張化朋,李鳳娟,張顏廷,劉虹,莊金麗,劉敬蘭,王靜
(山東鳳凰生物科技股份有限公司,山東 泰安,271000)
益生菌是指食用一定量后對機(jī)體健康有益的活的微生物,它們能夠通過自身的繁殖代謝、調(diào)節(jié)微生物群的結(jié)構(gòu)、發(fā)揮益生作用[1]。研究證實(shí),腸道菌群是維持機(jī)體消化、代謝、免疫等重要生命活動(dòng)平衡的重要因素[2]。免疫是人體健康的基石,機(jī)體免疫功能失調(diào)可能會引起過敏、炎癥、腫瘤或易受到病原微生物感染等健康問題。研究顯示,腸道菌群通過腸相關(guān)淋巴組織影響免疫系統(tǒng)的發(fā)展和調(diào)節(jié),腸相關(guān)淋巴組織是機(jī)體抵御病原體、病毒和其他有害微生物的一道重要防線[3]。研究結(jié)果顯示,益生菌可通過增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能,提高機(jī)體抗氧化功能并降低炎癥水平,調(diào)控免疫細(xì)胞活性和增強(qiáng)細(xì)胞吞噬功能等多種方式調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能,促進(jìn)機(jī)體健康[4]。乳酸桿菌、雙歧桿菌等通過發(fā)酵腸道中不易消化的成分產(chǎn)生短鏈脂肪酸等有益代謝產(chǎn)物,降低腸道pH值,促進(jìn)黏膜細(xì)胞的生長、降低炎癥、提高腸道的穩(wěn)定性[5-6]。乳酸菌菌種資源豐富,廣泛存在于動(dòng)植物、空氣、土壤等環(huán)境中,其中在動(dòng)物體內(nèi)和傳統(tǒng)發(fā)酵食品中尤為豐富。長壽人群作為一個(gè)特殊群體,研究顯示,其腸道菌群豐度及結(jié)構(gòu)存在顯著差異,腸道菌群豐度增加,具有更高的多樣性,其中一些潛在的有益菌的豐度仍隨著年齡而富集[7-9]。本研究擬從長壽老人糞便中分離篩選益生菌菌株,并對其進(jìn)行系統(tǒng)的理化特性、抗逆性及安全性分析,以及小鼠體內(nèi)免疫功能和調(diào)節(jié)腸道菌群的評價(jià),以期開發(fā)新的益生菌菌種資源,為功能性益生菌菌株的產(chǎn)業(yè)化研究及應(yīng)用提供性能優(yōu)良、安全的菌株資源。
SPF級昆明小鼠(18±2)g(合格證:NO.370726200100423072),濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;MRS固體培養(yǎng)基、EMB瓊脂(伊紅美藍(lán)瓊脂)、BEA瓊脂(疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂)、BBL瓊脂、LBS瓊脂、TSC瓊脂(胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂)培養(yǎng)基、脫纖維綿羊血,青島海博生物技術(shù)有限公司;濃鹽酸、異丙醇、2-巰基乙醇,均為試劑純,濟(jì)南天泰化工有限公司;NaCl、K2HPO4、氫氧化鈉、碳酸鈉、谷氨酰胺、乳酸鋰、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽,均為試劑純,天津凱通試劑公司;豬膽鹽、胃蛋白酶、胰酶、RPM1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]、Hank’s液、青霉素、鏈霉素、藥敏片,北京索萊寶試劑公司;YAC-1細(xì)胞,深圳市豪地華拓生物科技有限公司;乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40,NP40),上海躍騰生物技術(shù)有限公司;環(huán)磷酰胺,山西普德制藥有限公司;印度墨汁,上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司。
F50酶標(biāo)儀,Infinite公司;CX21FS1電子生物顯微鏡,Olympus公司;ML204電子分析天平,Mettler Toledo公司;DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BPN-50CH二氧化碳培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;CL5高速離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;THZ-C型恒溫振蕩器,蘇州培英實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;BCD-256 WDGH型冰箱,青島海爾股份有限公司;SJ-CJ-2D超凈工作臺,蘇潔凈化設(shè)備有限公司;BHC-1300-A2生物安全柜,蘇州通潔凈化科技有限公司;LDZX-75KBS高壓滅菌鍋,山東新華醫(yī)療器械公司;PHS-3C酸度計(jì),上海雷磁科學(xué)儀器公司。
1.3.1 分離與鑒定
