王文玉，張濤

(江南大學(xué)， 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

瓜氨酸是一種天然的非蛋白質(zhì)α-氨基酸，存在于植物[1]、哺乳動(dòng)物[2]和微生物[3]中。作為一種重要的功能性氨基酸，其在人體代謝中參與“NO循環(huán)”生成重要的信號(hào)分子NO[4]；另一方面，還參與“尿素循環(huán)”消除增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的有害氨[5]。研究表明，瓜氨酸不被肝臟或腸道精氨酸酶分解，并能繞過(guò)肝臟攝取和降解[6]，同時(shí)還是精氨酸酶的抑制劑[7]，因此，瓜氨酸在提高精氨酸的生物利用度和NO產(chǎn)量方面比精氨酸更加有效[8]，被應(yīng)用于治療代謝綜合征[9]、心血管疾病[10]、勃起功能障礙[11]以及提高運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)力[7]和抗氧化[12]等方面，作為一種有吸引力的藥物營(yíng)養(yǎng)素，瓜氨酸能潛在的解決許多與生活方式或者與年齡有關(guān)的疾病，故被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域。

目前，瓜氨酸可通過(guò)天然植物提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵和微生物酶法等方法進(jìn)行生產(chǎn)[13]。酶法轉(zhuǎn)化因條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、環(huán)境友好和下游分離純化簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)而成為研究熱點(diǎn)[14]。精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase，ADI, EC 3.5.3.6)作為生產(chǎn)瓜氨酸的關(guān)鍵酶，不可逆地催化精氨酸水解為瓜氨酸和氨，至今，已有許多不同微生物來(lái)源的ADI被報(bào)道，包括支原體(Mycoplasmaarginini)、乳酸球菌(Lactococcuslactisssp.Lactis)、鹽桿菌(Halobacteriumsalinarium)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)等[3]。大多ADI的最適溫度在37～60 ℃，來(lái)源于L.lactissubsp.lactis的ADI最穩(wěn)定，在50 ℃的半衰期為90 min[15]；而來(lái)源于L.lactis的突變體酶活力最高，為195.7 U/mg[14]。應(yīng)用ADI進(jìn)行瓜氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)不僅希望ADI具有較高的催化活力進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化；還希望ADI有較好的熱穩(wěn)定性適配工業(yè)生產(chǎn)需要，因?yàn)榉磻?yīng)在較高溫度下進(jìn)行可以增加底物的溶解度和生物利用度、提高反應(yīng)速度、減少中溫菌污染[16]。除了用于制備瓜氨酸，由于ADI具備消耗精氨酸的能力，還用于治療外源性精氨酸依耐性癌細(xì)胞，如肝癌、黑色素瘤等營(yíng)養(yǎng)缺陷型癌細(xì)胞，但在臨床應(yīng)用上也存在半衰期短和免疫原性等問(wèn)題[17]。

為了獲得具有目的性質(zhì)的酶，除了進(jìn)行新酶篩選外，對(duì)現(xiàn)存的酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造也是一種有效的手段。蛋白質(zhì)工程是一種基于重組DNA技術(shù)進(jìn)而改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的方法，能改造天然酶使其具有所需功能[18]。近年來(lái)，出現(xiàn)的許多酶工程策略，包括定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等方式，其中使用計(jì)算機(jī)輔助酶的理性設(shè)計(jì)是研究的一大熱點(diǎn)[19]。ADI的定向進(jìn)化研究較多，鮮少利用理性設(shè)計(jì)改善其熱穩(wěn)定性的報(bào)道，CAI等[13]利用HoTMuSiC預(yù)測(cè)的氨基酸溫度因子(B-factor)進(jìn)行了來(lái)源于EnterococcusfaecalisSK23.001的ADI定點(diǎn)突變，得到的2個(gè)單點(diǎn)突變體F269Y以及G292P在45 ℃下的半衰期較原始酶分別提高了3.4倍和5.6倍，雙點(diǎn)組合突變體F269Y/G292P半衰期提高了5.9倍。HotSpot Wizard網(wǎng)頁(yè)服務(wù)器可自動(dòng)識(shí)別熱點(diǎn)用于提高酶的穩(wěn)定性、催化活性和底物特異性的非保守氨基酸，這些氨基酸可分為基于序列的保守但不相同的殘基和共同進(jìn)化殘基以及基于三維結(jié)構(gòu)的熱點(diǎn)，已成功應(yīng)用于許多酶的改造[20]。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)了來(lái)源于奧氏嗜熱鹽絲菌的精氨酸脫亞胺酶(H-ADI)，通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)鑒定后發(fā)現(xiàn)該酶的熱穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提升，因此，本研究基于三維結(jié)構(gòu)分析和HotSpot Wizard在線服務(wù)器，對(duì)來(lái)源于奧氏嗜熱鹽絲菌的H-ADI進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造，并將突變體應(yīng)用于瓜氨酸的實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)及帶有目的基因的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-H-ADI均保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

