陳文美，周厚澤，邵艷紅，劉 俊,*，涂宗財(cái),2

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

魚類含有豐富的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，是人類重要的食品原料，但魚類會(huì)引起過敏反應(yīng)，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。魚類過敏是人體對(duì)魚體中抗原物質(zhì)產(chǎn)生的不良反應(yīng)，是八大食物過敏原之一[2]。而鰱魚是我國(guó)四大家魚之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值，但鰱魚及其魚糜制品中主要過敏原小清蛋白（parvalbumin，PV）引起的過敏反應(yīng)威脅著許多人的健康[3]，如何消減鰱魚PV的致敏性是食品安全領(lǐng)域急需解決的科學(xué)問題。

PV 是一種水溶性球狀蛋白，分子質(zhì)量約為11～14 kDa，廣泛存在于低等脊椎動(dòng)物的白色肉中，其在人體鈣生理學(xué)中起到至關(guān)重要的作用。很多魚類中存在2～5 種不同的PV亞型，它們均能與IgE結(jié)合，且PV聚合形成的二聚體或四聚體均有較強(qiáng)的IgE結(jié)合能力，在熱處理或極端pH值條件下仍保持過敏[4]。PV的致敏性取決于它所包含的抗原表位，有AA34-37、AA78-80、AA90-94和AA94-109。破壞抗原表位是目前一種有效降低PV致敏性的脫敏技術(shù)，如：熱處理、蛋白質(zhì)修飾（糖基化、磷酸化等）、酶解和發(fā)酵法等方法被用來(lái)消減蛋白質(zhì)的致敏性[5-8]，其中，蛋白質(zhì)修飾技術(shù)是一種比較有前景的方法，能夠改善蛋白質(zhì)的功能特性，同時(shí)也能有效降低其致敏性[9-10]。Zhao Yongjuan等[11]發(fā)現(xiàn)糖基化顯著降低了PV的IgG結(jié)合能力；Li Zheng等[12]發(fā)現(xiàn)PV-麥芽糖的IgE結(jié)合能力在美拉德反應(yīng)后被顯著抑制；Li Canpeng等[13]利用磷酸化修飾也可以降低PV的致敏性。雖然單獨(dú)的磷酸化或糖基化可以在一定程度上降低PV的致敏性，但它并不能有效地將致敏性降低到滿意的程度。基于各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，聯(lián)合2 種或2 種以上方法降低PV過敏性具有較好的應(yīng)用前景，而糖基化聯(lián)合磷酸化修飾降低鰱魚PV致敏性的研究鮮有報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)以鰱魚PV為研究對(duì)象，選用半乳糖和焦磷酸鈉先后對(duì)其進(jìn)行共價(jià)修飾，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro-phoresis，SDS-PAGE）、圓二色譜和光譜等技術(shù)分析改性前后鰱魚PV多級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；運(yùn)用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)糖基化聯(lián)合磷酸化修飾的鰱魚PV進(jìn)行修飾肽段和位點(diǎn)表征；同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞系（KU812）模型評(píng)價(jià)糖基化聯(lián)合磷酸化修飾的鰱魚PV與IgG/IgE的結(jié)合能力以及對(duì)KU812細(xì)胞釋放組胺（histamine，HIS）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚購(gòu)自江西省南昌市長(zhǎng)勝市場(chǎng)，取背部白色肌肉立即實(shí)驗(yàn)或保存于-80 ℃。

