羅 磊，夏迎利，楊浩昆，趙一帆，李瀚姝，馬 瀟

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000）

牡丹花色澤艷麗，素有“花中之王”的美譽(yù)，我國自古就有食用牡丹花的習(xí)慣，現(xiàn)已形成多種地方特色名吃，如牡丹鮮花餅、牡丹花銀耳湯等[1]。2013年丹鳳牡丹被國家衛(wèi)生部列為一種新資源食品原材料，被眾多研究者開發(fā)與利用。

我國牡丹種植面積已超過30萬 畝，除具有極高的觀賞價(jià)值外，花期過后其籽可產(chǎn)油，根皮可入藥，花瓣宜食用，而牡丹花蕊由于沒有得到很好的開發(fā)，出現(xiàn)大量資源浪費(fèi)的現(xiàn)象。牡丹花蕊是牡丹之精華，碳水化合物和蛋白質(zhì)含量高，脂肪酸構(gòu)成較健康，能降低人體血壓，具有較好的抗氧化效果，對(duì)人體生理代謝以及膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)具有重要作用。研發(fā)者應(yīng)加大對(duì)牡丹花蕊功能成分、加工特性以及食品開發(fā)方面的研究，為牡丹花蕊資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)，有利緩解資源浪費(fèi)的局面。

近年來，國內(nèi)外眾多研究者發(fā)現(xiàn)將植物蛋白添加到面粉中可以提高面制品的營養(yǎng)品質(zhì)，改善面團(tuán)的特性，影響面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而可以提高面制品的質(zhì)量[2-3]。大豆蛋白是一種高純度蛋白，因其產(chǎn)量高、價(jià)格便宜、營養(yǎng)豐富，常被作為食品改良劑應(yīng)用于肉制品、面制品、乳制品等食品中[4]。有研究表明，將大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）添加到面粉中，蛋白質(zhì)和面筋蛋白含量顯著增高，面條口感較好，斷條率明顯減少。在生產(chǎn)面包時(shí)加入不超5%的SPI可改善面包表皮色澤，增大面包體積，增加風(fēng)味，營養(yǎng)增補(bǔ)效果明顯。應(yīng)用于餅干生產(chǎn)時(shí)，可提高其保水性，延長產(chǎn)品貨架期[5]。牡丹花蕊作為藥食同源的植物原料，蛋白質(zhì)含量占干質(zhì)量的23.73%，氨基酸組成合理，其中必需氨基酸占比為38.26%，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以SPI添加量作比較，研究牡丹花蕊蛋白對(duì)面團(tuán)質(zhì)構(gòu)和動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性影響以及對(duì)面筋蛋白二硫鍵含量、表面微觀結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等特性的影響，為牡丹花蕊蛋白在面制品開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹花蕊：丹鳳，采自洛陽牡丹園；小麥粉（標(biāo)準(zhǔn)粉：蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.07%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.58%）一加一天然面粉有限公司；SPI 源葉生物科技有限公司；L-半胱氨酸 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙二胺四乙酸 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸上海藍(lán)季生物公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)合肥博美生物科技有限公司；β-巰基乙醇 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SMS TA.XT Epress Enhanced食品物性分析儀 美國Stable Micro Systems Ltd.公司；VERTEX70傅里葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀 德國Bruker公司；DHR2流變儀 美國TA儀器有限公司；TM3000臺(tái)式電鏡 日立高新技術(shù)公司；DSC-1型差示掃描量熱儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 面團(tuán)的制作

以小麥粉質(zhì)量為基準(zhǔn)，參考韓暢等[7]的方法略作修改，將牡丹花蕊粗蛋白粉末和SPI分別按照0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例與小麥面粉混合均勻，稱取適量面粉于揉面機(jī)內(nèi)，加入65%蒸餾水，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，將面團(tuán)用保鮮膜包好，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 面筋蛋白的制備

參考馮勇等[8]的方法稍作修改，采用手洗法進(jìn)行面筋蛋白的洗滌。分別稱取小麥面粉0%、2%、4%、6%、8%、10%的花蕊蛋白和SPI與面粉混合均勻，加入65%蒸餾水混合揉成均勻面團(tuán)，在室溫下靜置20 min，然后用蒸餾水反復(fù)水洗，期間要注意及時(shí)換水以利于洗滌效率高，洗至水澄清遇碘不變藍(lán)即得到面筋蛋白。然后將其進(jìn)行冷凍干燥處理，得到干燥的面筋蛋白放置自封袋4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的測定