液體LB培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10、胰蛋白胨10、酵母提取物5，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、上樣緩沖液(5×)、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液，雅酶(上海)生物醫(yī)藥科技公司；核酸染料(4S Green Plus)、IPTG、咪唑(C3H4N2)、瓊脂糖，生工生物(上海)工程有限公司；核酸Marker、2×PrimeSTAR Max Premix、Q.cut Dpn I、Q.cut Buffer(10×)、限制性內(nèi)切酶，寶生物(TaKaRa)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，諾唯贊(南京)生物科技有限公司；Ni-NTA親和層析填料，通用電氣醫(yī)療(GE Healthcare)公司；其他分析純及以上試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Aminex HPX-87column型蛋白電泳儀、T100型PCR儀，德國(guó)Eppendorf有限公司；DYY-68型蛋白電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；ZCZY-CS8型恒溫培養(yǎng)搖床、DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；GI54DWS型立式高壓滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)、VWD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；Nano DSC差式掃描量熱儀，美國(guó)Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精氨酸脫亞胺酶的同源建模及突變位點(diǎn)選擇

奧氏嗜熱鹽絲菌來(lái)源的H-ADI的NCBI登錄號(hào)為WP_012635610.1，選取氨基酸同源性大于30%且已解析晶體結(jié)構(gòu)的蛋白序列作為模板提高建模的準(zhǔn)確性。應(yīng)用SWISS-MODEL在線建模服務(wù)器對(duì)來(lái)源于奧氏嗜熱鹽絲菌的H-ADI進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，使用PROCHECK服務(wù)器檢測(cè)模型質(zhì)量。此外，將H-ADI的蛋白序列提交至HotSpot Wizard在線服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測(cè)，再結(jié)合結(jié)構(gòu)分析之后，選擇了G65N、E81D、F111L、N142L、T180Y、V187T、A190P、T215Y、A231L、Q255M這10突變位點(diǎn)。采用簡(jiǎn)便的QuikChangeTM法進(jìn)行定點(diǎn)突變，引物序列如表1所示。

表1 突變位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

1.3.2 突變菌株構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-H-ADI為模板，進(jìn)行全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為模板質(zhì)粒1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，Primer STAR Max 25 μL，ddH2O 20 μL。

PCR條件設(shè)置：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃繼續(xù)延伸3 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在37 ℃條件下用DpnⅠ消化2 h去除甲基化的模板質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，卡那霉素抗性固體平板進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選，測(cè)序成功的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)獲得突變重組菌株。

1.3.3 突變體的純化表達(dá)

挑取在卡那霉素抗性(Kan 50 μg/mL)固體平板生長(zhǎng)的野生型和突變型E.coliBL21(DE3)工程菌株單菌落于5 mL液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h后按2%的接種量轉(zhuǎn)接至200 mL液體培養(yǎng)基(Kan 50 μg/mL)，在37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在28 ℃，200 r/min下培養(yǎng)6 h誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，于6 000 r/min，4 ℃離心5 min收集菌體。

