范 港 黃 鑫,2* 張偉偉,2 邵淑麗,2 楊清竹,2

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾大學(xué)寒區(qū)麻及制品教育部工程研究中心，齊齊哈爾161006)

乳腺炎是奶牛生產(chǎn)中最為常見的一種疾病，嚴(yán)重危害奶牛生產(chǎn)性能，制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)和乳制品行業(yè)的健康發(fā)展。處于圍產(chǎn)期和泌乳高峰期的奶牛乳腺組織由于其代謝旺盛，導(dǎo)致大量活性氧(ROS)蓄積，易受到氧化損傷，從而誘發(fā)乳腺炎等代謝性疾病[1]。病原微生物感染也是奶牛乳腺炎的主要致病因素之一，最為常見的致病菌就是大腸桿菌，其主要致病物質(zhì)為細(xì)胞壁中的脂多糖(LPS)。LPS可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎性因子，加速ROS的積累并破壞抗氧化防御機(jī)制，引發(fā)氧化應(yīng)激，造成乳腺損傷。抗生素雖然對(duì)乳腺炎有一定的治療作用，然而持續(xù)大量地使用抗生素不僅會(huì)引發(fā)病菌的耐藥性，還會(huì)導(dǎo)致藥物殘留于奶牛乳腺中，危害人類健康[2-3]。因此，尋找安全高效的抗氧化物質(zhì)，以緩解奶牛氧化應(yīng)激造成的危害，對(duì)于提高奶牛泌乳性能具有重要意義。近年來，從植物中提取的一些天然活性成分因具有高效、安全和無藥物殘留等特點(diǎn)，已被廣泛用于動(dòng)物乳腺炎的相關(guān)研究，天然活性成分的開發(fā)和利用已成為治療奶牛乳腺炎的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小鼠乳腺上皮細(xì)胞HC11購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；CBD(HPLC≥98%)購自成都普瑞法科技公司；LPS(大腸桿菌O55∶B5)、BCA蛋白定量試劑盒、MTT法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、ROS檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；維生素E、脫脂奶粉、二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；蛋白酶體抑制劑購自MCE公司；RPMI-1640干粉、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；T-AOC、GSH-Px檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；微量MDA檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；SOD檢測(cè)試劑盒購自合肥蘭杰柯科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技公司；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)印膜購自GE Amersham公司；Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗購自Proteintech公司；二抗(IRDye?800CW Goat anti-Rabbit IgG)購自Abcam公司。

1.2 主要設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)購自Thermo Fisher Scientific公司；Z32HK高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司；Spark 10M多功能酶標(biāo)儀購自TECAN公司；倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司；Mastercycler Realplex 4熒光定量PCR儀購自Eppendorf公司；Odyssey IR雙紅外熒光成像儀購自LI-COR公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MTT法檢測(cè)LPS、CBD對(duì)HC11細(xì)胞活力的影響

試驗(yàn)分為對(duì)照組(接種細(xì)胞但不加藥處理)、LPS(1 μg/mL)組、不同濃度(2、4、6、8、10、20 μmol/L)CBD組以及不同濃度(2、4、6 μmol/L)CBD+LPS組(先添加CBD預(yù)處理1 h后再加入LPS)，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。將處于對(duì)數(shù)期的HC11細(xì)胞接種于96孔板中(5×103個(gè)/孔)，培養(yǎng)過夜。藥物處理24 h后，各孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入100 μL DMSO，10 min后檢測(cè)各孔在490 nm的吸光度(OD)值并進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量的影響

試驗(yàn)分為對(duì)照組、LPS組、2 μmol/L CBD+LPS組、4 μmol/L CBD+LPS組、6 μmol/L CBD+LPS組和維生素E+LPS組(10 mmol/L維生素E預(yù)處理1 h后，與LPS共處理24 h，作為陽性對(duì)照)。藥物處理24 h后棄培養(yǎng)基，使用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2～3遍，加入稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min后洗滌細(xì)胞3次，使用倒置熒光顯微鏡對(duì)各組細(xì)胞樣品進(jìn)行拍照。MDA含量檢測(cè)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性及T-AOC的影響

試驗(yàn)分為對(duì)照組、LPS組及2μmol/LCBD+LPS組、4 μmol/L CBD+LPS組、6 μmol/L CBD+LPS組。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，先加入不同濃度CBD預(yù)處理1 h，然后加入LPS處理；藥物處理24 h后，棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2～3次，胰蛋白酶消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，之后嚴(yán)格按照GSH-Px、SOD及T-AOC檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

試驗(yàn)分組及藥物處理方法同1.3.3。藥物處理24 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin作為內(nèi)參基因，檢測(cè)Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1的mRNA表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表1。采用10 μL反應(yīng)體系：AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 5.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA(稀釋5倍)2.0 μL，雙蒸水(ddH2O)2.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行處理。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3.5 Western blot檢測(cè)CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