利用食品物性分析儀對(duì)面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行測定，測定前將面團(tuán)制作為邊長為1.5 cm的正方體，選擇P/36R圓柱形探頭，測試前速率為2.0 mm/s，測試中速率為1.0 mm/s，測試后速率為1.0 mm/s，壓縮比為50%，觸發(fā)力為5.0 g，兩次壓縮間隔為5 s，數(shù)值精確到0.01。

1.3.3 面團(tuán)流變學(xué)特性的測定

稱取適量面團(tuán)，放置流變儀平臺(tái)上，參考楊勇等[9]的方法略有改動(dòng)。采用頻率掃描模式研究牡丹花蕊蛋白和SPI對(duì)面團(tuán)動(dòng)態(tài)流變學(xué)的影響。選用直徑為40 mm的平板，下降平板至1050 μm，刮去平板外多出的樣品，然后下降至剪切間隙為1000 μm，設(shè)置平臺(tái)溫度25 ℃，應(yīng)變量1.0%，掃描頻率為1.0～10.0 Hz，測定儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G”）的變化。

1.3.4 面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)分析

參照Gómez等[10]的方法略有修改。將冷凍干燥后的面筋蛋白，使其自然斷面，用鑷子選出大小合適、樣品表面平整的樣品，用導(dǎo)電膠帶把樣品固定在電鏡樣品臺(tái)，然后放置噴金儀上進(jìn)行噴金處理使樣品導(dǎo)電，將處理好的樣品置于掃描電子顯微鏡下，調(diào)節(jié)最佳視野和放大倍數(shù)進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.5 面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用傅里葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀進(jìn)行面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。參考馬薇薇等[11]的方法略作修改，取樣品1 mg與干燥KBr 100 mg充分研磨，用壓片機(jī)壓成透明或均勻半透明的薄片，在4 cm-1分辨率下進(jìn)行掃描測定，掃描波段為4000～400-1對(duì)每個(gè)樣品掃描32 次。用Omnic8.2和Perkfit4.0軟件選取酰胺I帶、基線校準(zhǔn)、卷積處理、二階導(dǎo)數(shù)擬合、多次擬合等，通過計(jì)算峰面積確定各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.6 面筋蛋白巰基和二硫鍵的測定

參考張瑩瑩等[12]的方法略有改動(dòng)。Ellman試劑：將20 mg 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶于5 mL Tris-Gly緩沖液中，配制0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，尿素8 mol/L，1% SDS和3 mmol/L EDTA），混合均勻后，配制成2 mmol/L的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，梯度稀釋為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mmol/L和0.06 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取4 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入0.1 mL的Ellman試劑，混合均勻，在室溫下進(jìn)行顯色反應(yīng)20 min后，以等量蒸餾水替代標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白對(duì)照，在412 nm波長處測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

游離巰基含量測定：分別稱取不同添加量面筋蛋白0.05 g，使其溶解于10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液中，反應(yīng)30 min后，在8000 r/min離心20 min，收集上清液。分別取4 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入0.1 mL的Ellman試劑，混合均勻，在室溫下進(jìn)行顯色反應(yīng)20 min后，以蒸餾水替代樣品作為空白對(duì)照，在412 nm波長處測定吸光度，根據(jù)繪制的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到面筋蛋白中的游離巰基含量。

二硫鍵含量測定：取測定游離巰基中離心后的上清液1 mL，加入4 mL的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液和0.1 mLβ-巰基乙醇充分混勻，在25 ℃水浴鍋內(nèi)保溫1 h，再加入10 mL的12%三氯乙酸溶液，混勻后繼續(xù)在25 ℃水浴鍋內(nèi)保溫1 h，8000 r/min離心20 min后取沉淀，并用三氯乙酸清洗沉淀3 次。加入10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液使其復(fù)溶，然后加入0.1 mL的Ellman試劑，在室溫下進(jìn)行顯色反應(yīng)20 min后，以蒸餾水替代樣品作為空白對(duì)照，在412 nm波長處測定吸光度，根據(jù)繪制的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到面筋蛋白中的總巰基含量。

面筋蛋白二硫鍵含量按下式計(jì)算：

式中：SHT為總巰基含量/（μmol/g）；SHF為游離巰基含量/（μmol/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS statistics 23進(jìn)行顯著性分析，運(yùn)用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 8.5軟件作圖，用Omnic 8.2和Perkfit4.0進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)圖譜分析，每組樣品做3 次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性質(zhì)分析

