周昕?jī)x，游 剛，高可安，董詩(shī)瑜，馬舒恬，陳尚里，劉小玲,*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西 欽州 535011）

魚糜因其味美、方便、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而廣受公眾歡迎，近年來市場(chǎng)需求量劇增。為了滿足產(chǎn)品多樣化及獲得更佳的口感，常通過外加添加劑（淀粉、膳食纖維、蛋白質(zhì)）改善魚糜凝膠的品質(zhì)。淀粉[1]和膳食纖維[2]可在蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中充當(dāng)填充劑，使魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的持水性提高；而黃原膠、卡拉膠和魔芋葡甘聚糖[3]等則是通過改變蛋白系統(tǒng)的黏度，在魚糜制品中起到增稠和黏合的作用。

涼粉草多糖（Mesona chinensisBenth polysaccharide，MCP）是從藥食兩用的涼粉草中提取的多糖，因其成本低廉易獲取，同時(shí)又具有凝膠特性和降血脂[4]、抗氧化[5]等生物活性，因此MCP在蛋白基食品中的應(yīng)用備受關(guān)注?，F(xiàn)有研究證明，添加MCP能改善豬肉肉糜[6]、雞肉肌原纖維蛋白[7]、淀粉-魚糜混合體系[8]的質(zhì)構(gòu)及凝膠特性，也有助于提高產(chǎn)品的抗氧化能力。肌球蛋白作為肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)，其與肌肉組織的凝膠性和持水性等均存在密切聯(lián)系[9]，同時(shí)肌球蛋白聚集狀態(tài)受溫度影響，40 ℃凝膠化階段對(duì)蛋白凝膠結(jié)構(gòu)有重要意義[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)[8,11]，MCP可改善魚糜凝膠特性和感官特性，歸因于MCP-魚糜蛋白的相互作用促進(jìn)魚糜凝膠化。然而，MCP-魚肌球蛋白得相互作用機(jī)制尚不清晰。

因此，本實(shí)驗(yàn)探討40 ℃凝膠化條件下，不同MCP質(zhì)量濃度（0～0.10 mg/mL）對(duì)肌球蛋白（2 mg/mL）理化特性（電位、粒徑、表面疏水性、巰基）、結(jié)構(gòu)特性（紅外光譜、圓二色譜）和微觀結(jié)構(gòu)的影響。闡明肌球蛋白-MCP的相互作用機(jī)制，旨在為MCP在蛋白基食品中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鯧魚 沃爾瑪超市廣西南寧明秀西路分店；MCP純膠粉（食品級(jí)） 廈門興順祥泰食品有限公司。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）快速試劑盒 南京碧云天生物技術(shù)有限公司；彩虹245廣譜蛋白Marker、BAS標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)G-250、透析袋MD44 北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽 北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見光分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司；Nano-ZS90電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司；prepASH 340系列全自動(dòng)水分灰分測(cè)定儀 瑞士普利賽斯公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；MOS-450圓二色譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司；Nicolet iS 10傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；DMi8熒光倒置顯微鏡 德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 MCP的提取及理化測(cè)定

參照Xie Jianhua等[12]的方法制備MCP，稍作修改。將MCP純膠粉復(fù)溶于水，加2%乙酸鋅和2%亞鐵氰化鉀溶液[13]，攪拌，靜止30 min，去除多糖中的蛋白。9000 r/min離心20 min，上清液中加入無(wú)水乙醇稀釋至80%（V/V），4 ℃過夜，5000 r/min離心5 min；收集沉淀，復(fù)溶、醇沉，5000 r/min離心5 min（重復(fù)2 次）。用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌去除小分子雜質(zhì)[5]，透析60 h，凍干制得MCP，用干燥皿保存。

采用苯酚-硫酸法[14]測(cè)定多糖含量，硫酸-咔唑法[15]測(cè)定糖醛酸含量，考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定蛋白含量，prepASH 340系列全自動(dòng)水分灰分測(cè)定儀測(cè)定灰分含量，索氏抽提法[17]測(cè)定脂肪含量。