試驗(yàn)分組及藥物處理方法同1.3.3。藥物處理24 h后，每孔加預(yù)冷PBS清洗3次；每孔加入適量RIPA裂解液(含蛋白酶體抑制劑)后4 ℃搖床裂解30 min；將裂解液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，留上清液；從各組樣品中吸取20 μL上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定其蛋白濃度，其余上清中加入6×上樣緩沖液，沸水變性10 min；根據(jù)蛋白濃度測(cè)定結(jié)果，用1×上樣緩沖液調(diào)平各組樣品的蛋白濃度。蛋白經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉。蛋白條帶經(jīng)一抗(1∶1 000稀釋)、二抗(1∶10 000稀釋)孵育后，利用Odyssey紅外熒光掃描儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Image J軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析，使用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析并作圖，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS、CBD對(duì)HC11細(xì)胞活力的影響

利用MTT法檢測(cè)不同濃度CBD對(duì)HC11細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖1-A所示。CBD濃度在20 μmol/L以內(nèi)時(shí)對(duì)HC11細(xì)胞活力均無顯著影響(P>0.05)，且CBD濃度為2、4、6 μmol/L時(shí)HC11細(xì)胞活力與對(duì)照組相比略有上升。后續(xù)試驗(yàn)采用2、4、6 μmol/L CBD對(duì)HC11細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，以探究其對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞氧化損傷是否具有保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了LPS單獨(dú)處理以及2、4、6 μmol/L CBD+LPS共處理對(duì)HC11細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖1-B所示。LPS單獨(dú)處理和2、4、6 μmol/L CBD+LPS共處理對(duì)HC11細(xì)胞活力均無顯著影響(P>0.05)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS和CBD對(duì)HC11細(xì)胞活力無影響，后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果不受細(xì)胞活力變化的影響。

A：CBD對(duì)HC11細(xì)胞活力的影響；B：LPS與CBD+LPS對(duì)HC11細(xì)胞活力的影響。CON：對(duì)照組；CBD：CBD組；LPS：LPS組；CBD+LPS：CBD+LPS組；2、4、6、8、10、20：CBD作用濃度(μmol/L)。各組數(shù)據(jù)柱上的數(shù)值為與對(duì)照組相比較的P值。

2.2 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量的影響

DCFH-DA是一種熒光探針，本身無熒光，進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，從而使探針裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將其氧化生成有綠色熒光的DCF，其熒光強(qiáng)度反映了細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響如圖2所示。與對(duì)照組相比，1 μg/mL LPS處理后HC11細(xì)胞內(nèi)生成大量ROS，綠色熒光強(qiáng)度較高；維生素E+LPS處理后HC11細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著降低，幾乎檢測(cè)不到綠色熒光，而利用2、4、6 μmol/L CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯下降，其中以6 μmol/L CBD預(yù)處理后效果最顯著。

A：對(duì)照組；B：LPS組；C:維生素E+LPS組；D：2 μmol/L CBD+LPS組；E：4 μmol/L CBD+LPS組；F：6 μmol/L CBD+LPS組。

CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響如表2所示。與對(duì)照組相比，1 μg/mL LPS處理后HC11細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著上升(P<0.05)；與LPS相比，2、4、6 μmol/L CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著下降(P<0.05)，其中以6 μmol/L CBD+LPS組MDA含量最低。

表2 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響

2.3 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性及T-AOC的影響

CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性及T-AOC的影響如表3所示。與對(duì)照組相比，1 μg/mL LPS處理后，HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性和T-AOC均極顯著降低(P<0.01)。與LPS組相比，4、6 μmol/L CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性和T-AOC均極顯著升高(P<0.01)；2 μmol/L CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性無顯著變化(P>0.05)，T-AOC顯著升高(P<0.05)，SOD活性極顯著升高(P<0.01)。由以上結(jié)果可知，6 μmol/L CBD預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性和T-AOC的保護(hù)作用最為明顯。

表3 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性及T-AOC的影響

2.4 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響如圖3所示。與對(duì)照組相比，1 μg/mL LPS處理后HC11細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1、SOD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)，HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，2、4、6 μmol/L CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)。

“*”表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，“#”表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，“##”表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖4 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如圖5所示。與對(duì)照組相比，1 μg/mL LPS處理后，HC11細(xì)胞內(nèi)HO-1、NQO1和SOD1蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)，Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，4、6 μmol/L CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)；2 μmol/L CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和SOD1蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)，HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。