如表1所示，SPI和牡丹花蕊蛋白不同添加量對(duì)面團(tuán)質(zhì)構(gòu)的影響規(guī)律基本一致，都是隨著添加量增加面團(tuán)的硬度、黏著性、咀嚼性和回復(fù)性增加。當(dāng)牡丹花蕊蛋白添加量為6%時(shí)，面團(tuán)硬度、黏著性、咀嚼性比同量添加SPI分別高了20.73、17、42.93 g，說明與添加相同低量SPI相比，牡丹花蕊蛋白對(duì)提高面團(tuán)特性效果較明顯，而彈性、內(nèi)聚性、回復(fù)性與SPI相比差距不大。彈性和內(nèi)聚性逐漸降低，尤其是添加量超過6%時(shí)，加入花蕊蛋白的面團(tuán)彈性下降較明顯，導(dǎo)致下降的原因可能是添加蛋白限制了麥谷蛋白間二硫鍵的連接，使面筋功能特性受到破壞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得致密[13-15]。

表1 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量對(duì)面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響Table 1 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on texture properties of dough

2.2 面團(tuán)動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性分析

如圖1、2所示，添加牡丹花蕊蛋白和SPI對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性G’和G”的影響有相同規(guī)律，隨著蛋白添加量增加，G’和G”不斷上升。在相同頻率下，當(dāng)?shù)鞍滋砑恿坎怀^6%時(shí)，牡丹花蕊蛋白對(duì)面團(tuán)G’和G”的影響與大豆SPI對(duì)面團(tuán)影響相接近，這與面團(tuán)質(zhì)構(gòu)結(jié)果一致。原因可能是添加低量蛋白時(shí)，促進(jìn)了面團(tuán)中面筋蛋白相互作用生成新的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，面筋蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)加強(qiáng)，使面團(tuán)呈現(xiàn)較好的黏彈性[16-17]。圖中隨著牡丹花蕊蛋白添加量的增加，tanδ先增加后減小，當(dāng)取代量為4%時(shí)，tanδ達(dá)到最大值，說明面團(tuán)的黏性越大，而添加SPI的面團(tuán)，tanδ不斷減小。隨著頻率的不斷升高，圖1、2中的tanδ均呈先下降后上升的趨勢。這說明在低頻率下混合面團(tuán)的黏彈性較好，隨著頻率的不斷增高，黏彈性比迅速增大，說明在高頻率下混合體系結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，相對(duì)更容易遭到破壞[18]。

圖1 牡丹花蕊蛋白對(duì)面團(tuán)動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的影響Fig.1 Effect of peony stamen protein on the dynamic rheological properties of dough

圖2 SPI對(duì)面團(tuán)動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的影響Fig.2 Effect of SPI on dynamic rheological properties of dough

2.3 面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)觀察分析

從圖3、4可以看出，沒加蛋白質(zhì)的面筋蛋白表面氣孔完整、光滑、連續(xù)性較好，孔洞數(shù)量較多且大小均勻，但是孔洞較淺，持氣能力較弱。隨著兩種蛋白添加量增加，面筋蛋白的氣孔直徑逐漸增加，氣孔數(shù)量多且孔洞加深。當(dāng)?shù)鞍滋砑恿繛?%時(shí)，與SPI面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)相比，含花蕊蛋白的面筋蛋白氣孔數(shù)量多，洞壁較薄，連續(xù)性較好。這說明花蕊蛋白與面筋蛋白相互作用的能力大于SPI，使得麥醇溶蛋白通過非共價(jià)鍵和麥谷蛋白結(jié)合，促進(jìn)面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[19]。隨著添加量繼續(xù)增加，可以發(fā)現(xiàn)兩種面筋蛋白的有序性明顯減弱，與對(duì)照組相比較表面的光滑度和均勻度變差，孔徑變大、斷裂、孔洞壁變厚使面筋蛋白結(jié)構(gòu)變得松散。尤其是牡丹花蕊蛋白的添加量達(dá)到10%時(shí)，面筋蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)完全受到破壞，原因可能是添加的蛋白質(zhì)吸水性較強(qiáng)，加入較多蛋白質(zhì)會(huì)與面筋蛋白競相吸水，從而不利于面筋蛋白空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[20]，石長碩等[21]研究也證實(shí)了添加過量大豆蛋白會(huì)弱化谷朊粉中面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

圖3 牡丹花蕊蛋白添加量對(duì)面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of peony stamen protein on the microstructure of gluten proteins

圖4 SPI添加量對(duì)面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of SPI on the microstructure of gluten proteins