15 mL細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，100 mmol/L NaCl，pH 7.0)重懸菌體后置于冰盒中，在超聲破碎機(jī)(功率200 W，開(kāi)1 s停2 s)持續(xù)破碎20 min，然后于4 ℃，8 000 r/min離心5 min收集上清液，即粗酶液；將粗酶液上樣Ni-NTA親和層析柱后用上樣緩沖液液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，500 mmol/L NaCl，pH 7.0)除去未結(jié)合的蛋白，再用雜蛋白洗脫液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH 7.0)去除結(jié)合較弱的雜蛋白，最后用洗脫緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.0)洗脫得到目的蛋白。分離純化后的酶溶液置于透析袋中于4 ℃條件下透析3次，透析液隔6 h更換1次。首先在50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0，含10 mmol/L EDTA·2Na)中透析1次去除金屬離子，再在50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)透析2次。

采用SDS-PAGE測(cè)定蛋白亞基分子質(zhì)量和純度；此外，采用Lowry法測(cè)定突變體酶的蛋白濃度，使其在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中保持添加量相同。

1.3.4 酶活力測(cè)定

酶反應(yīng)體系：總體積為1 mL，500 μL 100 g/LL-精氨酸(pH 6.5)，0.05 mg重組酶，剩余體積用50 mmol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足。反應(yīng)體系放入55 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)10 min，轉(zhuǎn)化完成后迅速將其沸水浴10 min。滅活后的反應(yīng)液置于12 000 r/min下離心5 min，取適量上清液進(jìn)行產(chǎn)物瓜氨酸的濃度測(cè)定。

酶活定義(1 U)：在反應(yīng)測(cè)定條件下，以L-精氨酸作為底物，每分鐘水解催化精氨酸生成1 μmol瓜氨酸所需的酶量。

參照J(rèn)IANG等[21]的檢測(cè)方法對(duì)產(chǎn)物瓜氨酸進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 重組酶的熱穩(wěn)定性研究

將酶液分別在45、50、55 ℃ 3個(gè)溫度下恒溫水浴，每間隔30 min取出相應(yīng)體積保溫后的酶液按1.3.4中的條件測(cè)定其殘余酶活力，將未經(jīng)保溫(0 h)的H-ADI重組酶的酶活力設(shè)定為100%。

1.3.6 重組酶的變性溫度測(cè)定

將酶液質(zhì)量濃度稀釋至1 mg/mL，在0.84×105Pa條件下對(duì)酶液和透析液脫氣處理10 min，加入樣品，注意不要引入氣泡，設(shè)定設(shè)備運(yùn)行參數(shù)為在10～100 ℃掃描且以1 ℃/min的速率進(jìn)行程序升溫，壓力為0.3 MPa。測(cè)定結(jié)果使用Nano-Analyze進(jìn)行處理和分析，采用Two-State Scaled模型對(duì)其進(jìn)行擬合后得到重組酶Tm值。

1.3.7 重組酶的結(jié)構(gòu)分析

同源建模后的三維結(jié)構(gòu)采用Pymol進(jìn)行可視化，DNAMAN軟件用于核酸和蛋白序列比對(duì)。

1.3.8 重組酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

在軟件Gromacs中能量最小化后，在328 K以15 ns的速率展開(kāi)分子動(dòng)力學(xué)模擬，并采用gmx rmsf程序計(jì)算模擬過(guò)程中原子偏離平衡位置的均漲落方根(root mean square fluctuation，RMSF)，進(jìn)而了解突變氨基酸對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響。

1.3.9 瓜氨酸的生產(chǎn)

以100 g/L的精氨酸為底物(pH 6.5)，加入5 g/L誘導(dǎo)后的濕菌體，在55 ℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，定時(shí)取樣測(cè)定產(chǎn)物瓜氨酸的含量。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)，所有測(cè)量數(shù)據(jù)使用Excel和Origin進(jìn)行處理分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點(diǎn)選擇及突變體構(gòu)建

選取已解析晶體結(jié)構(gòu)且氨基酸同源性最高(62.59%)的來(lái)源于Streptococcuspyogenes的ADI(PDB:4BOF)作為模板，得到了H-ADI的三維結(jié)構(gòu)，PROCHECK服務(wù)器檢測(cè)模型質(zhì)量，如圖1-a所示,拉氏構(gòu)象圖結(jié)果表明90.3%的氨基酸處于紅色的完全允許區(qū)，圖1-b Errat程序結(jié)果表明H-ADI三維結(jié)構(gòu)的總體質(zhì)量得分為92.327%，因此，該同源建模的結(jié)構(gòu)已經(jīng)比較接近其真實(shí)結(jié)構(gòu)。

a-拉氏構(gòu)象圖；b-Errat評(píng)價(jià)

