夏益民，王近近，袁海波

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江杭州 310008）

（2.浙江省遂昌縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局茶葉技術(shù)推廣站，浙江麗水 323300）

茶是世界上除水之外最受歡迎的飲料，其中紅茶由于其紅湯紅葉的獨特風(fēng)味和兒茶素、茶黃素、黃酮苷等內(nèi)含物的抗糖、抗氧化、抗炎的營養(yǎng)價值，成為世界上消費量最大的茶類[1-3]。紅茶為全發(fā)酵茶，經(jīng)鮮葉采摘、萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工序加工而成。其中萎凋是影響茶葉色、香、味等品質(zhì)形成的基礎(chǔ)工序和關(guān)鍵步驟。萎凋是將采下的鮮葉進(jìn)行攤放散失水分的工藝過程，伴隨著葉片逐漸萎縮、變軟的同時增加細(xì)胞膜的通透性，葉內(nèi)各種氧化酶類和水解酶類的活性提高，發(fā)生一系列化學(xué)變化，為揉捻、發(fā)酵階段紅茶品質(zhì)的形成奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)[4,5]。

目前傳統(tǒng)的萎凋方法主要有室內(nèi)自然萎凋、萎凋槽萎凋、日光萎凋等[6]，存在費時費力等缺點。紅茶整個制茶過程時間較長，制茶過程中容易出現(xiàn)茶葉湯色、滋味品質(zhì)不佳等情況[7]。隨著我國茶產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，紅茶萎凋技術(shù)不斷創(chuàng)新用于改善、提升茶葉品質(zhì)，如人工光照萎凋[8]、富氧萎凋[9]、冷凍萎凋[10]等。其中冷凍萎凋可通過提高細(xì)胞膜滲透性促進(jìn)茶葉發(fā)酵底物和酶的混合，提高茶葉的外形、湯色、滋味品 質(zhì)[10,11]，同時冷凍會抑制多酚氧化酶和β-葡萄糖苷酶的活性而降低香氣品質(zhì)[12]，可見冷凍處理對茶葉內(nèi)質(zhì)的影響有利有弊。搖青是烏龍茶加工的重要工序，其通過摩擦損傷葉緣細(xì)胞，激發(fā)酶的活性，促進(jìn)多酚類的酶促氧化[13]，近年來有研究將搖青工藝與紅茶傳統(tǒng)加工相結(jié)合用于優(yōu)化茶葉品質(zhì)。張靜等[14]研究結(jié)果顯示搖青工藝的紅茶較傳統(tǒng)紅茶的茶黃素、茶紅素等均有提高，石渝鳳等[15]研究認(rèn)為搖青可豐富紅茶香氣組分，段禮平等[16]研究表明通過在紅茶傳統(tǒng)工藝中加入搖青工藝可獲得花果香濃郁、橙黃明亮、濃醇甘甜等品質(zhì)優(yōu)異的紅茶。另外，虞昕磊等[17]研究認(rèn)為，在萎凋中采用日光萎凋和搖青技術(shù)結(jié)合可以明顯改進(jìn)夏秋紅茶口感苦澀、香氣差的缺點，但不同搖青次數(shù)對茶葉中的呈味成分和鮮葉的糖苷類香氣前體物質(zhì)的水解酶活性影響不同。自浩研究結(jié)果顯示[18]搖青三次有利于紅茶品質(zhì)的形成，雷攀登等[19]研究表明輕做青即一次搖青茶葉品質(zhì)更佳。由以上可知，冷凍和搖青處理可在一定程度影響茶葉品質(zhì)，但現(xiàn)有研究多集中于單一技術(shù)的創(chuàng)新，冷凍和搖青組合處理對紅茶品質(zhì)形成的影響鮮有研究，同時受看茶做茶、因地制宜的影響，關(guān)于紅茶搖青參數(shù)的研究尚未形成統(tǒng)一。

基于此，本研究采用萎凋前冷凍，萎凋后搖青的方法探索萎凋新工藝對茶葉品質(zhì)的影響，并通過設(shè)置不同的搖青次數(shù)分析冷凍和不同次數(shù)搖青組合工藝下的茶葉品質(zhì)差異。即以傳統(tǒng)加工及冷凍、冷凍和一次搖青組合、冷凍和兩次搖青組合、冷凍和三次搖青組合等五種不同處理的紅茶為研究對象，通過測定茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素組分、黃酮苷組分、香氣組分等內(nèi)含成分的含量，并結(jié)合感官審評，探究冷凍、搖青工藝對紅茶品質(zhì)形成的影響，以期為紅茶品質(zhì)提升提供新技術(shù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶鮮葉2021年4月下旬采摘于浙江遂昌，品種為麗早香，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二、三葉。

