蔣變玲，王維維，趙程洋，張東新，趙旭東，陳軍，彭磊，陳瓊，馮凡

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州, 234000)

Ⅱ型糖尿病是一種主要表現(xiàn)為胰島素抵抗或分泌不足而導(dǎo)致患者血糖顯著升高的慢性?xún)?nèi)分泌代謝疾病，患者各組織可因此受損，嚴(yán)重危害著居民健康并帶來(lái)沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。

近年來(lái)ω-3系列多不飽和脂肪酸在Ⅱ型糖尿病方面的作用日益引起人們的重視[2]，其中源于海洋的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)對(duì)Ⅱ型糖尿病的干預(yù)報(bào)道尚存在爭(zhēng)議。有研究表明攝入魚(yú)油的Ⅱ型糖尿病患者胰島素敏感性和空腹血糖水平無(wú)變化，但低密度脂蛋白膽固醇和血清甘油三酯水平上升[3-5]。而MOSTAD等[6]發(fā)現(xiàn)魚(yú)油會(huì)導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病患者血糖上升，胰島素敏感性降低，增加脂肪組織中ω-3系列多不飽和脂肪酸含量。此外，抗性麥芽糊精作為一種新型的非黏性膳食纖維，有助于維持血液和脂質(zhì)分布，由于對(duì)人體健康的有益作用而引起廣泛的關(guān)注[7]。LI等[8]研究發(fā)現(xiàn)，超重男性連續(xù)12周每日攝入 34 g抗性麥芽糊精可顯著降低體內(nèi)所有葡萄糖標(biāo)志物包括空腹血糖水平、糖化血紅蛋白及糖化血清白蛋白水平，并降低胰島素和胰島素抵抗，后兩者與ALIASGHARZADEH等[9]研究一致。據(jù)報(bào)道抗性麥芽糊精可顯著影響腸道菌群組成。BAER等[10]研究表明，每天攝入25～50 g抗性麥芽糊精可以呈劑量依賴(lài)性方式增加數(shù)種腸道菌的數(shù)量，如雙歧桿菌、擬桿菌、毛螺菌科、糞球菌和梭狀芽孢桿菌等。而機(jī)體腸道微生態(tài)變化與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。

盡管在過(guò)去十年關(guān)于n-3不飽和脂肪酸的應(yīng)用有了有效的經(jīng)驗(yàn)證據(jù)，但其在臨床上的使用或聯(lián)合使用(例如聯(lián)合益生菌、益生元、飲食/生活方式使用)在特定背景下預(yù)防和改善Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的效果方面目前證據(jù)尚不清晰且結(jié)果不一[13]，且對(duì)糖尿病患者腸道菌群的影響缺乏數(shù)據(jù)。因此，本文用EPA/DHA聯(lián)合麥芽糊精(maltodextrin,MED)飼喂糖尿病SD大鼠，檢測(cè)EPA/DHA和抗性麥芽糊精聯(lián)合使用對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖、臟器指數(shù)及臟器脂類(lèi)蓄積以及腸道菌群的影響，為EPA/DHA的聯(lián)合應(yīng)用提供初步供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠(SPF級(jí))購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證scxk(皖)2017-001)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

EPA、DHA聯(lián)合MED(含DHA 8.8%、EPA 12.5%和MED 70%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，上海麥克林生化科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)，Sigma-Aldrich生物公司；液相色譜所用流動(dòng)相試劑、標(biāo)準(zhǔn)品(98%)等，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

FA220 4B電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；高效液相色譜備有SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；ROCHE羅氏血糖儀(家用活力型)，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立

10.0 mg/mL STZ溶液的配制參考克迎迎[14]的方法。各實(shí)驗(yàn)組大鼠(3周齡)飼喂高脂高糖飼料，期間自由飲水。喂養(yǎng)28 d后，禁食12 h，模型組按40 mg/kg BW劑量腹腔注射STZ，正常對(duì)照組則注射等量檸檬酸鹽緩沖液。禁食12 h尾端采血測(cè)血糖，血糖值≥11.1 mmol/L即為造模成功。

1.4.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

SD大鼠共30只，每組雌雄各半。分組為正常對(duì)照組(CK組，6只)，糖尿病組(STZ組)，MED低/中/高劑量組(分別記為MED 1/2/3組)，STZ和MED組每組選取造模成功的SD大鼠6只。MED 1/2/3組灌胃劑量分別為0.25、0.50、1.0 g/(kg·d)；STZ組和CK組灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃28 d，期間每天記錄各組大鼠體重、飲水量、空腹血糖等狀況。灌胃結(jié)束后乙醚麻醉大鼠并解剖，心臟取血用于血脂分析，摘取心、肝、脾、肺、腎器官稱(chēng)重。無(wú)菌取結(jié)腸內(nèi)糞便用于腸道菌群分析。

