周春紅，彭文靜

1(甘肅省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗研究院，甘肅 蘭州，730000)2(蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心，甘肅 蘭州，730000)

葡萄酒酒精度較低，口感醇厚愉悅，香氣優(yōu)雅和諧，含有多種營養(yǎng)成分，隨著經(jīng)濟的快速增長，受到越來越多消費者的喜歡。

農(nóng)藥可以對真菌、蟲草等有害生物進行防治，部分農(nóng)藥可以有效的控制植物生長，廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。規(guī)范合理的施用農(nóng)藥，可以使農(nóng)產(chǎn)品高產(chǎn)、高質量，然而不合理的施用易導致食品中殘留農(nóng)藥。少量農(nóng)藥在人體內(nèi)殘留不會立即產(chǎn)生危害，但是化學性質比較穩(wěn)定的農(nóng)藥在人體內(nèi)長時間蓄積會對人體造成傷害[1]。同時，農(nóng)藥通過影響葡萄酒中的酚類物質，影響酒的色澤、香氣等[2]。為保證葡萄的質量和產(chǎn)量，葡萄在栽培過程中易使用防病蟲害的農(nóng)藥，這些農(nóng)藥可殘留在葡萄表皮并伴隨著發(fā)酵過程轉移到葡萄酒中[3-6]。因此，葡萄酒中的農(nóng)藥殘留問題已引起生產(chǎn)者和消費者的廣泛關注[7]。

QuEChERS法[8]可同時分析農(nóng)殘、真菌毒素等多種化合物，主要包括萃取、鹽析、凈化3部分。與傳統(tǒng)前處理方法相比，具有快速、試劑耗材損耗少、可同時提取多種組分等優(yōu)點，廣泛用于復雜基質樣品中的多種組分的同時提取、凈化[9-10]。葡萄酒中農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留檢測需要較高的靈敏度，目前蔬菜、水果等不同基質中農(nóng)藥殘留和真菌毒素常用的方法有LC-MS/MS[11-14]、GC-MS[15]、GC[16]等。LC-MS/MS法可測定不易揮發(fā)或高溫易分解的化合物，適用于分析復雜基質樣品，具有高靈敏度、耗時短、同時檢測多種組分等優(yōu)點，可應用于葡萄酒中農(nóng)殘和真菌毒素污染分析。目前，針對葡萄酒中農(nóng)藥殘留和真菌毒素的檢測方法及限量還沒有相關標準進行規(guī)范，關于利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法檢測葡萄酒中農(nóng)藥和真菌毒素殘留也鮮見報道。因此，對葡萄酒中多種有毒有害物質殘留量進行有效監(jiān)控，建立一種簡單、高效的高通量篩查方法是十分迫切的。

本文選擇了52種較常見的農(nóng)藥和8種易污染的真菌毒素作為研究對象，以葡萄酒為研究基質，運用QuEChERS結合超高效液相色譜-質譜/質譜聯(lián)用法(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-MS/MS)建立快速測定葡萄酒中多種農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留的檢測方法，提高檢測效率，以期為建立系統(tǒng)的檢測分析葡萄酒中多種農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留相關標準提供數(shù)據(jù)支持，為葡萄酒安全和提高葡萄酒產(chǎn)品品質提供科學依據(jù)，為市場監(jiān)管葡萄酒品質的風險評估提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品購于超市。

標準物質：60種待測物質標準品信息詳見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)，天津阿爾塔公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)，德國Meker公司；乙酸銨、甲酸(色譜純)，天津科密歐化學試劑有限公司；QuEChERs鹽包、凈化粉，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

QTRAP 4500 UPLC-MS/MS，美國SCIEX公司；VXR渦旋振蕩器，德國IKA公司；KH30R-Ⅱ高速冷凍離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；KQ-600DE超聲波清洗器，東莞市科橋超聲波設備有限公司；十萬分之一天平(精密度為0.01 mg)，Sartorius公司；Milli-Q Gradient純水儀，美國Millipore公司；TLE204E分析天平(精密度為0.000 1 g)，梅特勒公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量 5 μL；流動相：A為乙腈水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；流動相梯度洗脫程序：0～3.0 min，5%～30% B；3.0～4.0 min，30%～40% B；4.0～6.0 min，40%～95% B；6.0～8.0 min，95% B；8.0～8.2 min，95%～5% B；8.2～12 min，5% B。

