘留量。

圓鈴棗黑化前后測出9種農(nóng)藥殘留，其中多菌靈和高效氯氟氰菊酯超過檢出限但未超出最大殘留限量，其余7種物質(zhì)均未超出檢出限，菊酯類農(nóng)藥殘留在干制過程中含量會有所升高[35]，其中黑化后高效氯氟氰菊酯含量由 16.17 μg/kg 升高至 19.39 μg/kg；木棗黑化前后測出7種農(nóng)藥殘留，均未超過最大殘留限量且黑化前后含量基本保持不變。

駿棗黑化前后11種農(nóng)藥殘留比較見圖2。

圖2 駿棗黑化前后11種農(nóng)藥殘留比較Fig.2 Comparison of 11 pesticide residues in Junzao before and after blackening

由圖2可以看出，駿棗黑化前檢測出9種農(nóng)藥殘留，黑化后測出8種物質(zhì)，其中啶蟲脒含量經(jīng)過黑化由45.82μg/kg降為0，由于黑化后棗的總酸含量增加，pH值減小，啶蟲脒在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定發(fā)生降解[36]，因此黑化后未測出啶蟲脒，其他種類農(nóng)藥殘留含量黑化后整體較黑化前有不同程度降低。

結(jié)合表1與圖2的結(jié)果可知，黑化前后3個品種中木棗的農(nóng)藥殘留種類最少、含量最低且黑化前后變化最??；駿棗黑化前后含量變化最為明顯；黑化后，部分農(nóng)藥殘留明顯降低，證明固態(tài)發(fā)酵黑化加工后安全性更好。

2.3 紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸聚類及熱圖分析

3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸聚類分析見圖3。

圖3 3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸聚類分析Fig.3 Clustering of pesticide residues and benzoic acid content in three varieties of jujube before and after blackening

由圖3可知，當樣品通過聚類分析分成4類時，黑化圓鈴棗為一類，圓鈴棗為一類，駿棗為一類，木棗、黑化木棗、黑化駿棗為一類。通過聚類分析可以更直觀地看出不同品種紅棗經(jīng)固態(tài)發(fā)酵黑化前后的農(nóng)藥殘留含量差別，可以根據(jù)這種差別挑選目標品種，進行原料挑選時，可根據(jù)對農(nóng)藥殘留的敏感種類及程度挑選合適品種。

為了進一步研究3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留和苯甲酸含量變化情況，對3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸含量進行熱圖分析，結(jié)果見圖4。

圖4 3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸含量熱圖Fig.4 Heat map of pesticide residues and benzoic acid content of three jujube varieties before and after blackening

如圖4所示，黑色越淺代表含量越高，顏色越深則代表含量越低。3種紅棗中駿棗的農(nóng)藥殘留含量和苯甲酸含量明顯高于其他兩個品種，而木棗中的含量最低。駿棗中啶蟲脒含量最高，且其他菊酯類農(nóng)藥殘留量也較高。3種紅棗黑化前農(nóng)藥殘留及苯甲酸含量明顯高于黑化后含量，其中駿棗黑化前后的農(nóng)藥殘留和苯甲酸含量變化最大。由此可以看出固態(tài)發(fā)酵黑化加工后的紅棗安全性更好。

2.4 紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸主成分分析

采用主成分分析法對3種紅棗在黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸含量方面的差異進行評價。選取苯甲酸及11種農(nóng)藥殘留指標進行分析。以特征值大于1為判定依據(jù)，得到4個主成分，其對應(yīng)的特征值相關(guān)變量見表2。

表2 3種紅棗農(nóng)藥殘留及苯甲酸主成分特征值相關(guān)變量Table 2 Eigenvalues and variance explained of principal components of pesticide residues and benzoic acid content in three jujube varieties

由表2可知，4個主成分代表全部變化的96.503%，其中主成分1代表了全部變化的48.408%，主成分2解釋了21.698%的變化。

3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸含量主成分圖見圖5。

圖5 3種紅棗黑化前后農(nóng)藥殘留及苯甲酸含量主成分圖Fig.5 Principal component plot of pesticide residues and benzoic acid content in three jujube varieties before and after blackening

如圖5所示，主成分1與高效氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、螺螨酯、吡唑醚菌酯、啶蟲脒、戊唑醇、苯甲酸的含量呈正相關(guān)，同時與高效氯氟氰菊酯、多菌靈、毒死蜱呈負相關(guān)。主成分2與吡唑醚菌酯、氯氰菊酯、戊唑醇呈負相關(guān)。圖5中箭頭長短代表農(nóng)藥殘留含量高低，可以看出木棗黑化前后苯甲酸及農(nóng)藥殘留含量相對較少且變化較小，駿棗黑化前后變化最大，結(jié)論與前面農(nóng)殘含量對比的結(jié)果一致。3個品種紅棗之間苯甲酸及農(nóng)藥殘留含量有明顯差異，同一品種紅棗黑化前后苯甲酸及農(nóng)藥殘留種類變化不大，可用于不同棗品種間的鑒別。

3 討論與結(jié)論

有研究表明棗中內(nèi)源性苯甲酸的產(chǎn)生與其生長過程中的次級代謝有關(guān)[37]，棗在生長過程中發(fā)生次級代謝，苯丙氨酸解氨酶催化生成肉桂酸，再經(jīng)CoA依賴型β氧化途徑產(chǎn)生苯甲酸及其代謝產(chǎn)物[38]，且紅棗中苯甲酸含量受生長周期、品種、加工方式的影響[9]。本研究對圓鈴棗、木棗、駿棗3個品種紅棗黑化前后苯甲酸含量進行了比較分析。研究發(fā)現(xiàn)，駿棗中初始內(nèi)源性苯甲酸含量最高，經(jīng)黑化后3種紅棗的苯甲酸含量均有不同程度地降低且黑化后含量均不超過80 mg/kg，其中圓鈴棗變化最為明顯，整個黑化過程中苯甲酸含量均符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織的規(guī)定，不超過每日最大允許攝入量5 mg/kg bw。另外，3個品種紅棗黑化后農(nóng)藥殘留含量也均符合食品安全國家標準規(guī)定，遠低于食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定。圓鈴棗、木棗、駿棗3種紅棗經(jīng)固態(tài)發(fā)酵黑化后苯甲酸、農(nóng)藥殘留含量均降低，證明紅棗經(jīng)固態(tài)發(fā)酵黑化加工后安全性更好。通過聚類分析和主成分分析，可以更直觀地對品種進行分類，為品種篩選鑒別及后續(xù)原料選擇提供依據(jù)。