1.4.3 空腹血糖濃度測(cè)定

禁食不禁水12 h后尾靜脈取血，按羅氏測(cè)糖儀使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血糖。

1.4.4 臟器系數(shù)測(cè)定

將1.4.2所取得的各內(nèi)臟器官稱(chēng)重記錄，按公式(1)計(jì)算各臟器系數(shù)：

(1)

1.4.5 脂類(lèi)分布測(cè)定

取0.3 g器官組織樣品，加3.0 mL氯仿甲醇溶液[V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2]研磨2 min，加入1.0 mL的氯仿研磨30 s，加入1.0 mL水研磨30 s。吸取下層1.0 mL于EP管中，水浴揮干溶劑并烘干至恒重，稱(chēng)取質(zhì)量m2，按公式(2)計(jì)算各器官組織脂類(lèi)蓄積量：

(2)

式中，mEP管為EP管的質(zhì)量；m樣品為所取器官組織樣品的質(zhì)量；n為稀釋倍數(shù)2。

1.4.6 腸道菌群16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序及分析

該實(shí)驗(yàn)委托天根生化科技有限公司。根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，構(gòu)建小片段文庫(kù)，基于Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序，得到雙端測(cè)序reads。采用CTAB或十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，以稀釋后的基因組DNA為模板；根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)條件

將1×loading buffer(含SYBR green)與PCR產(chǎn)物等量混合，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。選擇主帶亮度在400～450 bp的樣品進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，并使用TIANgel Purification Kit (TIANGEN Biotech)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物用于制備Illumina DNA文庫(kù)。使用TIANSeq快速DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(illumina平臺(tái))(TIANGEN Biotech)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和Agient2100文庫(kù)檢測(cè)，合格后，使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行PE250 bp測(cè)序，得到250 bp的雙端測(cè)序reads。通過(guò)對(duì)reads拼接過(guò)濾，序列去噪或者操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTUs)分組，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構(gòu)成，并進(jìn)行各組間的比對(duì)考察受試物對(duì)SD大鼠腸道菌群的影響。

1.4.7 血液有機(jī)酸的測(cè)定

大鼠血液處理：200 μL血液與600 μL 0.7 mol/L偏磷酸混旋30 s。在-4 ℃冷卻沉淀10 min后，12 000×g離心15 min，過(guò)0.22 μm水系膜。

液相色譜條件：Ultimate AQ-C18上海月旭(Welch)液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫25 ℃；流速0.7 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL。流動(dòng)相A為10 mmol/L pH 2.5磷酸二氫鉀，流動(dòng)相B為乙腈。丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、新戊酸、酒石酸流動(dòng)相條件為0～40 min，5% B；40～45 min，5%～30%；45～60 min，30% B；60～65 min, 30%～5% B；65～70 min, 5% B。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

各樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，利用SPSS進(jìn)行單因素方差分析(IBM SPSS Statistics 20.0，Duncan test)。對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch的分析流程進(jìn)行序列去噪或OTU聚類(lèi)，隨后再進(jìn)行物種分類(lèi)分析。根據(jù)去噪或者聚類(lèi)結(jié)果，對(duì)每個(gè)序列做物種注釋?zhuān)瑢?duì)去重序列擴(kuò)增子序列變體(amplicon sequence variants，ASVs)或OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性等分析以得到樣本內(nèi)物種豐富度/均勻度信息等，并比較不同樣品在物種多樣性方面的相似程度。擴(kuò)增子的注釋結(jié)果還可以利用PICRUST軟件相應(yīng)的功能數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)聯(lián)，對(duì)其KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)分析。通過(guò)偏最小二乘判別分析(partial least-squares discrimination analysis,PLS-DA)探究不同樣本或組別間群落結(jié)構(gòu)的差異。物種注釋部分利用R語(yǔ)言工具繪制成樣品各分類(lèi)學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MED對(duì)大鼠飲水量的影響

由圖1可知，STZ組大鼠飲水量明顯超過(guò)CK組，出現(xiàn)糖尿病的多飲癥狀。除第7天外，MED組大鼠飲水量均顯著低于STZ組(P<0.05)，說(shuō)明MED灌胃可一定程度上緩解糖尿病所引起的多飲癥狀，但不同組別間無(wú)顯著差異(除第13天和第25天外，P<0.05)。