焦磷酸鈉、半乳糖 北京索萊寶科技有限公司；BeyoBlueTM考馬斯亮藍(lán)超快染色液 碧云天生物科技（上海）有限公司；人IL-6 ELISA試劑盒 北京四正柏生物科技有限公司；人HIS ELISA試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；KU812細(xì)胞株 武漢普諾賽生命科技有限公司；淡水魚過敏患者血清 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院；鼠血清 實(shí)驗(yàn)室自制；山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶 美國(guó)Sigma公司；山羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104N電子分析天平 上海丙林電子科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；Mini-Protean電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Synergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；SR160W二氧化碳培養(yǎng)箱 上海舍巖儀器有限公司；MOS 450圓二色譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司；F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司；Q-Exactive HF質(zhì)譜儀、Acclaim PepMap 100納流預(yù)柱（100 μm i.d.，2 cm，C18，5 μm，100 ?）和Acclaim PepMap RSLC納流分析柱（C18，15 cm×2 μm，50 μm，100 ?） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；5430R冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參考前期報(bào)道的方法[3]，取新鮮鰱魚背部白色肌肉經(jīng)煮沸和分級(jí)鹽析后，借助高效液相結(jié)合尺寸排阻色譜對(duì)鹽析后的PV進(jìn)行分離純化?；赑V的分子質(zhì)量和色譜的分布情況，收集經(jīng)尺寸排阻色譜分離后第II～I(xiàn)V峰溶液，并對(duì)該溶液進(jìn)行超濾除鹽、凍干，得到鰱魚PV。將其溶于純水中，調(diào)整其質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。將20 mg半乳糖溶解在20 mL 1.0 mg/mL鰱魚PV溶液中，凍干成粉末，然后在60 ℃、65%相對(duì)濕度下孵育2 h，冰上放置20 min終止反應(yīng)。磷酸化反應(yīng)條件與糖基化反應(yīng)條件相同。反應(yīng)結(jié)束后使用3 kDa超濾離心管除去未反應(yīng)的糖和鹽，-20 ℃保存?zhèn)溆?。鰱魚PV通過半乳糖修飾，未結(jié)合的半乳糖通過超濾去除，收集濃縮液，凍干成粉末，用純水溶解后加與鰱魚PV同質(zhì)量的焦磷酸鈉混勻后進(jìn)行凍干，以凍干粉的形式進(jìn)行磷酸化反應(yīng)即為糖基化聯(lián)合磷酸化反應(yīng)，該復(fù)合反應(yīng)與上述糖基化和磷酸化反應(yīng)條件相同。未經(jīng)處理的鰱魚PV命名為N-PV。干熱處理，不添加試劑，與糖基化聯(lián)合磷酸化反應(yīng)條件相同的樣品命名為H-PV。通過糖基化、磷酸化和糖基化聯(lián)合磷酸化修飾的樣品分別命名為Gal-PV、SP-PV和Gal-SP-PV。

1.3.2 分子質(zhì)量測(cè)定

參照Liu Jun等[14]方法使用SDS-PAGE分析樣品的分子質(zhì)量變化。樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL，上樣量為10 μL，分子質(zhì)量標(biāo)記物為10～180 kDa。凝膠電泳結(jié)束，用考馬斯亮藍(lán)快速染色液進(jìn)行染色，最后用水脫色，背景清晰透明。

1.3.3 游離氨基含量測(cè)定

使用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）方法測(cè)定樣品中的游離氨基含量，參照Wang Zhongjiang等[15]方法并適當(dāng)修改。取100 μL樣品溶液加入到2 mL OPA溶液中混勻，100 μL蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，在37 ℃避光反應(yīng)2 min后，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)340 nm條件下測(cè)其吸光度。

1.3.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參照Z(yǔ)hang Ming等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定參數(shù)為：光譜掃描范圍190～250 nm，掃描速率60 nm/min，狹縫寬度1 nm。

1.3.5 內(nèi)源熒光的測(cè)定

根據(jù)Zhao Chengbin等[17]的方法并適當(dāng)修改。將待測(cè)樣品稀釋至1 mg/mL，測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射光譜為200～500 nm，狹縫寬度5 nm，掃描速率1200 nm/min。

1.3.6 高效液相色譜結(jié)合質(zhì)譜鑒定修飾肽段和位點(diǎn)

采用Nano-LC-ESI-QOrbitrap-MS/MS對(duì)Gal-PV、SP-PV和Gal-SP-PV的修飾位點(diǎn)和肽段進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行修改[18]。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液，采用逐步梯度洗脫的方法進(jìn)行洗脫[18]，流速為220 nL/min。采用正離子模式，一級(jí)母離子的質(zhì)量掃描范圍m/z250～1250。根據(jù)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度選擇前20 個(gè)肽段進(jìn)行破碎，破碎模式為高能碰撞解離，能量為27%。母離子圖譜用Xcalibur軟件分析，對(duì)肽段序列分析用PEAKS軟件完成。

1.3.7 IgG/IgE結(jié)合能力測(cè)定

參考Ma Jiaju等[19]方法并略作調(diào)整，通過間接ELISA測(cè)定的N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的IgE結(jié)合能力。一抗為4 名對(duì)淡水魚過敏患者的血清組成，山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶為二抗，稀釋度均為1∶100。通過Zhang Min等[20]使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定鰱魚PV樣品的IgG結(jié)合能力，并于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度，以半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)所需的一抗為實(shí)驗(yàn)室自制的小鼠抗鰱魚PV血清組成，稀釋度為1∶3200，山羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶為二抗，稀釋度均為1∶2000。IgG結(jié)合力的抑制率按下式計(jì)算：

式中：B與B0分別為添加樣品后的吸光度、未添加抗原的陽(yáng)性對(duì)照吸光度。

1.3.8 人嗜堿性粒細(xì)胞（KU812）脫顆粒實(shí)驗(yàn)