1.3.2 質譜條件

電噴霧電離源：ESI；檢測方式：MRM模式；氣簾氣0.24 MPa；碰撞氣：medium；離子化電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；噴霧氣0.38 MPa；輔助加熱器0.41 MPa。60種目標化合物在MRM模式下的質譜條件具體見附表1。

1.3.3 標準溶液的配制

農(nóng)殘混合標準儲備液的配制(10 μg/mL)：分別準確稱取各對照品10 mg于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成母液(附表1)。分別移取母液各100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成質量濃度為10 μg/mL的混合標準儲備液，于-18 ℃下密封保存。

真菌毒素混合標準儲備液的配制(1 μg/mL)：分別準確移取4種黃曲霉毒素混合標準溶液(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2)500 μL、玉米赤霉烯酮標準溶液100 μL、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液50 μL、赭曲霉毒素A標準溶液50 μL于5 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 μg/mL的混合標準工作溶液，于-18 ℃下密封保存。

溶劑標準工作液：準確移取適量的農(nóng)殘混合標準儲備液和真菌毒素混合標準儲備液，用20%(體積分數(shù))乙腈水溶液配制成系列標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

空白葡萄酒基質溶液：稱取陰性葡萄酒樣品經(jīng)1.3.4提取、凈化處理后于4 ℃下條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

基質標準工作液：準確移取適量的農(nóng)殘混合標準儲備液和真菌毒素混合標準儲備液，用空白葡萄酒基質溶液配制成系列標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 樣品前處理

準確稱取10 g(精確到0.1 mg)葡萄酒樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，加入QuEChERs鹽包(4 g MgSO4，1 g NaC1，0.5 g檸檬酸氫二鈉,1 g檸檬酸鈉)，加入1顆陶瓷均質子，劇烈振蕩1 min 后4 000 r/min離心5 min；移取7 mL上清液至凈化管中(150 mg MgSO4, 50 mg C18, 50 mg乙二胺-N-丙基硅烷)，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液過0.22 μm濾膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.5 方法學考察

1.3.5.1 基質效應、線性關系、相關系數(shù)及檢出限

1.3.3中配制好的溶劑標準工作液、基質標準工作液按照1.3.1 和1.3.2色譜及質譜條件直接進樣測定，以對照品濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)做標準曲線，得到48種待測物質的線性方程、相關系數(shù)，通過基質標準曲線與溶劑標準曲線的斜率之比來考察48種待測物質的基質效應。采用陰性葡萄酒樣品加標方式考察48種待測物質的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。

1.3.5.2 精密度和加標回收試驗

在陰性葡萄酒樣品中添加25、50、80 μg/kg 3個水平的混合標準溶液，每個加標水平做6次平行實驗，采用優(yōu)化后的實驗條件進行測定，計算低、中、高3個添加水平的加標回收率和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

2 結果與分析

2.1 MRM模式下農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留檢測方法的建立

2.1.1 質譜條件的優(yōu)化

運用質譜進行分析時，化合物的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量需要優(yōu)化。本研究在國家標準及文獻報道[7-14]的基礎上，采用Scan模式掃描確定母離子、子離子，在MRM模式下找出48種目標化合物的特征子離子碎片，并優(yōu)化DP和碰撞能量使各離子碎片的響應值達到最優(yōu)，優(yōu)化后的質譜條件如附表1所示。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

不同類型藥物的極性差異較大，流動相的組成不僅影響目標化合物的峰形，還影響目標化合物的離子化效應。本研究考察了乙腈+水、0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)4種流動相體系的分離效果。結果顯示0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)作為流動相時各化合物的峰型較好，60種待測物質的MRM總離子流圖如附圖1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)所示，因此選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)為流動相進行后續(xù)試驗。