圖1 MED對(duì)SD大鼠水?dāng)z入量的影響

2.2 MED對(duì)大鼠空腹血糖的影響

由圖2可知，STZ組大鼠空腹血糖值明顯高于CK組，出現(xiàn)顯著高血糖癥狀(P<0.05)，說(shuō)明造模成功。灌胃后MED組大鼠血糖雖有降低但仍>11.1 mmol/L。MED1和MED3組在灌胃前期短時(shí)間內(nèi)對(duì)血糖升高有緩解趨勢(shì)，但后期效果不明顯；MED2組后期降血糖效果較其他MED劑量組好，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 MED對(duì)SD大鼠空腹血糖的影響

2.3 MED對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

由圖3可知，大鼠注射STZ后各器官臟器系數(shù)均顯著或非顯著增高。臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等。在灌胃MED后，各MED組對(duì)于糖尿病引起的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)增大有一定的緩解作用。中劑量MED對(duì)于糖尿病導(dǎo)致的大鼠各器官臟器系數(shù)增大有一定的改善作用?？道璧萚15]的實(shí)驗(yàn)證明了EPA對(duì)于糖尿病引起的心臟臟器系數(shù)增大問(wèn)題有所改善，張敏芳等[16]的實(shí)驗(yàn)證明了EPA對(duì)于糖尿病引起的腎臟臟器系數(shù)增大問(wèn)題有積極作用。

圖3 MED對(duì)SD大鼠臟器指數(shù)的影響

2.4 MED對(duì)大鼠脂類(lèi)分布的影響

由圖4可知，STZ組的平均脂類(lèi)蓄積量均高于或顯著高于CK組，可能是糖尿病引起大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)[17]。MED組各器官脂類(lèi)蓄積量均高于或顯著高于STZ組，且MED組各器官脂類(lèi)蓄積量在脾臟、腎臟和肝臟中呈一定的劑量依賴(lài)性關(guān)系。MED不僅無(wú)法減緩糖尿病引起的脂質(zhì)蓄積量增長(zhǎng)，反而加劇了這種變化，這可能與MED中含有的ω-3系列不飽和脂肪酸EPA/DHA引起的脂類(lèi)代謝紊亂有關(guān)[2]。

圖4 MED對(duì)SD大鼠脂分布的影響

2.5 MED對(duì)大鼠腸道菌群的影響

2.5.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映的是樣本內(nèi)的微生物群落多樣性，通過(guò)對(duì)單個(gè)樣品的多樣性分析可以反映樣本內(nèi)的物種豐度及物種多樣性。Alpha多樣性衡量指標(biāo)有Chao1、Ace、Shannon、Simpson，見(jiàn)圖5。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高[18]。由圖5-a、圖5-b可知，和CK組相比，STZ組Chao1和Ace指數(shù)有降低，而MED2和MED3組可顯著提高該指數(shù)(P<0.05)，說(shuō)明中高M(jìn)ED可改善糖尿病引起的腸道菌群物種數(shù)量的降低。由圖5-c可知，中高劑量MED可改善糖尿病引起的腸道菌群物種多樣性的降低(P<0.05)。

a-α多樣性分析Chao1指數(shù)；b-α多樣性分析Ace指數(shù)；c-α多樣性分析Shannon指數(shù)；d-α多樣性分析Simpson指數(shù)

2.5.2 物種注釋及相關(guān)分析

將所測(cè)得的序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行對(duì)比得到每個(gè)物種分類(lèi)信息，生成不同分類(lèi)水平上的物種豐度表，并繪制各處理組在屬水平的相對(duì)豐度柱形累加圖(圖6)，取豐度水平前10的菌屬統(tǒng)計(jì)。

圖6 屬水平上各組腸道菌群物種相對(duì)豐度柱形累加圖

STZ組與CK組相比，乳桿菌屬的相對(duì)豐度略有減少；雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度有顯著增加(P<0.05)；Muribaculaceae的相對(duì)豐度明顯減少(P<0.05)。各MED組與STZ組相比，各處理實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度都有較為顯著的減少(P<0.05)，因此認(rèn)為MED可以有效改善糖尿病大鼠雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度至正常水平。MED1和MED2組Muribaculaceae的相對(duì)豐度相較于STZ組有所增加，因此一定程度上改善糖尿病大鼠Muribaculaceae的相對(duì)豐度。

于斌等[19]通過(guò)與健康人群比對(duì)后發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腸道雙歧桿菌屬顯著增加，乳酸桿菌屬顯著減少，且患者腸道內(nèi)的菌群多樣性有降低趨勢(shì)，說(shuō)明糖尿病會(huì)使得腸道菌群的種屬產(chǎn)生差異。李彩鳳[20]對(duì)多位糖尿病患者和同期相同數(shù)量的健康人員的腸道菌群變化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，糖尿病組Muribaculaceae、乳酸桿菌數(shù)量則低于健康組。而本文亦發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的Muribaculaceae和乳酸桿菌屬相對(duì)豐度低于健康組，該結(jié)論與本文所得結(jié)論一致。有研究表明腸道菌群失調(diào)和糖尿病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，給予糖尿病患者口服乳酸桿菌4周后，發(fā)現(xiàn)患者胰島素敏感性較治療前明顯改善[21]。推測(cè)MED能在一定程度上提高大鼠腸道Muribaculaceae和乳酸桿菌屬豐度，改善糖尿病治療效果。