KU812細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和1×105U/L青霉素/鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將含有2×106個(gè)KU812細(xì)胞接種于24 孔板中24 h，用10 μL魚過敏患者的混合血清被動(dòng)激活24 h，然后用50 μL/孔1 mg/mL樣品刺激4 h。以磷酸鹽緩沖液處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。采用ELISA分析HIS和IL-6的釋放情況，并按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 分子質(zhì)量

將收集得到的蛋白上清液（第II～I(xiàn)V峰的溶液）通過SDS-PAGE測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量大于10 kDa，這與PV的理論分子質(zhì)量較為一致，且未見其他明顯蛋白條帶。結(jié)果表明，經(jīng)煮沸和分級(jí)鹽析后的溶液經(jīng)高效液相色譜結(jié)合尺寸排阻色譜純化后，上清液中的蛋白溶液即為PV（N-PV），因此將其進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。如圖1所示，與N-PV相比，H-PV的蛋白質(zhì)條帶沒有發(fā)生明顯變化，而Gal-PV、SP-PV和Gal-SP-PV的條帶發(fā)生向上遷移，尤其是Gal-SP-PV條帶向上遷移最為明顯。該結(jié)果表明鰱魚PV與半乳糖和磷酸基團(tuán)共價(jià)交聯(lián)形成高分子質(zhì)量物質(zhì)，導(dǎo)致蛋白條帶向上遷移。

圖1 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的電泳圖Fig.1 Eelectrophoretograms of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.2 游離氨基含量

糖基化和磷酸化反應(yīng)可發(fā)生在蛋白質(zhì)特定的位點(diǎn)上，例如賴氨酸、絲氨酸、精氨酸和N-端的游離氨基等[21-22]，使蛋白質(zhì)的游離氨基含量降低，因此通過測(cè)定游離氨基的含量能夠進(jìn)一步確定鰱魚PV是否發(fā)生糖基化和磷酸化反應(yīng)。如圖2所示，與N-PV相比，H-PV的游離氨基含量改變不顯著，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的游離氨基含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，鰱魚PV發(fā)生糖基化和磷酸化。此外，Gal-SP-PV的游離氨基含量最低，其次是Gal-PV和SP-PV，這是由于更多氨基酸被糖基化和磷酸化修飾。

圖2 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的游離氨基含量Fig.2 Free amino contents of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)

如表1所示，N-PV的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋相對(duì)含量為57.29%，β-折疊相對(duì)含量為7.78%，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量為12.48%，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量為22.46%。與N-PV相比，H-PV的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量比例較高，分別為60.45%和17.97%，而β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲的比例較低。有研究表明α-螺旋含量的增加主要由β-折疊的降低引起[23]。結(jié)果表明，長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)在一定程度上破壞鰱魚PV的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，引起蛋白質(zhì)多肽鏈的部分?jǐn)U張。此外，在SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV中，α-螺旋的比例呈不斷下降趨勢(shì)（P＜0.05），而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量比例呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。該結(jié)果表明，糖基化聯(lián)合磷酸化修飾的鰱魚PV二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)為α-螺旋相對(duì)含量的降低和β-折疊相對(duì)含量的增加。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)靠氨基酸序列和分子內(nèi)不同區(qū)域的相互作用而維持[24]，而糖基化聯(lián)合磷酸化會(huì)明顯破壞這些相互作用，從而導(dǎo)致PV的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。相似的結(jié)果也被Sun Yuanxia等[25]報(bào)道，卵清蛋白經(jīng)美拉德反應(yīng)后α-螺旋相對(duì)含量減少，β-折疊稍有增加；Rupa等[26]報(bào)卵清蛋白α-螺旋相對(duì)含量的減少會(huì)抑制其過敏反應(yīng)。此外，有研究報(bào)道PV內(nèi)部含有較多的α-螺旋[27]，根據(jù)表1數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)其占據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的57.29%，PV的過敏表位大概率分布在這些α-螺旋上，因此α-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞可能會(huì)在一定程度上降低PV與特異性抗體的親和力，從而降低其致敏性。

表1 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化Table 1 Changes in secondary structure contents of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV %

2.4 內(nèi)源熒光強(qiáng)度

熒光強(qiáng)度的變化可用于分析N-PV、Gal-PV、SPPV、Gal-SP-PV和H-PV的構(gòu)象變化。如圖3所示，與N-PV相比，H-PV的熒光強(qiáng)度降低，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的熒光強(qiáng)度顯著降低，降低程度為SP-PV＜Gal-PV＜Gal-SP-PV。熒光強(qiáng)度的降低可能是由于蛋白質(zhì)與還原糖和磷酸基團(tuán)的接入使PV的色氨酸區(qū)域被屏蔽[28]，從而導(dǎo)致其產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度降低。結(jié)果表明，PV經(jīng)磷酸化、糖基化和糖基化聯(lián)合磷酸化修飾后空間結(jié)構(gòu)被破壞，破壞的程度為糖基化聯(lián)合磷酸化＞糖基化＞磷酸化。當(dāng)PV發(fā)生美拉德反應(yīng)后，賴氨酸或精氨酸的氨基與還原糖發(fā)生反應(yīng)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了抗原表位的結(jié)合活性[29]；劉俊等[30]也報(bào)道經(jīng)糖基化、磷酸化和乙酰化修飾的α-乳白蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量的變化與其致敏性有關(guān)。因此，PV三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變也是影響其免疫活性的重要原因。

圖3 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的熒光強(qiáng)度Fig.3 Fluorescence intensity of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.5 糖基化和磷酸化修飾位點(diǎn)

為了更好地闡明糖基化聯(lián)合磷酸化修飾對(duì)鰱魚PV一級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，采用質(zhì)譜對(duì)SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的修飾位點(diǎn)的數(shù)量和位置進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4和表2所示。圖4a、c顯示77ALTDAETKAFLK88和29SFFAKVGLSAK39的m/z分別為735.39242＋和658.85953＋。通過b和y離子值之間差值（圖4b、d），可以確定多肽77～88和29～39氨基酸序列中的修飾位點(diǎn)分別為K84和K33（表2）。類似地，通過相同的糖基化方法鑒定了SPPV、Gal-PV和Gal-SP-PV上的修飾位點(diǎn)。如表2可知，Gal-PV含有8 個(gè)修飾位點(diǎn)，分別為K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108。在SP-PV中發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（S56和S92）。其中，Gal-SP-PV具有與Gal-PV相同的8 個(gè)糖基化位點(diǎn)外，還含有一個(gè)與SP-PV相同的磷酸化位點(diǎn)（S56）。結(jié)果表明，糖基化聯(lián)合磷酸化修飾的鰱魚PV含有最多的修飾位點(diǎn)。

圖4 SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的修飾位點(diǎn)質(zhì)譜測(cè)定Fig.4 Mass spectra showing modification sites of SP-PV,Gal-PV and Gal-SP-PV

表2 高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定修飾肽段和位點(diǎn)Table 2 Modified peptides and sites identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry

2.6 IgG/IgE結(jié)合能力

圖5a顯示了鰱魚PV的IgG結(jié)合能力。H-PV的IC50值為14.3 μg/mL，遠(yuǎn)低于N-PV（40.6 μg/mL），而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的IC50值分別為43.8、55.6 μg/mL和76.9 μg/mL。圖5b為鰱魚PV的IgE結(jié)合能力，可觀察到與IgG結(jié)合能力類似的趨勢(shì)。同一樣品與不同患者血清的IgE結(jié)合能力存在一定差異，但總體而言，H-PV的吸光度高于N-PV，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的吸光度低于N-PV。如圖5b所示，鰱魚PV的IgE結(jié)合能力在加熱后顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而經(jīng)糖基化、磷酸化和糖基化聯(lián)合磷酸化修飾后，IgE結(jié)合能力下降，下降趨勢(shì)為SP-PV＜Gal-PV＜Gal-SP-PV。這些結(jié)果表明，糖基化聯(lián)合磷酸化修飾能夠降低鰱魚PV的IgG/IgE結(jié)合能力。

圖5 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的IgG（a）、IgE（b）結(jié)合能力Fig.5 IgG (a) and IgE (b) binding capacity of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV and H-PV

2.7 KU812細(xì)胞

嗜堿性粒細(xì)胞的脫顆粒率是決定過敏原免疫反應(yīng)性的關(guān)鍵因素。如圖6所示，與對(duì)照組比，N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的HIS和IL-6含量增加，說(shuō)明鰱魚PV的添加影響過敏癥狀相關(guān)介質(zhì)的釋放。與N-PV相比，Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV的HIS和IL-6釋放量低，其中Gal-SP-PV的釋放量顯著低于N-PV（P＜0.05）?？赡艿脑蚴翘腔?lián)合磷酸化修飾的鰱魚PV誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒的程度較弱，減弱了效應(yīng)細(xì)胞分泌HIS等生物活性介質(zhì)能力，而炎癥性介質(zhì)會(huì)在一定程度上引起以毛細(xì)血管擴(kuò)張、平滑肌收縮等為特點(diǎn)的病理變化，從而誘發(fā)身體局部或全身過敏反應(yīng)[31]。這與圖5結(jié)果一致。結(jié)果表明，糖基化聯(lián)合磷酸化修飾的鰱魚PV降低KU812細(xì)胞HIS和IL-6分泌，降低其過敏反應(yīng)。