碳酸鈉、茚三酮、氯化錫、福林酚等，均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈、乙酸，均為色譜純，購于德國默克公司；標(biāo)準(zhǔn)品，購于美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YJY-20M型號連續(xù)攤青萎凋機(jī)，余姚市姚江源茶葉茶機(jī)有限公司；6CR-55型茶葉揉捻機(jī)，浙江上洋機(jī)械有限公司；6CJK-40茶葉解塊機(jī)，浙江綠峰機(jī)械有限公司；6CHZ-7B型茶葉烘焙提香機(jī)，福建佳友機(jī)械有限公司；YJY-20F多層紅茶發(fā)酵機(jī)，余姚市姚江源茶葉茶機(jī)有限公司；XJQ13MBG箱式冷凝機(jī)組，安徽美樂柯制冷空調(diào)設(shè)備有限公司；YS-6CRQT-90型茶葉搖青機(jī)，福建安溪躍晟茶葉機(jī)械有限公司。

MA-150C紅外水分測定儀，德國賽多利斯公司；UV-2800分光光度計，上海誠麗生物科技有限公司；XMTD-204電加熱恒溫水浴鍋，上海谷寧儀器有限公司；JGZX-9246MBE風(fēng)熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Waters1525型高效液相儀，美國Waters公司；7890B-7000C氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 加工工藝

將采摘的鮮葉按照以下工序進(jìn)行加工：

萎凋（采用萎凋槽萎凋方式，攤?cè)~厚度10~15 cm，設(shè)定熱風(fēng)溫度28~30 ℃，通風(fēng)1 h，停止10 min，至含水率為55%~60%）→揉捻（空揉10 min→輕揉15 min →重揉15 min→輕揉10 min→空揉10 min）→解塊→發(fā)酵（采用發(fā)酵機(jī)作業(yè)，設(shè)定溫度28 ℃，相對濕度95%，發(fā)酵3 h）→毛火（110 ℃，葉厚2 cm，至含水率20%~30%）→攤涼（30 min）→足火（設(shè)定溫度65 ℃、厚度3~5 cm，耗時4 h）

所制茶葉為對照樣（CK）。在傳統(tǒng)工藝及前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行以下新工藝處理：

處理1：采摘的鮮葉于-5 ℃冷庫冷凍處理10 h，然后按照CK的工序進(jìn)行加工；

處理2：在處理1的萎凋工序后增加一次搖青處理（32 r/min，3 min；靜置30 min），其余工序同處理1；

處理3：在處理1的萎凋工序后增加兩次搖青處理（32 r/min，3 min；靜置30 min），其余工序同處理1；

處理4：在處理1的萎凋工序后增加三次搖青處理（32 r/min，3 min；靜置30 min），其余工序同處理1。

1.3.2 生化成分的測定

氨基酸的測定參照茚三酮比色法（GB/T 8314-2013）；咖啡堿的測定參照茶咖啡堿的檢測方法（GB/T 8312-2013）；茶多酚和兒茶素的測定參照茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法（GB/T 8313- 2018）；茶黃素組分的測定參照高效液相色譜法[20]；黃酮苷組分的測定參照高效液相色譜法[21]；香氣組分的測定參照氣相色譜-質(zhì)譜法[22]。茶色素的測定參照系統(tǒng)分析法[23]。品質(zhì)相關(guān)綜合評價計算指標(biāo)計算如下：

式中：

10TFRB——茶色素綜合指標(biāo)[24]；

TFs——總茶黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

TRs——茶紅素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

TBs——茶褐素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

CI——湯色指數(shù)[24]；

TDE——茶黃素綜合指標(biāo)[25]；

TF3G——茶黃素-3-沒食子酸酯含量，%；

TF3′G——茶黃素-3′-沒食子酸酯含量，%；

TFDG——茶黃素-3,3′-雙沒食子酸酯含量，%。

1.3.3 感官審評

由高級評茶員組成的5人審評小組參照GB/T 23776-2018中茶葉的審評方法進(jìn)行評審。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)的檢測均重復(fù)3次，每次試驗結(jié)果以3次重復(fù)的平均值表示，采用Excel處理數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)圖片采用Origin 8.0軟件繪制。數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SPSS 22.0軟件分析（Tukey法，P＜0.05）。采用SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行PLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍和搖青處理對紅茶感官品質(zhì)的影響