采集一位山東煙臺市百歲健康老人的新鮮糞便,用無菌取樣瓶封好后置入冰盒內(nèi),無菌條件下取糞便中部1 g樣品至100 mL帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中,180 r/min搖勻30 min后,移液管吸取1~2 mL搖勻的混懸液于滅菌MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧富集培養(yǎng)24 h后,用無菌接種針蘸取培養(yǎng)液在含3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基劃線,37 ℃厭氧恒溫靜置培養(yǎng)48 h后,挑取培養(yǎng)基上具有明顯透明圈的單菌落,接種到MRS斜面上培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。純化菌株送檢中科院微生物研究所進(jìn)行菌株生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等綜合分析鑒定。
1.3.2 抗逆性與安全性分析
耐酸耐膽鹽評價(jià):將分離篩選獲得的菌株活化后,接種于滅菌的液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h,按4%轉(zhuǎn)接量分別接種于pH 2.0和含0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽鹽的滅菌MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng),分別于0、1、2 h取菌懸液,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),計(jì)算菌株耐酸耐膽鹽能力[10]。
人工胃液配制及菌株耐受性檢測:準(zhǔn)確量取20 mL的1 mol/L鹽酸加蒸餾水調(diào)節(jié)pH值為2.5,加入胃蛋白酶(1 g/100mL),充分溶解后,用孔徑為0.22 μm濾膜過濾除菌即可。菌液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種于模擬胃液中,在37 ℃條件下培養(yǎng)0.5、1、2 h,取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),以0 h活菌數(shù)為對照,計(jì)算存活率[11]。
人工腸液配制及菌株耐受性檢測:參照關(guān)小鶯等[11]方法改進(jìn)。取磷酸二氫鉀6.8 g,加水500 mL溶解,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8,另取胰酶10 g,加水適量溶解,將兩液混合后加水稀釋至1 000 mL。菌液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種于模擬腸液中,在37 ℃條件下培養(yǎng)2、4、6、8 h,取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),以0 h活菌數(shù)為對照,計(jì)算存活率。
藥敏試驗(yàn):將純化的菌體劃線取單菌落,懸于3 mL生理鹽水中,并調(diào)整菌體濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝弧S妹藓灳鶆蛲坎糓RS培養(yǎng)基表面,用滅菌鑷子取不同藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面,培養(yǎng)18~24 h后取出,通過測量抑菌圈直徑,確定菌株對不同抗生素的敏感程度[12]。
1.3.3 體內(nèi)功能評價(jià)
體內(nèi)功能評價(jià)實(shí)驗(yàn)方法參考保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2003]42號)。
1.3.3.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級雄性昆明小鼠,體重(20±2) g,每組40只,預(yù)飼7 d后,進(jìn)行灌胃給藥處理;實(shí)驗(yàn)分組:設(shè)空白對照組、模型組、陽性對照組(某品牌增強(qiáng)免疫力保健食品,主要活性成分為1.1 g/100g總皂苷、0.3 g/100g粗多糖)和3個(gè)菌粉組,具體給藥劑量見表1,連續(xù)給藥30 d??瞻讓φ战M除外,在第20天連續(xù)2 d小鼠腹腔注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)進(jìn)行免疫抑制造模處理,連續(xù)灌胃30 d后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理及指標(biāo)檢測[13-14]。
表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理方式
1.3.3.2 免疫器官指數(shù)測定
末次給藥結(jié)束后,禁食不禁水12 h,稱量小鼠體重,采用斷頸處死小鼠后,解剖取小鼠脾臟和胸腺,去除粘連組織,濾紙吸干后稱重,免疫臟器指數(shù)計(jì)算如質(zhì)量公式(1)所示:
(1)
1.3.3.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