1.3.2 肌球蛋白的提取及理化測(cè)定

參考Park等[18]的方法制備肌球蛋白。取金鯧魚的肌肉制成肉糜，加入10 倍體積的試劑A（含0.1 mol/L氯化鉀、20 mmol/L Tris，pH 7.5），12000 r/min均質(zhì)1 min，反應(yīng)15 min。8000 r/min離心20 min，取沉淀于3 倍體積的試劑B（含0.45 mol/L氯化鉀、0.2 mol/L乙酸鎂、1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、20 mmol/L Tris、5 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 6.8）中反應(yīng)1 min。加入腺嘌呤核苷三磷酸，使其最終質(zhì)量濃度為10 mmol/L，反應(yīng)90 min，10000 r/min離心20 min。取上清液加入3 倍體積的1 mmol/L碳酸氫鉀，反應(yīng)40 min，12000 r/min離心10 min。取沉淀物加入2.5 倍體積的試劑C（含0.5 mol/L氯化鉀、20 mmol/L Tris、5 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 7.5），反應(yīng)10 min。加入3 倍體積的1 mmol/L碳酸氫鉀，再加入氯化鎂，使其最終質(zhì)量濃度為10 mmol/L，反應(yīng)過夜。第2天于8000 r/min離心25 min，得到乳白色肌球蛋白沉淀，實(shí)驗(yàn)全程在4 ℃進(jìn)行。

使用雙縮脲方法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE[19]對(duì)肌球蛋白成分進(jìn)行分析。

1.3.3 混合溶液的制備

用肌球蛋白和不同質(zhì)量濃度的MCP（0～0.1 mg/mL）制備混合體系，使混合體系中MCP的最終質(zhì)量濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL，肌球蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，樣品命名為肌球蛋白-MCP-0、肌球蛋白-MCP-0.02、肌球蛋白-MCP-0.04、肌球蛋白-M C P-0.06、肌球蛋白-MCP-0.08、肌球蛋白-MCP-0.10。將樣品4 ℃下充分混勻，然后40 ℃水浴30 min，在冰水中快速冷卻，4 ℃冰箱中保存待用。未添加MCP的肌球蛋白-MCP-0為對(duì)照組。

1.3.4 濁度的測(cè)定

參照Weinbreck等[20]的方法，用紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度代表樣品的濁度。以20 mmol/L Tris-HCl（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）緩沖液為空白組。

1.3.5 Zeta電位測(cè)定

將樣品置于電位比色皿中，用Nano-ZS90電位分析儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定溫度25 ℃，平衡時(shí)間1 min。

1.3.6 粒徑分布及大小

采用激光粒度儀測(cè)定樣品的粒徑大小及分布情況，測(cè)定的相關(guān)參數(shù)：物質(zhì)折光率為1.59，介質(zhì)折射率為1.333。

1.3.7 SDS-PAGE測(cè)定

將樣品與上樣緩沖液混合，置于沸水浴中加熱5 min，備用。配制12%分離膠，5%濃縮膠，上樣量10 μL，Marker上樣量5 μL，上樣后先用80 V電壓開始電泳，后改用120 V電壓，運(yùn)行1 h。脫色至背景透明，條帶呈明顯藍(lán)色。

1.3.8 表面疏水性測(cè)定

采用Xu Yeye等[21]的方法并作部分修改。用蛋白緩沖液將各樣品中蛋白質(zhì)量濃度稀釋為0.1～0.5 mg/mL。取25 μL 8 mmol/L 8-苯胺基-1-萘磺酸銨加入5 mL稀釋后的樣品中混合均勻，室溫避光反應(yīng)15 min。激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)475 nm，狹縫寬度5 mm，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度的初始斜率表示疏水指數(shù)（S0）。

1.3.9 總巰基含量的測(cè)定

參考Wei Li等[22]的方法，稍作修改。移取0.5 mL樣品，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl（含8 mol/L 尿素、2%SDS、10 mmol/L EDTA，pH 6.8）緩沖液，加入0.5 mL 0.1% 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（含0.1% 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）緩沖液，40 ℃反應(yīng)25 min，412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），緩沖液作空白。按式（2）計(jì)算總巰基含量：

式中：D為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)13600 L/（mol·cm）；C為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.10 圓二色譜分析

參考Cao Hongwei等[23]的方法，稍作修改。將樣品中蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.2 mg/mL，使用圓二色譜儀測(cè)定，掃描范圍190～250 nm，掃描速率100 nm/min。

1.3.11 紅外光譜分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定，掃描范圍4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描24 次。掃描結(jié)果用Peakfit 4.12軟件去卷積處理。