冷凍和搖青處理對紅茶感官品質(zhì)的影響如表1所示。外形品質(zhì)上，處理1-處理4的分值均大于CK，且以處理2的分值較高，其次為處理3。湯色品質(zhì)上，各處理均為橙黃，處理1-處理4的分值均高于CK，且以處理4的分值最高，其次為處理3，分別較對照增加了3.00分、2.00分。香氣品質(zhì)上，處理1較CK有所下降，由帶甜香轉(zhuǎn)變?yōu)榧冋@與賴兆祥等[11]研究結(jié)果中冷凍會降低茶葉香氣品質(zhì)的結(jié)果類似；處理2-處理4的分值高于CK，隨著搖青次數(shù)的增加，香氣由甜香轉(zhuǎn)變?yōu)樘鹣銤庥?，甚至帶花香，其中處?的香氣品質(zhì)最佳，分值較對照增加了2.00分。滋味品質(zhì)上，處理1較CK略有下降，但滋味屬性同為尚甜醇，略帶青；處理2-處理4的分值均高于CK，隨著搖青次數(shù)的增加，滋味品質(zhì)先增后降，其中處理3較對照增加了2.50分。葉底品質(zhì)上，處理1-處理4的分值均大于CK。綜合感官品質(zhì)上，處理1的分值略小于CK，處理2-處理4的分值均大于CK、處理1，且以處理3和處理4較高，較CK、處理1增加了兩分左右。綜上可知，冷凍處理可提高茶葉的外形、湯色、葉底等品質(zhì)，但不利于香氣、滋味品質(zhì)的形成，與已有研究結(jié)果中冷凍可提高紅茶滋味品質(zhì)的結(jié)果不同[10,11]，可能與不同研究所用冷凍溫度及茶葉品種的差異有關(guān)；在冷凍的基礎(chǔ)上增加搖青處理之后感官分屬性的品質(zhì)均會上升，整體上以冷凍和兩次搖青處理的組合工藝所制茶葉的品質(zhì)略優(yōu)。

表1 不同冷凍和搖青處理紅茶的感官品質(zhì)Table 1 Sensory quality of black tea different freezing and shaking treatments

2.2 冷凍和搖青對紅茶非揮發(fā)性成分的影響 2.2.1 冷凍和搖青對氨基酸、酚氨比、可溶性糖、咖啡堿等值的影響

冷凍和搖青處理對氨基酸、酚氨比、咖啡堿、可溶性糖的影響如圖1所示。

氨基酸是影響茶湯鮮爽度的主要品質(zhì)成分。由 圖1可知，CK和處理4均與處理2差異顯著（P＜0.05），其余處理間差異較?。≒＞0.05），可見鮮葉在萎凋前經(jīng)過冷凍處理其氨基酸含量略有降低，但變化不顯著；經(jīng)過冷凍處理的鮮葉再次進(jìn)行搖青處理后，氨基酸含量會隨著搖青次數(shù)的增加而增加，且三次搖青的氨基酸含量較一次搖青顯著高出5.66%（P＜0.05），其中冷凍后加上一次搖青氨基酸含量較對照有所下降，這可能是由于受冷凍影響水解酶活性降低以及氨基酸用于參與了香氣品質(zhì)的形成，而后增加搖青次數(shù)促進(jìn)了蛋白質(zhì)水解代謝和氨基酸的生物合成，使得氨基酸含量又有所增加，Xue等[26]研究結(jié)果也表明搖青可提高紅茶氨基酸的含量。由以上可知，單獨的冷凍處理對氨基酸的影響較小，冷凍和一次搖青的組合處理會降低氨基酸含量，但通過適度的增加搖青次數(shù)可促進(jìn)氨基酸的積累。

酚氨比為多酚類物質(zhì)含量與氨基酸含量的比值，其與茶湯滋味的協(xié)調(diào)度密切相關(guān)。由圖1可知，處理1-處理4的酚氨比顯著高于CK（P＜0.05），而處理1-處理4間差異不顯著（P＞0.05），即經(jīng)過冷凍和搖青處理可增大酚氨比，增加茶湯滋味的強(qiáng)度，但搖青次數(shù)對其影響較小，這與李秀峰等[27]研究中搖青時間對陜西烏龍茶的酚氨比影響不顯著的結(jié)果類似。