小鼠實(shí)驗(yàn)期滿,無菌取出脾臟,置于盛有Hank′s液的平皿中,用鑷子輕輕將脾磨碎,經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾,1 000 r/min離心5 min,用Hank′s液清洗兩次,棄清液,收集細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)液中,用臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),保證活細(xì)胞比例≥95%,調(diào)整脾細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL備用。
脾細(xì)胞增殖試驗(yàn):將脾細(xì)胞懸液分兩孔加入至24孔培養(yǎng)板中1 mL/孔,取一孔加75 μL 7.5 μg/mL的ConA液,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)68 h,每孔吸去上清液0.7 mL,加入0.7 mL不含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液及50 μL濃度為 5 mg/mL 的MTT液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入1 mL酸性異丙醇,吹打均勻至完全溶解紫色結(jié)晶后分裝至96孔板,然后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定光密度值(OD),添加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。
1.3.3.4 小鼠血清凝血素的測定
小鼠血清凝血素的測定采用血凝法,取脫纖維綿羊血,用生理鹽水洗滌離心(1 000 r/min,5 min)3次,將壓積脫纖維綿羊血細(xì)胞用生理鹽水配成2%(體積分?jǐn)?shù))的細(xì)胞懸液,每只鼠腹腔注射0.2 mL進(jìn)行免疫,5 d后,摘除眼球取血,37℃水浴30 min使血清析出,離心(3000 r/min,10 min)收集血清。
取微量血凝板,每孔加100 μL血清,用生理鹽水倍比稀釋血清,再加入100 μL 0.5%(體積分?jǐn)?shù))SRBC懸液,混勻,加蓋后于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h,觀察血球凝集程度。血清凝集程度按照5級(0~4級)記錄,按照公式(2)計(jì)算抗體積數(shù):
抗體水平=(S1+2S2+3S3……nSn)
(2)
式中:1,2,3……n代表倍比稀釋的指數(shù),S代表凝集程度的級別。
1.3.3.5 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)
末次給藥結(jié)束后,禁食不禁水12 h,稱量小鼠體重,從小鼠尾靜脈注射印度墨汁(100 mL/kg,生理鹽水稀釋4倍),注入墨汁2 min和10 min后,用毛細(xì)管從眼眥靜脈取血20 μL,立即吹打至2 mL 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液中,用Na2CO3溶液作空白對照,測定600 nm處光密度值。同時(shí)處死小鼠,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干血污后精確稱重。按照公式(3)~公式(4)計(jì)算吞噬指數(shù)A:
(3)
(4)
式中:OD1為注射墨汁后2 min(t1)光密度值;OD2為注射墨汁后10 min(t2)光密度值。
1.3.3.6 自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK細(xì)胞)活性測定
實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),用Hank′s液清洗3次,用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。
效應(yīng)細(xì)胞制備:無菌取出脾臟,置于盛有Hank′s液的平皿中,通過磨碎處理,制備單細(xì)胞懸液,過濾后用Hank′s液離心(1 000 r/min,10 min)處理清洗2次,加入滅菌水裂解紅細(xì)胞,再加入Hank′s液進(jìn)行離心處理,用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸,用1%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù),保證活細(xì)胞比例≥95%,調(diào)整脾細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。
NK細(xì)胞活性測定,取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL,加入到U型96孔培養(yǎng)板中,作為反應(yīng)孔,自然釋放孔依次加100 μL靶細(xì)胞和培養(yǎng)液,最大釋放孔依次加100 μL靶細(xì)胞和1%(體積分?jǐn)?shù))NP40,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,離心(1 500 r/min,5 min)處理,每孔吸取100 μL加入到平底96孔培養(yǎng)板中,加入100 μL乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)基質(zhì)液,室溫反應(yīng)5 min,后加入30 μL 1 mol/L的鹽酸溶液,用酶標(biāo)儀在490 nm處測定光密度值(OD)。按照公式(5)計(jì)算NK細(xì)胞活性:
(5)
1.3.3.7 腸道菌群測定
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剖殺后,無菌條件下取盲腸糞便,精確稱取1 g置于100 mL生理鹽水中,37 ℃恒溫?fù)u床振蕩,采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行梯度稀釋,選擇合適梯度接種于不同細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基:EMB瓊脂、BEA瓊脂、BBL瓊脂、LBS瓊脂、TSC瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)后以菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化反應(yīng)等鑒定計(jì)數(shù)菌落,分別計(jì)算出每克濕便中腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的活菌數(shù)。
采用SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,檢驗(yàn)方法采用t檢驗(yàn),P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即差異顯著,P<0.01為極顯著差異。
通過鑒定分析,分離出的菌株屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬,革蘭氏陽性桿菌,末端呈圓形,兼性厭氧菌,在pH 4.5~9.5生長,最適pH 6.5左右,接觸酶和氧化酶陰性,γ溶血。菌體呈長桿狀或者呈對狀,兩端鈍圓,不產(chǎn)生芽孢(圖1);在MRS瓊脂培養(yǎng)基中呈乳白色、半透明狀圓形小菌落、邊緣不規(guī)則。
圖1 菌株的顯微鏡檢圖(×4 000)
菌體API 50CH系統(tǒng)鑒定如表2所示,該菌種屬于同型發(fā)酵乳酸菌,能夠發(fā)酵果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖。通過菌株細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等綜合分析,該菌株鑒定結(jié)果為嗜酸乳桿菌,命名為嗜酸乳桿菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)(簡稱L2-003)。
表2 菌株L2-003 API 50CH系統(tǒng)鑒定結(jié)果
菌株L2-003耐酸耐膽鹽結(jié)果顯示:在pH 2.0條件下,2 h內(nèi)存活率>20%;在0.3%膽鹽濃度下,2 h內(nèi)存活率>20%,具有較好的耐酸耐膽鹽能力(表3)。
表3 菌株L2-003在pH 2.0及0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中存活率
菌株L2-003在人工胃液中存活率見表4,菌株L2-003在人工胃液中0.5、1、2 h時(shí)的存活率分別為61.18%、54.25%、50.24%,存活率較高,具有較好的耐人工胃液能力,與菌株L2-003具有較好的耐酸特性結(jié)果相符。
表4 菌株L2-003耐受人工胃液存活率
如表5所示,菌株L2-003具有較好的耐酸和耐膽鹽特性,能夠有效通過胃液和膽鹽,并可在人工腸液環(huán)境中較好的存活并增殖。
表5 菌株耐受人工腸液存活率
對益生菌菌株的耐藥性進(jìn)行檢測與分析,對于益生菌制品的安全性十分必要。菌株篩選過程中,應(yīng)選擇對常用抗菌藥物敏感的菌株,以減少耐藥性傳遞的安全隱患。選用常見的30種抗生素進(jìn)行耐藥性測定,參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析,結(jié)果見表6,菌株L2-003僅對復(fù)方新諾明和阿米卡星有抗性,對慶大霉素中度敏感,對其余27種抗生素均敏感,說明菌株L2-003對抗生素耐藥譜較窄,具有較高的安全性。
表6 菌株L2-003對抗生素的敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 小鼠免疫指標(biāo)檢測
實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)控實(shí)驗(yàn)小鼠的生長情況及狀態(tài),結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)期中各實(shí)驗(yàn)組小鼠生長狀況較好,體征及狀態(tài)無不良變化,未出現(xiàn)明顯疾病及死亡情況,表明菌株L2-003對實(shí)驗(yàn)小鼠無明顯毒性作用。