圖6 N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV對(duì)KU812細(xì)胞釋放HIS（a）和IL-6（b）能力的影響Fig.6 Effects of N-PV,Gal-PV,SP-PV,Gal-SP-PV和H-PV on release of HIS (a) and IL-6（b）from KU812 cells

2.8 糖基化聯(lián)合磷酸化修飾降低PV致敏性的機(jī)制分析

PV是鰱魚及其魚糜制品中的主要過敏原，如何降低其致敏性具有重要的意義。通過各種物理和化學(xué)方法破壞過敏蛋白的抗原表位降低其致敏性是目前行之有效的脫敏技術(shù)[6]。本研究中選用半乳糖和焦磷酸鈉先后對(duì)鰱魚PV進(jìn)行共價(jià)修飾，與單獨(dú)Gal-PV和SP-PV相比，糖基化聯(lián)合磷酸化修飾能顯著降低其致敏性，如IgG和IgE結(jié)合能力的降低（圖5）、KU812細(xì)胞中HIS和IL-6含量的減少（圖6）。

蛋白質(zhì)的抗原表位是引起其過敏反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，過敏蛋白致敏性的降低與其抗原表位的破壞有關(guān)，而抗原表位分為線性表位和構(gòu)象性表位，經(jīng)不同物理和化學(xué)方法處理后，會(huì)引起線性表位或構(gòu)象表位的變化。本研究中，與單獨(dú)糖基化和磷酸化相比，半乳糖和磷酸基團(tuán)先后與鰱魚PV共價(jià)結(jié)合可以增加其分子質(zhì)量（圖1），顯著降低游離氨基含量（圖2），改變二級(jí)結(jié)構(gòu)（表1）和構(gòu)象結(jié)構(gòu)（圖3），這些結(jié)構(gòu)的變化會(huì)破壞鰱魚PV的構(gòu)象過敏表位，從而降低其致敏性。如圖7所示，糖基化聯(lián)合磷酸化修飾的PV不僅含有與Gal-PV相同的8 個(gè)糖基化位點(diǎn)（K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108），還包含1 個(gè)與SP-PV相同的磷酸化位點(diǎn)S56。Zhao Yongjuan等[11]發(fā)現(xiàn)PV的抗原表位為AA34-37，AA78-80和AA88-93和AA94-109，而糖基化位點(diǎn)（K88、K97和K108）和磷酸化位點(diǎn)（S92）位于PV的線性表位區(qū)域，這些糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)能遮掩PV的線性表位，降低其致敏性。雖然K33、K46、K55、K65和K84不在PV的抗原表位區(qū)域，但其與共價(jià)結(jié)合的糖鏈會(huì)形成一定的空間位阻，降低PV與IgG/IgE的結(jié)合能力。因此，PV致敏性的降低取決于糖基化位點(diǎn)聯(lián)合磷酸化位點(diǎn)遮掩其線性表位和破壞其構(gòu)象表位。

圖7 糖基化和磷酸化修飾的PV帶狀圖Fig.7 Ribbon diagram of glycated and phosphorylated PV

3 結(jié)論

綜上所述，與單一的糖基化或磷酸化修飾相比，糖基化聯(lián)合磷酸化修飾能夠顯著降低鰱魚PV的致敏性。糖基化聯(lián)合磷酸化修飾能增加鰱魚PV的分子質(zhì)量和糖基化修飾位點(diǎn)，而游離氨基含量和內(nèi)源熒光吸收強(qiáng)度顯著減少，這些結(jié)果表明糖基化聯(lián)合磷酸化修飾能顯著改變鰱魚PV的抗原表位；同時(shí)糖基化聯(lián)合磷酸化修飾降低了鰱魚PV與IgE/IgG的結(jié)合能力以及對(duì)KU812細(xì)胞脫顆粒（HIS和IL-6）的釋放能力。這說(shuō)明糖基化聯(lián)合磷酸化修飾通過破壞鰱魚PV的抗原表位，降低IgG/IgE的結(jié)合能力和KU812細(xì)胞的過敏反應(yīng)，但致敏性的評(píng)價(jià)并不全面，需要更多的實(shí)驗(yàn)（如動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)等）驗(yàn)證其效果。