2.5.3 PLS-DA

由圖7-a基于物種豐度的PLS-DA得出，MED2更顯著區(qū)別于其他MED處理組，且區(qū)別于STZ組，說(shuō)明MED中劑量對(duì)糖尿病大鼠腸道菌群在物種豐度方面產(chǎn)生特定影響；由圖7-b可知，MED2組在功能豐度方面區(qū)別于對(duì)照組，說(shuō)明MED2大鼠腸道菌群的功能不同于普通大鼠腸道菌群的功能；結(jié)合MED2組后期降血糖效果優(yōu)于其他MED劑量組，可以推測(cè)MED中劑量對(duì)使糖尿病大鼠的腸道菌群產(chǎn)生了較為積極的影響，這些影響可能更有利于糖尿病大鼠血糖的降低。

a-基于物種豐度的PLA-DA;b-基于功能豐度的PLS-DA

2.6 血液有機(jī)酸

各處理組血液中丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、新戊酸含量見(jiàn)圖8，各有計(jì)算含量均無(wú)顯著差異(P<0.05)，甲酸、乙酸、酒石酸未檢出。關(guān)于丙酸，STZ組、MED1組、MED2組的濃度相較于CK組均有升高趨勢(shì)，MED3 組未檢測(cè)出丙酸含量，MED2組相較于STZ組有下降趨勢(shì)，說(shuō)明糖尿病可導(dǎo)致血液中丙酸含量的上升，而中劑量MED對(duì)此有緩解趨勢(shì)。丁酸僅在STZ組和MED2組中檢測(cè)出，其余組未檢出，說(shuō)明糖尿病可引起丁酸含量的升高，而MED可緩解此趨勢(shì)。相較于CK組，STZ 組異戊酸濃度均有降低趨勢(shì)，相較于STZ組，MED組異戊酸均有升高趨勢(shì)，說(shuō)明糖尿病可降低異戊酸含量而MED具有改善作用。各處理組正戊酸的變化趨勢(shì)和異戊酸相似，MED可阻止糖尿病引起的正戊酸變化。新戊酸僅在STZ組、MED1組和MED2組中檢測(cè)出含有新戊酸，且MED2組新戊酸濃度增高趨勢(shì)明顯，其余組未檢出。糖尿病具有改變大鼠血液中的有機(jī)酸如丙酸、丁酸、異戊酸和正戊酸的趨勢(shì)，而MED可改善糖尿病大鼠血液中有機(jī)酸的變化。

圖8 各處理組血液中有機(jī)酸的含量

3 結(jié)論

本文研究發(fā)現(xiàn)，MED灌胃對(duì)糖尿病引起的多飲癥狀有一定的緩解作用，低劑量和高劑量MED在短時(shí)間內(nèi)對(duì)血糖升高有緩解趨勢(shì)，但后期效果不明顯；MED中劑量后期降血糖趨勢(shì)較其他MED劑量組好。MED對(duì)于糖尿病引起的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)增大有一定的緩解作用；尤其中劑量MED對(duì)于降低糖尿病導(dǎo)致的大鼠各器官臟器系數(shù)的增大有較好的改善趨勢(shì)，但是會(huì)引起脂類(lèi)在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟中的蓄積。

糖尿病對(duì)大鼠體內(nèi)腸道菌群有一定影響，中高M(jìn)ED可改善糖尿病引起的腸道菌群物種數(shù)量的降低；MED可以有效改善糖尿病大鼠雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度至正常水平，但僅MED中低劑量組在一定程度上改善糖尿病大鼠Muribaculaceae的相對(duì)豐度，并且中劑量對(duì)使糖尿病大鼠的腸道菌群產(chǎn)生了較為積極的影響。同時(shí)糖尿病會(huì)對(duì)大鼠血液的有機(jī)酸濃度產(chǎn)生影響，而MED可以一定程度上調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血液中有機(jī)酸如丙酸、丁酸、異戊酸和正戊酸的含量。本文初步研究了MED對(duì)糖尿病大鼠多飲癥、空腹血糖、臟器系數(shù)、脂類(lèi)分布、腸道菌群以及血液中有機(jī)酸的影響，為MED在Ⅱ型糖尿病方面的作用提供一定的理論依據(jù)。