2.4 面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

如圖5所示，在3100～3500 cm-1處有吸收帶，添加牡丹花蕊蛋白和SPI與對(duì)照組相比都發(fā)生了紅移，這是碳水化合物結(jié)合O—H伸縮振動(dòng)吸收，與分子間氫鍵的連接相關(guān)[22]。從圖5可以看出，在2900～3000、1600～1700 cm-1和1510～1500 cm-1均出現(xiàn)了吸收峰，并且位置發(fā)生偏移，說明添加蛋白質(zhì)對(duì)面筋蛋白產(chǎn)生影響，酰胺I帶（主要為C＝O的伸縮振動(dòng)，1600～1700 cm-1）中包含α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)等信息，因此，常用來對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析[23]。從表2可以看出，當(dāng)花蕊蛋白添加量為6%時(shí)α-螺旋相對(duì)含量達(dá)到了最大值，相比空白組增加了10.24%，而添加SPI的α-螺旋相對(duì)含量不斷增加，添加量為10%時(shí)比空白組增加了19.52%。β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例隨著牡丹花蕊蛋白添加量增加先減少后增加，而隨著SPI的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，原因可能是蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸水性，使得體系中的自由水不斷減少，導(dǎo)致面筋蛋白中的氫鍵被破壞[24-25]。無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)會(huì)使蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定，花蕊蛋白的加入呈現(xiàn)無規(guī)律，SPI添加的面筋蛋白中含量在不斷上升，則說明添加過量蛋白會(huì)破壞面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。隨著蛋白添加量增加，含花蕊蛋白的面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要從β-轉(zhuǎn)角變成β-折疊，而加入SPI的面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)從β-折疊變成α-螺旋?；ㄈ锏鞍缀蚐PI添加量為6%時(shí)，α-螺旋＋β-折疊的占比達(dá)到最大值，分別為59.32%和61.95%，α-螺旋和β-折疊都是相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，有利于提高面制品的硬度和彈性[26]，這與前面研究面筋蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

圖5 不同牡丹花蕊蛋白和SPI添加量的面筋蛋白紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of gluten proteins added with different amounts of peony stamen protein or SPI

表2 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on the secondary structure of gluten proteins

2.5 面筋蛋白巰基和二硫鍵的測定分析

如表3所示，兩種蛋白對(duì)面筋蛋白二硫鍵影響基本一致，但SPI略好于牡丹花蕊蛋白。隨著添加量增加，游離巰基含量先下降后上升，而總巰基和二硫鍵含量呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，這是因?yàn)槎蜴I和巰基可通過氧化還原實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化。當(dāng)添加量為6%時(shí)，加入花蕊蛋白和SPI二硫鍵含量與對(duì)照組相比分別增加了1.98 μmol/g和3.24 μmol/g，添加適量蛋白質(zhì)可促進(jìn)面筋蛋白中的二硫鍵形成，維持空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。二硫鍵會(huì)使蛋白質(zhì)肽鍵間相互交聯(lián)，增加其機(jī)械強(qiáng)度和硬度，這可能是造成面團(tuán)中硬度不斷增加的原因之一。加入過量蛋白時(shí)，二硫鍵含量減少，這可能也是導(dǎo)致面團(tuán)彈性降低的主要因素之一，對(duì)應(yīng)的游離巰基含量不斷增加，與添加6%時(shí)分別增加了2.84 μmol/g和1.75 μmol/g，花蕊蛋白影響較大的原因可能是還原性相比SPI較強(qiáng)，使游離巰基形成過多，但游離巰基會(huì)使面筋的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)弱化，降低了面筋的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)性[27-28]。整體來說，適量添加牡丹花蕊蛋白可維持面筋蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

表3 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量對(duì)面筋蛋白巰基和二硫鍵含量的影響Table 3 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on the contents of sulfhydryl and disulfide bonds in gluten proteins

3 結(jié)論

牡丹花蕊蛋白能夠明顯提高面團(tuán)的硬度、黏著性和咀嚼性，添加量低于6%時(shí)效果優(yōu)于SPI，而彈性、內(nèi)聚性、回復(fù)性與SPI相比差距不大。流變性研究表明，添加蛋白提高了面團(tuán)G’和G”，當(dāng)花蕊蛋白添加量為4%時(shí)，面筋蛋白tanδ達(dá)到最大值，面團(tuán)的黏性較大。低添加量花蕊蛋白和SPI混合面團(tuán)都表現(xiàn)出較好的黏彈性。

掃描電鏡顯示，添加花蕊蛋白能夠改善面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，添加量為6%時(shí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連續(xù)性最好，氣孔數(shù)量多且孔洞深，改善效果略好于SPI。添加花蕊蛋白和SPI能夠促使面筋蛋白穩(wěn)定性差的β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊，添加量為6%時(shí)，α-螺旋＋β-折疊占比達(dá)到最大值，分別為59.32%和61.95%?；ㄈ锏鞍滋砑恿繛?%時(shí)，面筋蛋二硫鍵含量達(dá)到最高，與空白組相比提高了89%，SPI對(duì)二硫鍵含量的影響略優(yōu)于花蕊蛋白。