1.3.12 紫外-可見光色譜分析

使用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定，掃描范圍190～600 nm，掃描速率10 nm/s，以0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液為空白，取250～350 nm波長(zhǎng)范圍，利用Origin 2021軟件對(duì)紫外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)計(jì)算。

1.3.13 熒光色譜分析

將樣品中蛋白質(zhì)量濃度稀釋成0.05 mg/mL，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍300～500 nm，狹縫寬度5 nm，以緩沖液作空白去除背景。

1.3.14 熒光顯微鏡觀察

向1 mL樣品中加入20 μL 0.2 g/100 mL羅丹明B染色劑，染色30 min后置于載玻片上，使用熒光倒置顯微鏡于5 倍物鏡下觀察復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行Duncan法差異顯著性分析，采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金鯧魚肌球蛋白和純化的涼粉草多糖的基本理化性質(zhì)

涼粉草多糖經(jīng)過純化后最終基本成分（干基）為：總糖61.86%、糖醛酸46.11%、蛋白質(zhì)2.77%、脂肪3.86%、灰分18.88%。如圖1所示，提取的肌球蛋白主要由135～220 kDa的肌球蛋白重鏈、35 kDa的原肌球蛋白[24]和17 kDa的肌球蛋白輕鏈組成。同時(shí)，在48 kDa處存在肌動(dòng)蛋白殘留，整體以肌球蛋白為主，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1 金鯧魚肌球蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of myosin from golden pomfret

2.2 魚肌球蛋白-MCP混合體系相圖分析

由圖2所示，4 ℃條件下，肌球蛋白分散液呈乳白色渾濁液，不同質(zhì)量濃度MCP分散液均呈澄清透明的棕色溶液；按1.3.3節(jié)制備肌球蛋白與MCP混合溶液后，肌球蛋白-MCP-0樣品（圖2C0）有少量絮凝物，體系整體呈渾濁狀態(tài)，而其余樣品（圖2C1～C5）均有大量絮凝物形成，且體系上層澄清、下層有大量沉淀。表明肌球蛋白-肌球蛋白分子間在40 ℃下有少量聚集，而添加MCP后，兩者相互作用形成大量絮凝物，且因重力下沉，使混合體系發(fā)生結(jié)合型相分離。

圖2 肌球蛋白（A）、MCP（B）和肌球蛋白-MCP混合體系（C）相圖Fig.2 Photographs of myosin solution (A),MCP solution (B) and myosin-MCP mixed system (C)

2.3 MCP對(duì)魚肌球蛋白電位值的影響

由圖3可知，在測(cè)定范圍內(nèi)，所有樣品的Zeta電位值均為負(fù)值，表明肌球蛋白表面帶負(fù)電荷，MCP為陰離子多糖。當(dāng)MCP質(zhì)量濃度（0～0.06 mg/mL）較低時(shí)，其Zeta電位值無(wú)顯著變化（P＞0.05），而隨著MCP質(zhì)量濃度增加（0.08～0.1 mg/mL），其Zeta電位值顯著下降（P＜0.05），歸因于MCP分子上的—COOH發(fā)生去質(zhì)子化作用生成—COO[25]；肌球蛋白-MCP混合體系的Zeta電位值位于未添加組（肌球蛋白-MCP-0）和MCP之間，表明肌球蛋白和MCP之間存在靜電相互作用[26]。相較于未添加組，添加低質(zhì)量濃度MCP（≤0.04 mg/mL）的肌球蛋白-MCP混合體系的Zeta電位值無(wú)顯著變化（P＞0.05），添加較高質(zhì)量濃度MCP（≥0.06 mg/mL）的肌球蛋白-MCP混合體系的Zeta電位值顯著下降（P＜0.05）。這是因?yàn)榈唾|(zhì)量濃度MCP所帶入的負(fù)電荷正好與肌球蛋白表面的正電荷（局部區(qū)域）發(fā)生電位中和反應(yīng)，兩者通過靜電相互吸引力形成可溶性復(fù)合物，通過相互作用形成大量絮凝物（圖2）；繼續(xù)增加MCP含量，過量的負(fù)電荷導(dǎo)致肌球蛋白-MCP混合體系的電位值顯著下降，增加兩者間的靜電排斥力[26]。

圖3 MCP和肌球蛋白-MCP混合體系的Zeta電位變化曲線Fig.3 Zeta potential of MCP and myosin-MCP mixed system