小鼠免疫檢測結(jié)果見表7,造模處理后,模型組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01),說明使用環(huán)磷酰胺進(jìn)行免疫抑制造模成功。與模型組相比,陽性組、中劑量和高劑量菌株L2-003給藥組,小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于模型組。付彥君等[15]研究報(bào)道乳酸菌可通過促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟等免疫器官的發(fā)育,提高機(jī)體免疫功能。本研究結(jié)果顯示,陽性對照組與中高劑量L2-003組可通過促進(jìn)小鼠免疫器官的發(fā)育,改善免疫抑制劑造模后小鼠的免疫功能;ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示,空白對照組與模型組相比,光密度差值具有顯著性差異(P<0.01),說明免疫抑制劑環(huán)磷酰胺顯著降低了小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力;陽性組、中劑量和高劑量L2-003菌株組光密度差值顯著高于模型組(P<0.05),高劑量組淋巴細(xì)胞增殖能力接近陽性對照組,說明一定劑量L2-003菌株可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖;空白對照組與模型組相比,抗體積數(shù)具有顯著性差異(P<0.05),說明免疫抑制劑顯著降低了小鼠的抗體分泌能力;中劑量和高劑量L2-003菌株組抗體水平顯著高于模型組,說明一定劑量L2-003菌株可以有效促進(jìn)小鼠血清凝血素的分泌,增強(qiáng)小鼠機(jī)體體液免疫能力。
表7 不同處理小鼠脾臟和胸腺臟器指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖活性、血清凝血素、碳廓清指數(shù)、NK細(xì)胞活性檢測結(jié)果
小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)是通過小鼠尾靜脈注射墨汁,在不同時(shí)間測定小鼠的血液光密度值,在一定范圍內(nèi),體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系,計(jì)算吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清能力,來反映單核吞噬細(xì)胞對外來異物的吞噬功能,進(jìn)一步體現(xiàn)機(jī)體的免疫能力[16]。小鼠碳廓清吞噬指數(shù)結(jié)果顯示,與模型組相比,空白對照組對墨汁吞噬能力具有顯著性差異(P<0.01),說明免疫抑制劑顯著降低了小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力;與模型組相比,L2-003低劑量和中劑量組吞噬指數(shù)增加,但沒有顯著性差異;與模型組相比,L2-003高劑量組顯著差異(P<0.05),免疫抑制小鼠的細(xì)胞吞噬能力顯著增強(qiáng)。
NK細(xì)胞由骨髓中的淋巴干細(xì)胞分化而來,可直接殺傷病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和異體細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞殺傷后,活細(xì)胞胞漿內(nèi)的LDH可以透過細(xì)胞膜,釋放到胞外,進(jìn)一步反應(yīng)生成紫紅色化合物,可在酶標(biāo)儀490 nm比色測定,計(jì)算獲得NK細(xì)胞活性,獲得機(jī)體非特異性免疫水平。小鼠NK細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示,與空白對照組相比,免疫抑制模型組小鼠NK細(xì)胞活性顯著降低;與模型組相比,陽性對照組、中劑量組小鼠NK細(xì)胞活性顯著提升(P<0.05),高劑量組差異極顯著(P<0.01)。
2.3.2 小鼠腸道菌群檢測
小鼠盲腸內(nèi)菌群計(jì)數(shù)檢測結(jié)果見表8,與空白對照組相比,通過免疫抑制劑處理,小鼠腸道乳酸桿菌數(shù)量極顯著降低(P<0.01),雙歧桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05),腸桿菌和腸球菌無顯著性變化,產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著增高(P<0.05),說明通過造模處理后,小鼠腸道菌群平衡被破壞;通過不同組給藥處理后,與模型組相比,陽性對照組和低劑量L2-003活菌處理組對小鼠腸道乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌無顯著影響。3個(gè)劑量L2-003活菌處理組雙歧桿菌數(shù)量顯著增加,中劑量組乳酸桿菌顯著增加,差異顯著(P<0.05);高劑量組乳酸桿菌數(shù)量顯著增加,差異極顯著(P<0.01);與模型組相比,低劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌、中高劑量組腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌,顯著下降(P<0.05)。一定劑量的L2-003可通過促進(jìn)有益菌、抑制有害菌增殖,起到調(diào)節(jié)和平衡腸道菌群的作用。
表8 小鼠腸道菌群測定結(jié)果 單位:lgCFU/g