HotSpot Wizard服務(wù)器能將輸入的序列與資源庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，由于酶在進(jìn)化過(guò)程中也趨向于在同一位點(diǎn)保持相同的氨基酸，所以位于柔性區(qū)域或者最常出現(xiàn)在特定位置的非保守氨基酸可能會(huì)影響整個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[20]。將獲得的三維結(jié)構(gòu)上傳到HotSpot Wizard在線服務(wù)器，識(shí)別與結(jié)構(gòu)靈活性、序列一致性或共進(jìn)化相關(guān)的氨基酸殘基進(jìn)行熱穩(wěn)定性突變熱點(diǎn)的預(yù)測(cè)；此外，將預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)結(jié)合三維結(jié)構(gòu)過(guò)濾可能的有害位點(diǎn)。

以重組質(zhì)粒pET-28a(+)-H-ADI為模板，進(jìn)行定點(diǎn)突變。將測(cè)序成功的突變體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化后，所有突變體酶均成功表達(dá)，在相同上樣量情況下條帶粗細(xì)無(wú)明顯差異，表明突變體的表達(dá)量基本一致；此外，條帶單一且與野生型一致，亞基大小在47 kDa。

2.2 突變體酶活力和變性溫度

測(cè)定突變酶的蛋白濃度后，添加與野生酶相同酶量進(jìn)行酶活力測(cè)定；此外，將各個(gè)H-ADI的濃度稀釋到相同濃度進(jìn)行差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry，DSC)測(cè)定進(jìn)而確定其變性溫度，結(jié)果如表2所示。突變體E81D、F111L、N142L、T215Y以及Q255M相較野生型來(lái)說(shuō)，酶活力都有小幅度提高，但是Tm值較野生酶分別下降了1.27、1.27、0.63、0.2、3.55 ℃；G65N、V187T和A231L的酶活力和變性溫度都沒(méi)有提高，只有T180Y和A190P的Tm值分別提高了2.5、1.96 ℃，其有序疊加組合突變體T180Y/A190P的Tm值提高了5.26 ℃，但三者的酶活力分別下降為野生酶的91.36%、80.53%和78.41%。

表2 H-ADI及其突變體的相對(duì)酶活和Tm值

2.3 正向突變體的熱穩(wěn)定性

對(duì)Tm值提高的2個(gè)單點(diǎn)及其組合突變進(jìn)行最適溫度以及溫度穩(wěn)定性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2，單點(diǎn)突變體T180Y和A190P的最適溫度相比野生型沒(méi)有提高，而雙點(diǎn)組合突變體T180Y/A190P最適溫度提高了5 ℃，說(shuō)明兩點(diǎn)疊加的效果存在加和效應(yīng)。此外，在50 ℃條件下對(duì)這3個(gè)正向突變體的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，相比于野生型在50 ℃保溫180 min后只有原始酶活力的25%，突變體在50 ℃保溫180 min后的殘余酶活力均有不同的提高，T180Y、A190P分別能保持55%、48%的相對(duì)酶活力，而雙點(diǎn)組合突變體能保持66.8%的酶活力，說(shuō)明定點(diǎn)突變提升了H-ADI的熱穩(wěn)定性。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性