2.4 MCP對(duì)魚肌球蛋白表面疏水性的影響

由圖4可知，相較于未添加組肌球蛋白-MCP-0，添加MCP可顯著降低蛋白質(zhì)表面疏水性（P＜0.05），且隨著MCP質(zhì)量濃度增加而降低；當(dāng)MCP增加至0.02 mg/mL，蛋白質(zhì)表面疏水性較未添加組降低約51%，繼續(xù)增加至0.1 mg/mL，蛋白質(zhì)表面疏水性較未添加組降低約67%。蛋白在40 ℃凝膠化條件下，肌球蛋白分子頭部的疏水基團(tuán)充分暴露，因此未添加組肌球蛋白-MCP-0獲得較高的表面疏水性。MCP顯著降低肌球蛋白表面疏水性的原因如下：1）肌球蛋白表面的正電荷（—NH3＋）與MCP表面的負(fù)電荷間通過靜電相互吸引形成肌球蛋白-MCP靜電復(fù)合物，同時(shí)，由于MCP富含親水性羥基（—OH），增加肌球蛋白-MCP復(fù)合物親水性[26]。2）隨著MCP增加，肌球蛋白與MCP之間相互作用形成空間位阻，導(dǎo)致肌球蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)不能充分暴露，進(jìn)而降低蛋白表面疏水性。

圖4 MCP質(zhì)量濃度對(duì)肌球蛋白-MCP混合體系表面疏水性的影響Fig.4 Effects of different MCP concentrations on surface hydrophobicity of myosin-MCP mixture system

2.5 MCP對(duì)魚肌球蛋白濁度的影響

如圖5所示，添加組濁度均低于未添加組（肌球蛋白-MCP-0），特別是MCP質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)，肌球蛋白-MCP混合體系濁度較肌球蛋白-MCP-0降低46%；但在添加組中，肌球蛋白-MCP混合體系濁度隨MCP增加而增加，相較于肌球蛋白-MCP-0.02體系的濁度，各肌球蛋白-MCP混合體系（0.04～0.1 mg/mL）濁度分別增加14%、34%、37%、45%。未添加組較高的濁度與其較大的表面疏水性有關(guān)（圖4），歸因于蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用力導(dǎo)致肌球蛋白-肌球蛋白聚集。添加MCP后，兩者的相互作用將促進(jìn)肌球蛋白展開，低質(zhì)量濃度MCP引入較少負(fù)電荷，MCP與肌球蛋白表面正電荷基團(tuán)（—NH3＋）通過靜電相互吸引形成可溶性復(fù)合物[27]，進(jìn)而減小其濁度；但隨著MCP質(zhì)量濃度的增大，混合體系濁度增加，歸因于肌球蛋白與MCP形成靜電復(fù)合凝聚物，同時(shí)，肌球蛋白-MCP電負(fù)性增強(qiáng)（圖3），誘導(dǎo)分子間產(chǎn)生靜電排斥力，促進(jìn)蛋白分子聚集[28]。

圖5 MCP質(zhì)量濃度對(duì)肌球蛋白-MCP混合體系濁度的影響Fig.5 Effects of different MCP concentrations on turbidity of myosin-MCP mixture system

2.6 MCP對(duì)魚肌球蛋白粒徑的影響

如圖6a所示，所有樣品均呈現(xiàn)一個(gè)單峰，說明粒徑的分布較為集中。未添加組的粒徑主要分布在100～200 μm，添加MCP后，粒徑的分布變寬，在0～400 μm均有分布，但MCP質(zhì)量濃度的增加對(duì)各添加組粒徑分布影響不大。

如圖6b所示，添加組平均粒徑（D50）（＜90 μm）相較于未添加組（124 μm）顯著下降（P＜0.05），隨著MCP質(zhì)量濃度增加，D50整體呈先減小后增加趨勢(shì)。MCP質(zhì)量濃度增加至0.08 mg/mL時(shí)，D50最?。?1 μm），MCP質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時(shí)，D50顯著增加（60 μm）（P＜0.05）。未添加組的D50是蛋白分子間疏水相互作用的結(jié)果，MCP質(zhì)量濃度較低時(shí)，兩者發(fā)生靜電中和反應(yīng)形成肌球蛋白-MCP可溶性復(fù)合物；MCP質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，過量的負(fù)電荷將誘導(dǎo)分子間靜電斥力，肌球蛋白-MCP復(fù)合物的D50顯著減?。≒＜0.05）；同時(shí)，MCP質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，D50增加，歸因于混合體系同時(shí)存在肌球蛋白-MCP相互作用、肌球蛋白-肌球蛋白相互聚集。因此，在混合體系中，蛋白-多糖相互作用、蛋白-蛋白相互聚集共同影響粒徑分布及大小，隨著MCP質(zhì)量濃度增加，其粒徑的分布變寬，D50整體減小。