可溶性糖是茶湯中的主要甜味物質(zhì)，由圖1可知，處理1、處理3、處理4的可溶性糖含量顯著低于CK、處理2（P＜0.05），即經(jīng)過冷凍處理的可溶糖含量會降低，在冷凍后增加搖青處理可再次增加其含量，但搖青次數(shù)過多，含量反而降低，其中三次搖青相比一次搖青降低了11.36%。侯炳豪等[28]研究也表明鮮葉在萎凋前冷凍可溶性糖含量下降，這可能是由于經(jīng)過冷凍處理的茶葉中的水解酶在低溫的作用下活性下降，導(dǎo)致大分子物質(zhì)水解成小分子物質(zhì)數(shù)量的減少；結(jié)合已有的研究可知[29,30]，搖青過程糖類物質(zhì)的變化主要來自于分解和消耗，經(jīng)過一次搖青處理后纖維素酶的活性相對提高，以淀粉和多糖的分解作用為主，從而使得可溶性糖含量相對增加，增加搖青次數(shù)后，機(jī)械損傷作用的增加，使得呼吸作用增強(qiáng)，可溶性糖作為呼吸作用的重要底物參與香氣的形成，糖類物質(zhì)的消耗大于分解，從而呈現(xiàn)出可溶性糖含量的下降。

咖啡堿是茶葉中的苦味物質(zhì)。由圖1可知，處理3、處理4咖啡堿含量顯著高于CK，其余處理間差異較小。即冷凍處理和搖青次數(shù)對茶葉咖啡堿含量影響較小，這與張雁飛等[31]、高進(jìn)忠等[32]研究結(jié)果一致；但冷凍后進(jìn)行兩次或三次的搖青較對照可增加咖啡堿的含量，其中三次搖青相比對照增加了10.23%，這與王爾茂等[33]研究結(jié)果顯示機(jī)械重做青使咖啡堿含量增加的結(jié)果類似，這可能與多次搖青，使咖啡堿從與多酚類物質(zhì)、氨基酸等締合的復(fù)合物中釋放，以及搖青促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)核酸分解從而為咖啡堿合成提供先質(zhì)等有關(guān)?？梢姡煌幚韺Σ枞~內(nèi)含成分的影響有差異。茶湯的滋味是由各呈味物質(zhì)相互協(xié)調(diào)綜合體現(xiàn)的結(jié)果，冷凍和搖青對茶葉品質(zhì)的影響需結(jié)合更多的品質(zhì)成分系統(tǒng)分析。

圖1 不同冷凍和搖青處理紅茶氨基酸、酚氨比、可溶性糖、咖啡堿等值的變化Fig.1 Changes of values of amino acids, phenol-ammoniacal ratio, soluble sugar and caffeine of black tea with different freezing and shaking treatments

2.2.2 冷凍和搖青對沒食子酸、茶多酚、兒茶素組分等值的影響

沒食子酸（GA）在茶葉中為酸澀味覺屬性的呈味成分。茶多酚是影響茶湯滋味濃醇度和收斂性的重要物質(zhì)，兒茶素是多酚類物質(zhì)的主體成分，由簡單兒茶素C、EC、GC、EGC及酯型兒茶素CG、ECG、GCG、EGCG等組成。本研究檢測到的兒茶素主要有：GC、C、EGCG、EC、GCG、ECG、CG。由表2和圖2可知，對照的GA含量顯著低于其他處理（P＜0.05），即冷凍和搖青處理可促進(jìn)GA的含量積累，其中冷凍加與三次搖青的組合工藝處理較對照增加了21.95%；不同處理間，GCG、ECG差異較?。慌c對照相比，冷凍和搖青處理可增加GC、C、EGCG、CG、TETC、TSC的含量，降低EC的含量；隨搖青次數(shù)的增加，GC含量增加，C、EC、TSC等含量先降后增，EGCG、CG、TETC等含量下降；冷凍處理可顯著增加茶多酚及總兒茶素含量，增加幅度分別為20.80%、10.71%；增加搖青處理后，茶多酚及兒茶素含量下降，但仍高于對照處理，且搖青次數(shù)間差異較小（P＞0.05）；冷凍處理對TETC/TSC影響較小，在冷凍的基礎(chǔ)上進(jìn)行三次搖青之后，TETC/TSC顯著降低（P＜0.05）。

圖2 不同冷凍和搖青處理紅茶茶多酚、總兒茶素、酯型與簡單兒茶素的比等值的變化Fig.2 Changes of values of tea polyphenols, total catechins, ratio of ester type to simple catechin of black tea with different freezing and shaking treatments

表2 不同冷凍和搖青處理紅茶沒食子酸、兒茶素組分等含量的變化（%）Table 2 Changes of gallic acid, catechins component contents of black tea with different freezing and shaking treatments (%)