2.4 精氨酸脫亞胺酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

RMSF指的是原子在模擬體系中在平衡時(shí)間點(diǎn)偏離平均位置的幅度，代表原子自由運(yùn)動(dòng)的程度進(jìn)而表征某個(gè)蛋白區(qū)域的柔性，RMSF數(shù)值越大代表該位置的氨基酸柔性越大，該區(qū)域的穩(wěn)定性越差[22]。借助同源建模獲得復(fù)合突變體T180Y/A190P的三維模擬結(jié)構(gòu)；將野生型H-ADI和突變體T180Y/A190P在328 K以15 ns的速率展開(kāi)分子動(dòng)力學(xué)模擬，整個(gè)軌跡的RMSF如圖3所示。野生型和突變型的大部分氨基酸RMSF值都小于0.4，但位于125～150位氨基酸的RMSF值都達(dá)到了0.8，說(shuō)明該部分的氨基酸柔性較其他區(qū)域較大，而該區(qū)域正好是H-ADI三維結(jié)構(gòu)中的五螺旋束結(jié)構(gòu)域。不同來(lái)源的ADI在該螺旋束結(jié)構(gòu)域的序列和長(zhǎng)度有很大變化，但該部分基本是由芳香族和疏水側(cè)鏈構(gòu)成的疏水核心，其作用還不清晰[23]。此外，野生型的RMSF值整體高于或接近于突變體，但也出現(xiàn)了突變體RMSF值高于野生型的區(qū)域和位點(diǎn)，而180位點(diǎn)和190位點(diǎn)剛好位于該區(qū)域；因此，表明這2個(gè)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致蛋白在該區(qū)域的柔性降低、剛性增強(qiáng)從而使其具有更高的熱穩(wěn)定性。

圖3 野生型H-ADI和突變體的RMSF分析

2.5 突變位點(diǎn)分析

有研究為了探索影響蛋白熱穩(wěn)定性的因素，對(duì)大量同源的嗜熱和中溫蛋白的氨基酸類型進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)Arg、Glu和Tyr由于其結(jié)構(gòu)特征在嗜熱蛋白表面出現(xiàn)的頻率較高[24]。此外，大多數(shù)蛋白質(zhì)含有許多小的空腔，這些空腔可以由更大的殘基來(lái)填充進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[25]。對(duì)H-ADI而言，180位點(diǎn)位于其結(jié)構(gòu)表面(圖4)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明由Thr變化為Tyr增強(qiáng)了其的穩(wěn)定性，從該位點(diǎn)的三維表面結(jié)構(gòu)可以看出，Tyr的側(cè)鏈基團(tuán)相較于Thr較大，填充了相鄰的一個(gè)表面空穴，因而可能加強(qiáng)了H-ADI的穩(wěn)定性。此外，芳香環(huán)作用也是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要驅(qū)動(dòng)力，主要包括芳香環(huán)和陽(yáng)離子(帶正電的Lys、Arg和His)之間的作用(陽(yáng)離子-π)或者芳香環(huán)之間的相互作用(π-π)，芳香環(huán)和陽(yáng)離子間的相互作用是一種強(qiáng)的非共價(jià)鍵合力[26]，突變后的Tyr與空間位置與較近的Arg269可能存在陽(yáng)離子-π的相互作用而提高了其熱穩(wěn)定性。但另一方面，180位點(diǎn)位于與底物進(jìn)出相關(guān)的loop環(huán)上，突變?yōu)門yr后較大的側(cè)鏈集團(tuán)以及與Arg269位點(diǎn)形成的非共價(jià)鍵合力降低了loop環(huán)的柔性進(jìn)而降低了該酶的催化活力。

a-H-ADI 180位氨基酸突變前結(jié)構(gòu)；b-H-ADI 180位氨基酸突變后結(jié)構(gòu)；c-H-ADI 180位突變后氨基酸與相鄰269位氨基酸的芳香環(huán)作用

環(huán)狀亞氨基酸是Pro特有的結(jié)構(gòu)，其具有的吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)使其具有較好的剛性結(jié)構(gòu)；根據(jù)結(jié)構(gòu)和統(tǒng)計(jì)分析，在β轉(zhuǎn)角的第2個(gè)位置和α-螺旋N1的Pro偏好位置進(jìn)行Pro取代能增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性[27]。此外，還有研究表明因?yàn)镻ro在氨基基團(tuán)少1個(gè)H原子，且不能形成α螺旋所需的φ角，所以α螺旋中基本不出現(xiàn)Pro[28]。在H-ADI的190位點(diǎn)，Ala突變?yōu)镻ro提高了該H-ADI熱穩(wěn)定性，值得注意的是該位點(diǎn)位于α螺旋的中間位置(圖5-a)。在另一個(gè)研究中，來(lái)自penicilliumverruculosum的內(nèi)切葡聚糖酶的脯氨酸理性設(shè)計(jì)突變中，最穩(wěn)定的突變體S308P在70 ℃下的半衰期相較野生酶提高了4倍，并且該位點(diǎn)也位于α螺旋的中間結(jié)構(gòu)[29]。借助DynaMut服務(wù)器[30]評(píng)估該突變位點(diǎn)對(duì)H-ADI的穩(wěn)定性影響，結(jié)構(gòu)表明從Ala突變?yōu)镻ro后，增加了與相鄰氨基酸殘基之間的疏水相互作用和極性相互作用(圖5-b)；此外，該突變體的折疊自由能(ΔΔG)為5.19 kJ/mol，證明該突變有利于增強(qiáng)H-ADI的穩(wěn)定性。