圖6 不同MCP質(zhì)量濃度的肌球蛋白-MCP混合體系的粒徑分布（a）及D50（b）Fig.6 Particle size distribution (a) and D50 (b) of myosin-MCP mixed system with different MCP concentrations

2.7 MCP對(duì)魚肌球蛋白總巰基含量的影響

由圖7可知，相較于未添加組，添加組總巰基含量整體呈先上升后下降趨勢(shì)，MCP質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時(shí)，總巰基含量最高（0.33 mol/105g），較未添加組增加6%；MCP質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，總巰基含量最低（0.28 mol/105g），較未添加組降低13%。40 ℃凝膠化條件下，肌球蛋白受熱伸展，暴露更多分子內(nèi)部的巰基[29]。加入0.04 mg/mL MCP時(shí)，MCP分子的存在還未對(duì)肌球蛋白的伸展造成阻礙，因此總巰基含量增加[30]；但隨著MCP質(zhì)量濃度再增加，空間位阻效應(yīng)阻礙了肌球蛋白的伸展，且靜電相互排斥力促使肌球蛋白分子間通過二硫鍵共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致總巰基含量下降[31]。

圖7 MCP質(zhì)量濃度對(duì)肌球蛋白-MCP混合體系總巰基含量的影響Fig.7 Effects of different MCP concentrations on total sulfhydryl content in myosin-MCP mixture system

2.8 肌球蛋白-MCP混合體系的SDS-PAGE分析

如圖8所示，肌球蛋白的組成主要有200～180 kDa范圍內(nèi)的肌球蛋白重鏈與17 kDa的肌球蛋白輕鏈，還存在少量48 kDa的肌動(dòng)蛋白和35 kDa的原肌球蛋白[24]。在還原條件下，肌球蛋白頂部仍有大量肌球蛋白重鏈，這說明40 ℃凝膠化處理的肌球蛋白分子間交聯(lián)除了二硫鍵外，還存在其他共價(jià)方式[32]；MCP中無(wú)蛋白條帶，證明MCP中少量的蛋白并不影響兩者的相互作用；肌球蛋白-MCP混合體系各條帶位置均沒有位移，這表明兩者的相互作用并沒有生成新基團(tuán)[24]。同時(shí)，相較于肌球蛋白，肌球蛋白-MCP混合體系頂部的肌球蛋白重鏈更多，但肌球蛋白重鏈條帶不隨MCP質(zhì)量濃度變化，這說明經(jīng)40 ℃凝膠化處理后的蛋白展開，和MCP相互作用形成了新的肌球蛋白-MCP復(fù)合物。

圖8 肌球蛋白-MCP混合體系的SDS-PAGE圖譜Fig.8 SDS-PAGE pattern of myosin-MCP mixture system

2.9 肌球蛋白-MCP混合體系的紫外光譜分析

如圖9a所示，隨著MCP質(zhì)量濃度的增加，在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度逐漸上升，表明蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[33]。為進(jìn)一步區(qū)分構(gòu)象轉(zhuǎn)變的差異，對(duì)零階光譜曲線進(jìn)行處理得到二階導(dǎo)數(shù)光譜，如圖9b所示。260～290 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)存在一個(gè)負(fù)峰，主要由酪氨酸和色氨酸貢獻(xiàn)，290～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)存在正峰，主要由色氨酸貢獻(xiàn)[34]。隨著MCP質(zhì)量濃度增加，肌球蛋白-MCP混合體系負(fù)峰峰值分別在285、284、283、282、285、286 nm波長(zhǎng)處，先藍(lán)移后紅移；正峰峰值分別為295、295、295、296、295、294 nm，其峰值先不變，再紅移，最后藍(lán)移，兩個(gè)范圍內(nèi)峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)均在MCP添加量為0.06 mg/mL時(shí)達(dá)到極值。綜上所述，當(dāng)MCP添加量為0～0.06 mg/mL時(shí)，蛋白表面的酪氨酸向里包埋，獲得更疏水的微環(huán)境，而蛋白內(nèi)部疏水區(qū)的色氨酸向外擴(kuò)展，使其微環(huán)境極性增加；當(dāng)MCP添加量持續(xù)增加到0.08～0.1 mg/mL時(shí)，兩種氨基酸的變化趨勢(shì)相反。在熊文飛等[35]的研究中，殼聚糖的添加也導(dǎo)致卵白蛋白的色氨酸微環(huán)境極性增加。