2.2 方法學考察

2.2.1 基質效應

基質效應(matrix effects，ME)是指葡萄酒中脂肪酸、糖、醇等在質譜離子化的過程中增強或減弱待測物質的響應[15]。若ME<1時，表示存在基質抑制效應；ME=1時，表示不存在基質抑制效應；ME>1時，表示存在基質增強效應。結果表明，10%藥物的ME<0.8%，呈現(xiàn)為基質抑制作用；47.5%藥物的ME為0.8%～1.2%，基質效應相對不明顯；42.5%藥物的ME>1.2%，呈現(xiàn)為基質增強作用。因此，本實驗采用空白葡萄酒基質配制標準曲線，降低待測物質的基質效應影響。

2.2.2 線性關系、相關系數(shù)及檢出限

由附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ & dbname=CAPJLAST & filename=SPFX2022061400D)可知，41種農(nóng)藥和7種真菌毒素在相應的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)(r)≥0.999 01。采用陰性葡萄酒樣品加標方式考察48種待測藥物的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，檢出限為0.01～5 μg/kg，定量限為0.05～17 μg/kg。

2.2.3 回收率和精密度

在陰性葡萄酒樣品中添加低、中、高3個水平的混合標準溶液，每個加標水平測定6次，加標回收率及精密度結果如附表3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)所示。其中48種待測物質的加標回收率為79.6%～122.5%，RSD為0.21%～6.39%。

2.2.4 實際樣品的測定

采用建立的方法測定了15批次市售葡萄酒樣品中41種農(nóng)藥和7種真菌毒素殘留，其中15批次樣品均未檢出真菌毒素殘留，2批次樣品中未檢出農(nóng)藥殘留，其他13批次樣品單批樣本中檢出藥物種類2～6種，共檢出藥物9種(表1)，分別為烯酰嗎啉、多菌靈、噻蟲嗪、戊唑醇、嘧菌酯、霜霉威、甲霜靈、腈菌唑、甲萘威。所有樣品中檢出烯酰嗎啉的含量為1.0～57.1 μg/kg，多菌靈的含量為10.6～62.4 μg/kg、噻蟲嗪的含量為0.5～2.1 μg/kg、戊唑醇的含量為4.6～39.4 μg/kg、嘧菌酯的含量為2.2～3.7 μg/kg、霜霉威的含量為0.3～37.8 μg/kg、甲霜靈的含量為0.9～32.7 μg/kg、腈菌唑的含量為1.4～6.8 μg/kg，樣品中均未檢出克百威。其中多菌靈、甲霜靈及克百威結果符合NY/T 274—2014的標準要求。

表1 葡萄酒樣品中藥物的含量 單位：μg/kg

在檢測的15批次樣品中，烯酰嗎啉、甲霜靈、多菌靈、霜霉威檢出率較高。相關研究表明，葡萄種植過程中霜霉病在葡萄生長后期易發(fā)病且周期較長，烯酰嗎啉、霜霉威可較好的抑制霜霉病菌的孢子囊萌發(fā)，可以有效防治葡萄的霜霉病[16-17]；甲霜靈、多菌靈、嘧菌酯等易檢出農(nóng)藥可有效防治軸枯病、灰霉病、炭疽病等常見的病蟲害[18-20]。由此可知，葡萄的種植過程中農(nóng)藥使用情況普遍存在且檢出率較高，建議在葡萄的種植過程中規(guī)范栽培管理，重視農(nóng)藥的劑量使用。

3 結論

本文利用液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜MRM模式，建立了葡萄酒中41種農(nóng)藥殘留和7種真菌毒素殘留的高通量檢測方法。48種待測物質中線性良好，檢出限為0.01～5 μg/kg，定量限為0.05～17 μg/kg，加標回收率為79.6%～122.5%，RSD為0.21%～6.39%。該方法操作簡便、快速簡單，可同時分析葡萄酒中48種化合物，滿足葡萄酒中農(nóng)藥和真菌毒素殘留的快速篩查和定量檢測，為今后制定相關檢測標準提供方法依據(jù)。