綜上,嗜酸乳桿菌L2-003可有效改善免疫抑制小鼠腸道菌群,增強(qiáng)免疫器官指數(shù)及免疫細(xì)胞功能,促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖,提高免疫細(xì)胞活性,提高機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫水平,在中高劑量體現(xiàn)出更高的免疫增強(qiáng)活性。說明菌株L2-003可順利通過胃腸消化道進(jìn)入機(jī)體并發(fā)揮益生作用,與生理生化和耐受特性結(jié)果一致。
研究篩選食品可用益生菌菌株特性及其體內(nèi)功能作用及其機(jī)理,對于菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及進(jìn)入體內(nèi)后的安全性與功能性具有重要的意義。乳酸菌能否通過胃腸道低pH值、高膽鹽濃度的環(huán)境存活,并可通過胃腸道的消化液消化而在腸道內(nèi)黏附定植,對于其在腸道內(nèi)的功能發(fā)揮至關(guān)重要。乳酸桿菌具有良好的抗生素敏感性,對酸和膽鹽環(huán)境具有良好的耐受性,經(jīng)口飼喂后無中毒情況發(fā)生,口服乳酸桿菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),表明供試菌株具有良好的安全性和益生特性,可作為生產(chǎn)用菌株應(yīng)用[17-18]。本研究從健康長壽老人糞便中分離獲得一株嗜酸乳桿菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)。研究結(jié)果證實(shí),該菌株具有較好的耐酸、耐膽鹽特性;藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,L2-003僅對復(fù)方新諾明和阿米卡星有抗性,對慶大霉素中度敏感,對其余27種抗生素均敏感,說明L2-003對抗生素耐藥譜較窄。以上結(jié)果顯示,L2-003具有較好的抗逆性及安全性,可順利通過胃腸道消化液并發(fā)揮益生作用,具有較好的應(yīng)用價(jià)值。
腸道菌群是維持腸道系統(tǒng)功能的重要物質(zhì),腸黏膜表面形成的腸道黏膜屏障和免疫屏障是保障腸道菌群維持動(dòng)態(tài)平衡的重要環(huán)節(jié),免疫系統(tǒng)可以維持宿主與高度多樣性并不斷發(fā)展的菌群之間的共生關(guān)系,誘導(dǎo)對病原體的保護(hù)性應(yīng)答。研究顯示,益生菌可以通過自身增殖過程,產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物,調(diào)節(jié)腸道菌群,促進(jìn)機(jī)體免疫功能,研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以通過促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,激活免疫細(xì)胞活性,提高機(jī)體免疫分子分泌等作用,提高機(jī)體免疫力[19-20]。本研究結(jié)果顯示,篩選出的嗜酸乳桿菌L2-003具有促進(jìn)有益菌生長、抑制有害菌增殖的作用;體內(nèi)免疫功能評價(jià)結(jié)果顯示,L2-003可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖,提高機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力,促進(jìn)機(jī)體抗體產(chǎn)生;顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性和NK細(xì)胞殺傷活性,廣泛參與機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫反應(yīng),顯著提升免疫抑制造模小鼠的機(jī)體免疫力水平,具有較好的促進(jìn)機(jī)體免疫功能。綜上所述,嗜酸乳桿菌L2-003具有良好的抗逆性與安全性,具有調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫提升作用,可作為功能性益生菌菌株應(yīng)用于健康產(chǎn)品開發(fā)中。
大量研究報(bào)道顯示,人體腸道菌群因遺傳、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式、地理環(huán)境、年齡、性別及不同的健康狀況等因素的差異,而具有顯著性差異。長壽人群腸道菌群具有高多樣性的典型特征;維持高多樣性且均衡的腸道菌群對于老齡化過程中的健康可能起積極作用;健康長壽老人作為功能性益生菌菌種資源的特殊來源,已引起廣泛關(guān)注[21]。作為一株具有良好產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的益生菌菌種資源,不僅需要其來源安全,同時(shí)還需要其具有良好的特性、安全性、功能性。尤其是作為可食用的益生菌菌株,其進(jìn)入機(jī)體后與機(jī)體的腸道菌群以及代謝、免疫等重要的生理活動(dòng)間的相互作用及影響,及其相互作用靶點(diǎn)和機(jī)理研究,均需要更深入的研究與探討,以便為行業(yè)提供性能優(yōu)良、食用安全的本土菌種資源,并為其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供嚴(yán)謹(jǐn)充分的參考依據(jù)。