圖9 肌球蛋白-MCP混合體系的零階紫外-可見光譜（a）與二階導(dǎo)數(shù)光譜（b）Fig.9 Zero-order UV-visible spectra (a) and second-order derivative spectra (b) of myosin-MCP mixed system

2.10 MCP對(duì)肌球蛋白色氨酸熒光的影響

如圖10所示，相較于未添加組，添加組的最大熒光強(qiáng)度明顯下降，且隨著MCP質(zhì)量濃度增加，肌球蛋白-MCP混合體系的最大熒光強(qiáng)度逐漸減小。可能是40 ℃凝膠化處理使肌球蛋白分子內(nèi)部具有疏水性的色氨酸暴露，使其最大熒光強(qiáng)度顯著高于添加組，此結(jié)果也在疏水性實(shí)驗(yàn)（圖4）被佐證。

除熒光強(qiáng)度以外，熒光的最大吸收峰位置也值得關(guān)注，未添加組峰值位于338 nm波長(zhǎng)處，添加組的峰值分別位于338、339、342、339、339 nm波長(zhǎng)處。相較于未添加組，MCP質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)，其對(duì)色氨酸微環(huán)境影響不大；當(dāng)MCP質(zhì)量濃度為0.04～0.1 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)不同程度的紅移，且MCP質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時(shí)，紅移程度最大，表明此時(shí)色氨酸殘基暴露最多。MCP質(zhì)量濃度為0.08～0.1 mg/mL時(shí)，分子間靜電排斥力增加導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)重新折疊，色氨酸隨之向里包埋，微環(huán)境疏水性增加。因此，色氨酸光譜（圖10）與紫外光譜（圖9）的發(fā)現(xiàn)基本一致，證明MCP的添加將導(dǎo)致蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)改變，影響內(nèi)部氨基酸殘基的微環(huán)境。

圖10 肌球蛋白-MCP混合體系的熒光光譜Fig.10 Fluorescence spectra of myosin-MCP mixed system

2.11 MCP對(duì)魚肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

如圖11a所示，未添加組肌球蛋白-MCP-0在208、222 nm波長(zhǎng)附近存在明顯α-螺旋特征峰，而各添加組208 nm波長(zhǎng)處的負(fù)峰變平緩，222 nm波長(zhǎng)處負(fù)峰峰型基本保持一致，表明添加MCP后，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化。如圖11b所示，MCP在3400～3200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)有一個(gè)寬峰，歸因于—OH羥基的伸縮振動(dòng)，在1420、1627 cm-1波數(shù)處的吸收峰歸因于—COO-對(duì)稱和不對(duì)稱的伸縮振動(dòng)，在1074 cm-1處的吸收峰歸因于C—O、C—C、C—O—H的共同作用，這是表征MCP結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[36]。未添加組肌球蛋白-MCP-0在1650 cm-1和1540 cm-1波數(shù)處存在吸收峰，分別來自蛋白結(jié)構(gòu)的酰胺I帶和酰胺II帶[37]。當(dāng)肌球蛋白與MCP相互作用，各肌球蛋白-MCP混合體系的紅外光譜峰型基本一致，在3500～3200 cm-1（—OH）波數(shù)范圍內(nèi)均出現(xiàn)寬峰，表明與肌球蛋白或MCP相比，肌球蛋白-MCP復(fù)合物的氫鍵增強(qiáng)，這歸因于MCP帶入了更多的羥基（—OH）[37]。同時(shí)，肌球蛋白-MCP復(fù)合物中—振動(dòng)峰（1650 cm-1）與—COO-振動(dòng)峰（1420、1627 cm-1）逐漸減小，證明肌球蛋白-MCP間發(fā)生靜電結(jié)合反應(yīng)[25]。