由以上可知，冷凍和搖青處理可增加茶葉GA和多酚類物質(zhì)的含量，并改變兒茶素單體的組成比例。這是由于冷凍處理在提高細(xì)胞破損率的同時，也會抑制多酚氧化酶活性[12]，從而相對增加茶葉中茶多酚和兒茶素的保留率，這與Muthumani等[10]研究結(jié)果一致；搖青前期，受冷凍影響茶葉內(nèi)含物質(zhì)GA、GC、C、EGCG、CG、TETC、TSC等含量增加，EC則在多酚氧化酶的的催化下逐漸向茶黃素形成方向轉(zhuǎn)變；隨著搖青次數(shù)的增加，脂質(zhì)過氧化作用的加劇使得細(xì)胞質(zhì)膜的通透性逐漸增加[34]，釋放的酶與兒茶素接觸的機(jī)會增加，內(nèi)含物質(zhì)酶促反應(yīng)逐漸劇烈，C、EC、TSC、EGCG、CG、TETC等含量下降，同時由于酯型兒茶素異構(gòu)化使得C、EC、TSC等含量在搖青三次時有所增加；經(jīng)過冷凍和三次搖青時酯型兒茶素異構(gòu)化作用大于簡單兒茶素的氧化聚合反應(yīng)，TETC/TSC的值相對下降。茶葉內(nèi)茶多酚含量及兒茶素組分比例的合理構(gòu)成是獲得濃爽且不苦澀優(yōu)質(zhì)茶湯的基礎(chǔ)，冷凍和搖青可增加茶葉內(nèi)含物的含量，且搖青處理可進(jìn)一步促進(jìn)多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，從而在增強(qiáng)茶湯濃爽度的同時，提高茶葉的湯色品質(zhì)等。

2.2.3 冷凍和搖青對茶黃素組分、茶紅素、茶褐素等值的影響

茶黃素（TFs）、茶紅素（TRs）和茶褐素（TBs）是多酚類物質(zhì)經(jīng)酶促、濕熱反應(yīng)形成的氧化聚合產(chǎn)物，影響紅茶的色澤、滋味品質(zhì)，其中茶黃素是紅茶滋味鮮爽度和強(qiáng)度的重要成分，茶紅素決定茶湯的色澤艷度，且影響滋味強(qiáng)度和收斂性，茶褐素會使湯色變暗、滋味無收斂性。茶黃素由TF、TF3G、TF3′G、TFDG等四種單體組成。由表3可知，與CK相比，處理1-處理4顯著增加了茶黃素組分及總茶黃素含量 （P＜0.05），其中處理1的TFT、TFs相比對照分別已增加29.19%、24.80%；處理1-處理4間TRs含量差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于CK（P＜0.05），平均值較CK高出了27.96%；處理1的TBs含量相比CK略有下降，處理2-處理4的TBs含量均顯著低于CK，平均值較CK降低了6.92%。可見，冷凍和搖青處理能促進(jìn)與茶葉品質(zhì)正相關(guān)的TFs、TRs的生成，并降低引起茶湯發(fā)暗的TBs含量，這與袁弟順[35]、張靜[14]等研究表明冷凍處理可增加紅茶的茶黃素、茶紅素含量的結(jié)果一致。結(jié)合2.2.2的結(jié)果可知，冷凍和搖青通過增加細(xì)胞的破碎率，促使多酚類化合物與多酚氧化酶發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)含量減少，茶黃素、茶紅素等氧化產(chǎn)物含量增加，且可抑制茶黃素、茶紅素進(jìn)一步的氧化聚合，從而提高茶葉的滋味和湯色品質(zhì)。

表3 不同冷凍和搖青處理紅茶茶黃素組分、茶紅素、茶褐素等含量的變化（%）Table 3 Changes of theaflavins components, thearubigins, and theabrownins contents of black tea with different freezing and shaking treatments (%)

TDE為評價茶黃素4個組分綜合滋味貢獻(xiàn)能力的指標(biāo)，10TFRB為茶色素綜合指標(biāo)，CI為湯色指數(shù)，均可有效代表茶色素在葉內(nèi)的貢獻(xiàn)表征。冷凍和搖青對紅茶品質(zhì)綜合評價指標(biāo)的影響如圖3所示。處理1-處理4的TED、10TFRB、CI等值均顯著高于CK （P＜0.05）；處理1和處理2間的TDE、10TFRB等值均差異不顯著（P＞0.05），處理2-處理4間的10TFRB差異不顯著（P＞0.05），其余處理間的綜合評價指標(biāo)均差異顯著（P＜0.05）；搖青次數(shù)越多，TDE、CI值越高；冷凍和兩次搖青的組合工藝處理TED、10TFRB、CI分別較對照增加了45.16%、47.38%、39.40%，較冷凍處理分別增加了12.53%、14.03%、21.64%。