3 討 論

乳腺上皮細(xì)胞不僅是乳腺組織中合成乳蛋白、乳脂和乳糖等基本乳成分的主要場(chǎng)所，也是乳腺的天然屏障。當(dāng)乳腺上皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，其屏障功能喪失，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。本研究利用LPS誘導(dǎo)建立HC11細(xì)胞氧化損傷模型。在前期研究中，已篩選出建立氧化損傷細(xì)胞模型的LPS最佳作用濃度和處理時(shí)間分別為1 μg/mL和24 h。Guo等[18]利用此方法誘導(dǎo)原代牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)發(fā)生炎癥反應(yīng)以探究煙酸對(duì)乳腺炎的緩解作用。Lai等[19]在研究中也采用此方法建立小鼠乳腺上皮細(xì)胞(mMECs)炎癥反應(yīng)模型以探究靛玉紅對(duì)小鼠乳腺炎的治療作用。許多乳腺炎的相關(guān)研究均采用類似方法建立氧化損傷或炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型。

當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生速度大于抗氧化劑的清除速度時(shí)，過量的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)，從而引發(fā)細(xì)胞氧化損傷，誘發(fā)乳腺炎等代謝性疾病。此外，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化并產(chǎn)生包括MDA在內(nèi)的一系列復(fù)雜化合物，其過量積累會(huì)引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而損傷細(xì)胞。因此，MDA含量可間接體現(xiàn)機(jī)體的氧化損傷程度[20]。本研究以細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量作為衡量機(jī)體氧化損傷程度的2個(gè)重要指標(biāo)。采用DCFH-DA探針法和TBA法分別檢測(cè)了不同處理HC11細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量，結(jié)果顯示，與LPS組相比，不同濃度CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)中ROS和MDA含量均顯著降低，其中以6 μmol/L CBD預(yù)處理時(shí)效果最為顯著。

抗氧化酶活性是反映細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的主要指標(biāo)之一。當(dāng)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS時(shí)，抗氧化酶會(huì)起到防御作用，清除過多的ROS以維持機(jī)體正常生理功能[20]。GSH-Px是機(jī)體中廣泛存在的一種過氧化物分解酶，能催化還原型谷胱甘肽(GSH)還原脂質(zhì)氫過氧化物成羥基化合物，從而清除自由基，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷過程起著關(guān)鍵作用[21]。SOD是一種能夠清除機(jī)體內(nèi)氧自由基，尤其是超氧陰離子自由基的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起到至關(guān)重要的作用[22]。機(jī)體中存在的各種抗氧化大分子、小分子和酶的總體水平即體現(xiàn)了該體系內(nèi)的T-AOC，它是反映機(jī)體抗氧化功能綜合表現(xiàn)的指標(biāo)[23]。因此，本試驗(yàn)通過檢測(cè)不同濃度CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性和T-AOC的影響，以探究CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，當(dāng)利用3種不同濃度CBD預(yù)處理HC11細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD活性及T-AOC較LPS組顯著或極顯著升高，該結(jié)果表明，CBD能夠通過提升細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性清除過多的ROS和MDA，從而緩解LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。

Nrf2調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的多種基因。正常情況下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)在細(xì)胞質(zhì)中形成復(fù)合體呈失活狀態(tài)。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1與Nrf2解離，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA上相應(yīng)靶位點(diǎn)結(jié)合，可激活HO-1、NQO1和SOD1等抗氧化酶活性，維持機(jī)體氧化平衡狀態(tài)[24]。Wang等[25]研究證實(shí)，2-甲基壬基酮(魚腥草中提取的一種天然活性成分)可通過激活Nrf2信號(hào)通路產(chǎn)生HO-1，從而減少LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化損傷。Li等[26]研究表明，姜黃素(一種天然酚類物質(zhì))通過激活Nrf2信號(hào)通路上調(diào)HO-1和NQO1的表達(dá)，從而減輕LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化損傷及炎癥反應(yīng)。為了研究CBD對(duì)Nrf2及相關(guān)抗氧化酶基因和蛋白表達(dá)的影響，本試驗(yàn)通過qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)了不同組HC11細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1 mRNA及其編碼蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與LPS組相比，不同濃度CBD預(yù)處理后HC11細(xì)胞內(nèi)Nrf2 mRNA及其編碼蛋白的相對(duì)表達(dá)量均極顯著上調(diào)，HO-1、NQO1和SOD1等抗氧化酶的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平也均顯著或極顯著上調(diào)，與上述研究結(jié)果類似。綜上所述，CBD可以通過激活Nrf2信號(hào)通路促進(jìn)抗氧化酶HO-1、NQO-1和SOD1的表達(dá)，對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

CBD可通過激活Nrf2信號(hào)通路促進(jìn)HO-1、NQO-1和SOD1等抗氧化酶的表達(dá)，提高細(xì)胞總抗氧化能力，清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS和MDA，對(duì)LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞氧化損傷起到一定的保護(hù)作用，當(dāng)CBD濃度為6 μmol/L時(shí)保護(hù)效果最為顯著。因此，CBD具有作為飼料添加劑應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)以提高奶牛乳腺組織抗氧化機(jī)能的潛力。