圖11 肌球蛋白-MCP混合體系的圓二色譜（a）和紅外光譜（b）Fig.11 Circular dichroism (a) and infrared spectra (b) of myosin-MCP mixed system

2.12 MCP對(duì)魚肌球蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖12所示，水溶液狀態(tài)下，同時(shí)存在熒光網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及熒光點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，代表蛋白分子間不同的聚集狀態(tài)。相較于未添加組肌球蛋白-MCP-0，添加組中黑色視野增加，熒光網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)改變，同時(shí)熒光網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的黑色空隙增大。表明MCP的添加，破壞了蛋白間的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，使肌球蛋白-MCP復(fù)合物增加，造成形態(tài)各異的熒光網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。?akir等[38]的研究中表明，隨著卡拉膠質(zhì)量濃度的增加，乳清分蛋白的連續(xù)相逐漸被破壞，結(jié)構(gòu)中存在更多空隙。然而，由圖12可知，除了松散的熒光網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，也存在緊密的熒光點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，通過紫外（圖9）和熒光光譜（圖10）實(shí)驗(yàn)可知，展開的肌球蛋白表面附著大量的疏水基團(tuán)，這些基團(tuán)促使蛋白分子相互聚集形成緊密的熒光點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。

圖12 肌球蛋白-MCP混合體系的微觀結(jié)構(gòu)變化Fig.12 Microstructure changes of myosin-MCP mixed system

2.13 MCP-肌球蛋白相互作用機(jī)制

由圖13可知，40 ℃凝膠化條件下，未添加組肌球蛋白-MCP-0中的肌球蛋白分子受熱展開，較大的疏水相互作用力促使肌球蛋白分子聚集形成肌球蛋白-肌球蛋白集聚體。肌球蛋白-MCP反應(yīng)初期，MCP帶入少量負(fù)電荷與肌球蛋白表面部分區(qū)域的正電荷通過弱靜電相互作用形成可溶性復(fù)合物，例如肌球蛋白-MCP-0.02濁度較未添加組顯著下降（P＜0.05）（圖5）。肌球蛋白-MCP反應(yīng)中期，隨著陰離子多糖MCP增加，將誘導(dǎo)分子間產(chǎn)生靜電排斥力，排斥力促使少量肌球蛋白相互靠近，通過二硫鍵共價(jià)交聯(lián)形成肌球蛋白-肌球蛋白聚集體，例如肌球蛋白-MCP-0.06中，總巰基含量、疏水性、D50均下降，但肌球蛋白-MCP-0.08與肌球蛋白-MCP-0.06的Zeta電位值無(wú)顯著差異（P＞0.05），說明水溶液中存在的靜電斥力仍較弱。肌球蛋白-MCP反應(yīng)后期，MCP質(zhì)量濃度再增加，因負(fù)電荷過剩導(dǎo)致強(qiáng)靜電排斥力和因MCP伸展導(dǎo)致空間位阻效應(yīng)，會(huì)促使肌球蛋白-肌球蛋白聚集體增多，如肌球蛋白-MCP-0.10混合體系在熒光顯微鏡下的綠色熒光團(tuán)增大。

圖13 肌球蛋白MCP混合體系復(fù)合物形成機(jī)制Fig.13 Mechanism of complex formation in myosin-MCP mixture system

3 結(jié)論

分析了40 ℃條件下MCP添加量對(duì)肌球蛋白-MCP混合體系的影響。結(jié)果表明，不同MCP添加量影響溶液中肌球蛋白與MCP間的相互作用力，從而影響蛋白結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性。低質(zhì)量濃度的MCP，主要通過靜電相互吸引力與肌球蛋白形成肌球蛋白-MCP復(fù)合物，高質(zhì)量濃度的MCP，誘導(dǎo)混合體系產(chǎn)生靜電排斥力，促使肌球蛋白-肌球蛋白相互聚集，最終導(dǎo)致混合體系中的整體顆粒從大而集中轉(zhuǎn)變?yōu)樾《鴱V泛的分布。此外，MCP的添加將誘導(dǎo)肌球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致肌球蛋白疏水基團(tuán)、巰基、氨基酸殘基不同程度地暴露與掩埋?；诖丝蔀镸CP在蛋白基食品中的應(yīng)用提供一定理論參考。