a-H-ADI 190位氨基酸突變后的結(jié)構(gòu)分析；b-與相鄰氨基酸的相互作用

2.6 瓜氨酸的生產(chǎn)

誘導(dǎo)后的濕菌體按照5 g/L加入100 g/L的精氨酸反應(yīng)體系中，55 ℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 野生型和突變型生產(chǎn)瓜氨酸

突變體和野生型均在轉(zhuǎn)化開(kāi)始的2 h內(nèi)快速生成產(chǎn)物瓜氨酸，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化過(guò)程趨于平緩。單點(diǎn)突變體T180Y與野生型的瓜氨酸轉(zhuǎn)化過(guò)程相似，但T180Y的產(chǎn)量比野生型高了2 g/L，而A190P突變體的轉(zhuǎn)化速率和產(chǎn)物生成量均低于野生型，可能是因?yàn)锳190P的比酶活力只有野生型的80.53%，而變性溫度只提高了1.96 ℃，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中影響不大。通過(guò)有序疊加獲得的雙點(diǎn)突變體T180Y/A190P在前1 h的轉(zhuǎn)化速率比野生型高12.5%，并且瓜氨酸最終產(chǎn)量也比野生型高5 g/L。SONG等[14]將來(lái)源于L.lactis的ADI異源表達(dá)于大腸桿菌工程菌，通過(guò)易錯(cuò)PCR得到了酶活提高的突變體FMME106，在50 ℃的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，F(xiàn)MME106相較于野生型提高了14.2%的產(chǎn)量，且最初的反應(yīng)速率也提高了21.4%；另一方面，F(xiàn)MME106在8 h轉(zhuǎn)化后瓜氨酸產(chǎn)量達(dá)到了45 g/L，而H-ADI以及突變體在55 ℃進(jìn)行8 h轉(zhuǎn)化后，瓜氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了50～60 g/L?？偟膩?lái)說(shuō)，在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，由于酶會(huì)處于一定的溫度進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的生產(chǎn)，所以較好的熱穩(wěn)定性能保持較高的酶活力持續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使得產(chǎn)物的產(chǎn)量提高；因此，熱穩(wěn)定性改造對(duì)于工業(yè)酶具有重要意義。

3 結(jié)論

通過(guò)理性設(shè)計(jì)獲得了來(lái)源于奧氏嗜熱鹽絲菌的3個(gè)熱穩(wěn)定性提高的突變體T180Y、A190P和T180Y/A190P，其酶活力為野生型的91.36%、80.53%和78.41%，變性溫度(Tm)較野生酶分別提高了2.5、1.96、5.26 ℃，T180Y和A190P的最適溫度與野生酶相同，而T180Y/A190P的最適溫度提高了5 ℃。在50 ℃下保溫180 min后，T180Y、A190P和T180Y/A190P殘余酶活力分別提高了30%、23%和41.8%。三維結(jié)構(gòu)分析表明表面空穴填充和芳香環(huán)作用是T180Y熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的可能原因，而A190P則可能是由于脯氨酸的吡咯環(huán)剛性結(jié)構(gòu)以及空間相鄰殘基之間的疏水作用增強(qiáng)了其熱穩(wěn)定性。將獲得的突變體應(yīng)用于瓜氨酸生產(chǎn)，T180Y/A190P的瓜氨酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率均優(yōu)于野生型。該研究為其他微生物來(lái)源的工業(yè)酶以及酶的理性改造提供了思路和參考。