圖3 不同冷凍和搖青處理紅茶品質(zhì)綜合評價指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of quality comprehensive evaluation indexes of black tea with different freezing and shaking treatments

綜上可知，冷凍和搖青處理均可提高滋味和湯色物質(zhì)在茶葉中的含量，對茶葉品質(zhì)改善具有積極作用，以冷凍和兩次、三次搖青的組合工藝處理相對較佳。

2.2.4 冷凍和搖青對黃酮苷組分的影響

茶葉中的黃酮苷類化合物是茶湯中的主要澀味貢獻(xiàn)物質(zhì)[36]。由表4可知，除Que-Glc-Gen組分外，處理1-處理4的其余7個黃酮苷組分和總量均顯著高于CK（P＜0.05）；處理1與處理2、處理3之間的Que-Glc-Gen含量差異顯著（P＜0.05），其余處理間差異較??；處理2-處理4間的Myr-Gal、Rutin、Kae-Rut等含量差異較小，而Vit-Glc、Vit-Rha、Que-Glc、Kae-Glc等組分含量由小到大的順序均為：處理3、處理4、處理2，且處理3和處理4間差異不顯著 （P＞0.05）；黃酮苷組分中含量較高的Que-Glc在處理3中的含量較對照增加了15.44%，但較處理1降低了3.24%；處理1-處理4中，處理3的FLVs含量顯著最低（P＜0.05），較對照增加了12.50%，但較處理1降低了5.96%?？梢?，冷凍和搖青處理使得結(jié)合態(tài)的黃酮苷水解，造成游離態(tài)的黃酮苷組分含量升高，這與葉飛等[37]研究結(jié)果顯示搖青可增加茶葉的黃酮類物質(zhì)含量的結(jié)果一致；同時隨著搖青次數(shù)的增加，黃酮苷組分在酶和氧化性物質(zhì)作用下的降解使得黃酮苷含量呈動態(tài)變化，其中以冷凍加兩次搖青處理的黃酮苷含量相對較低，其相比對照增加了茶湯內(nèi)含物含量，相比其他處理減輕了茶葉的澀味。結(jié)合2.2.1~2.2.3可知，與對照相比，冷凍處理、冷凍和搖青組合工藝處理均可增加茶多酚、酚氨比、兒茶素組分及總量、茶黃素組分及總量、GA、TRs、TDE、10TFRB、CI、黃酮苷組分及總量等值，同時降低TBs含量；與冷凍處理相比，冷凍和不同次數(shù)搖青的組合工藝處理可顯著降低茶多酚含量、增加茶黃素含量（P＜0.05），且以冷凍和兩次搖青組合工藝處理的茶葉同時具有相對高的氨基酸、酚氨比、茶黃素、茶色素綜合指標(biāo)10TFRB、茶黃素綜合指標(biāo)TDE、湯色指數(shù)CI，以及相對低的茶多酚、沒食子酸、兒茶素、黃酮苷、TBs，相對有利于茶葉優(yōu)質(zhì)品質(zhì)的形成，該結(jié)果與感官結(jié)果一致。

表4 不同冷凍和搖青處理紅茶黃酮苷組分的變化（%）Table 4 Changes of flavonoid glycosides contents of black tea with different freezing and shaking treatments (%)

2.2.5 冷凍和搖青處理的紅茶非揮發(fā)性成分的多元統(tǒng)計分析

為進(jìn)一步分析冷凍和搖青對紅茶品質(zhì)影響的差異性，基于2.2.1~2.2.4中紅茶的38個非揮發(fā)性品質(zhì)指標(biāo)，運用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）分析了冷凍和搖青與紅茶品質(zhì)成分間的關(guān)系。由圖4a的PLS-DA模型得分圖可知，不同處理的茶葉可分為對照、處理1-處理2、處理3、處理4共四類，其中對照位于圖的右側(cè)，處理1-處理4位于圖的左側(cè)。采用交叉驗證法對模型進(jìn)行驗證，共篩選出了3個主成分，模型對自變量擬合指數(shù)R2X（cum）＝0.827，說明3個主成分解釋82.7%的X變量；對因變量的擬合指數(shù)R2Y（cum）＝0.941，說明3個主成分解釋94.1% Y變量；模型預(yù)測指數(shù)Q2（cum）＝0.855，說明模型對不同類別茶葉品質(zhì)的預(yù)測能力為85.5%，表明該模型較穩(wěn)定。同時對該模型進(jìn)行了200次的交叉驗證，R2=（0.0，0.233），Q2=（0.0，-0.421），說明該模型未過擬合，具有可靠性。通過層次聚類（HCA）Ward’s方法對15組樣本進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，3左右的水平距離上樣本可聚類為對照、處理1-處理2、處理3、處理4共四類，20的水平距離上樣本可聚類為對照、處理1-處理4兩類，結(jié)果與PLS-DA的結(jié)果一致（圖4b）。由以上可知，經(jīng)過冷凍和搖青工藝處理的茶葉品質(zhì)與傳統(tǒng)工藝所制茶葉品質(zhì)具有明顯差異性；且冷凍處理與冷凍和一次搖青組合工藝處理的茶葉的內(nèi)含物質(zhì)的差異性較小，兩種處理工藝可視為同一類；經(jīng)過冷凍萎凋的茶葉可通過增加兩次、三次搖青次數(shù)形成區(qū)別于其他處理的茶葉品質(zhì)。

圖4 不同冷凍和搖青處理紅茶品質(zhì)指標(biāo)的PLS-DA 模型得分圖（a）和HCA圖（b）Fig.4 PLS-DA model score scatter plot (a) and HCA plot (b) for black tea quality indexes with different freezing and shaking treatments

2.3 冷凍和搖青處理對紅茶揮發(fā)性成分的影響

不同處理所制紅茶含有相同的40種香氣成分， 2種酯類、10種醇類、5種酮類、9種醛類、6種雜環(huán)類、8種萜烯類，其中醛類（24.99%~47.39%）、雜環(huán)類（23.33%~39.12%）、醇類（4.18%~28.91%）含量相對較高，含量較高的揮發(fā)性化合物為苯乙醇、2-甲基丁醛、氧化芳樟醇II（呋喃型）、氧化芳樟醇I（呋喃型）、β-芳樟醇、β-紫羅酮、反-3,7-芳樟醇氧化物II等。

由圖5、圖6可知，冷凍和搖青處理對紅茶的揮發(fā)性成分的影響較大。其中占比較高的醛類化合物總量以處理4最高，其次為處理2，分別比對照樣提高了77.49%、43.86%；雜環(huán)類化合物總量以處理2最高，其次為處理3，分別比對照樣提高了67.61%、25.11%；醇類化合物總量以對照最高，處理1~處理4均有所下降，處理3降幅最小，為3.84%。整體上，與對照相比，冷凍處理增加了酯類、雜環(huán)類物質(zhì)的含量，但降低了醇類、醛類、酮類化合物的含量；在冷凍基礎(chǔ)上增加一次或三次搖青處理可增加酮類、雜環(huán)類、醛類、萜烯類物質(zhì)的含量，但降低了酯類、醇類物質(zhì)的含量；冷凍加兩次搖青處理同時具有相對高的酯類、醇類、酮類、醛類、雜環(huán)類等物質(zhì)，其順-己酸-3-己烯酯、β-芳樟醇、香葉醇、脫氫芳樟醇、反-3-己烯醇、2,2,6-三甲基環(huán)己烷酮、2-甲基丁醛、正己醛、反-2-反-4-庚二烯醛、氧化芳樟醇II（呋喃型）、氧化芳樟醇I（呋喃型）、反-β-羅勒烯、茶香螺烷I等呈花香、果香的物質(zhì)含量均高于對照，其中具有花香的順-己酸-3-己烯酯作為烏龍茶的特征成分[38,39]增幅為128.89%，具有花香、玫瑰香的香葉醇增幅為126.32%，具有果香的反-3-己烯醇增幅為66.29%，具有茶香的茶香螺烷I[40]和紅茶關(guān)鍵香氣物質(zhì)反-2-反-4-庚二烯醛[41]分別較對照增加了17.31%、6.87%，同時具有青草氣的水楊酸甲酯、1-戊醇分別較對照降低了27.31%、51.35%，具有苦杏仁味的苯甲醛降低了37.34%，具有哈喇味的3-辛烯-2-酮降低了37.25%，具有辛香的藏紅花醛降低了53.16%，這對于改善和提高茶葉的香氣品質(zhì)具有重要的作用，該結(jié)果與感官結(jié)果一致。

圖5 不同冷凍和搖青處理紅茶香氣成分的變化Fig.5 Changes of volatile compounds of black tea with different freezing and shaking treatments

圖6 不同冷凍和搖青處理紅茶香氣類別的變化Fig.6 Changes of volatile compounds categories of black tea with different freezing and shaking treatments

茶葉的香氣物質(zhì)在萎凋工序開始形成，隨著細(xì)胞的逐漸失水，β-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶等水解酶類活性發(fā)生變化，水解釋放以單糖苷或雙糖苷結(jié)合存在的具有花香、甜香等的單萜、倍半萜、降倍半萜等糖苷元的香氣組分[42,43]。冷凍處理通過低溫使葉片組織細(xì)胞液結(jié)冰，漲破細(xì)胞改變細(xì)胞膜的透性，經(jīng)解凍后均勻地散失水分，縮短萎凋的時間，促進(jìn)多酚類物質(zhì)的氧化，但同時由于環(huán)境溫度低，糖苷水解酶的活性急劇下降，限制了香氣前提物質(zhì)的釋放[12,44]，從而相對降低了醇類、醛類、酮類化合物的含量。增加搖青后更同步、高效地破損細(xì)胞，使細(xì)胞中的糖苷類物質(zhì)外溢與β-葡萄糖苷酶充分接觸，增強(qiáng)酶的活性，參與糖苷類香氣物質(zhì)的水解，加快鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的釋放，從而豐富香氣物質(zhì)含量[13]，而搖青次數(shù)過多時，酯類、醇類物質(zhì)含量的降低可能與在制品含水率的降低制約了酶活性的上升，且多酚氧化酶強(qiáng)活性可抑制β-葡萄糖苷酶活性[45]有關(guān)?？梢?，在冷凍的基礎(chǔ)上增加搖青處理，在促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的同時，可通過提高細(xì)胞膜透性，促進(jìn)香氣物質(zhì)的形成，提高茶葉的綜合品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究以一芽二、三葉的麗早香為原料進(jìn)行紅茶的加工，通過在紅茶傳統(tǒng)萎凋工序前增加冷凍處理，在萎凋工序增加搖青處理，探究了冷凍、冷凍和不同搖青次數(shù)組合工藝對紅茶品質(zhì)形成的影響。結(jié)果表明，鮮葉萎凋前進(jìn)行冷凍處理，可顯著增加所制成品茶的沒食子酸、兒茶素、茶多酚、茶黃素、茶紅素、黃酮苷、酚氨比、茶色素綜合指標(biāo)10TFRB、茶黃素綜合指標(biāo)TDE、湯色指數(shù)CI等值（P＜0.05），同時可顯著降低可溶性糖含量（P＜0.05）；在感官品質(zhì)上表現(xiàn)為提高了茶葉的外形、湯色、葉底等品質(zhì)，但不利于香氣、滋味品質(zhì)的形成。在冷凍的基礎(chǔ)上對萎凋的鮮葉再次進(jìn)行不同次數(shù)的搖青處理后發(fā)現(xiàn)，與對照相比，搖青可顯著增加沒食子酸、酯型兒茶素、茶多酚、茶黃素、黃酮苷、酚氨比值、茶色素綜合指標(biāo)10TFRB、茶黃素綜合指標(biāo)TDE、湯色指數(shù)CI等值（P＜0.05），同時顯著降低茶褐素含量（P＜0.05）；與單獨的冷凍處理相比，冷凍和不同次數(shù)搖青的組合工藝處理均可顯著降低茶多酚含量（P＜0.05），降幅為3.52%~3.78%，并顯著增加茶黃素含量（P＜0.05），增幅為12.50%~ 21.43%。各處理中以冷凍和兩次搖青組合工藝處理的茶葉同時具有相對高的氨基酸、酚氨比、茶黃素、茶色素綜合指標(biāo)10TFRB、茶黃素綜合指標(biāo)TDE、湯色指數(shù)CI、順-己酸-3-己烯酯、香葉醇等，以及相對低的茶多酚、沒食子酸、兒茶素、黃酮苷、茶褐素、3-辛烯-2-酮、水楊酸甲酯，在保證了茶葉湯色紅亮度、滋味醇厚度、香氣甜香度的同時，降低了苦澀味物質(zhì)、暗色物質(zhì)、青草氣物質(zhì)等品質(zhì)負(fù)相關(guān)物質(zhì)的含量，具有較佳的品質(zhì)物質(zhì)基礎(chǔ)，從而形成了具有橙黃明亮、甜香、甜醇等色香味兼具的優(yōu)質(zhì)紅茶，綜合感官評分為91.30分，分別較對照和冷凍處理高出了2.40、2.60分，即冷凍和兩次搖青組合工藝為較佳的處理條件。該研究為紅茶的品質(zhì)提升及紅茶新工藝加工提供了理論指導(dǎo)。