李軍德 張高瞻 劉曉娟 宋吉英*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學校醫(yī)院，青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，青島266109)

黃酮類化合物廣泛存在于植物中，對哺乳動物和其他類型的細胞具有許多有益的生理效應和藥理作用，是多種中草藥的有效成分。蒲公英作為一種藥食同源的中草藥，含有大量的黃酮類物質(zhì)，對動物有抗炎、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等作用，其功效已成為近些年研究的熱點[1]。中草藥飼料添加劑是指以中草藥為原料制成的飼料添加劑，其作用主要表現(xiàn)在防病保健、提高動物生產(chǎn)性能、改善動物產(chǎn)品質(zhì)量和改善飼料品質(zhì)等方面，具有來源天然性、功能多樣性、安全可靠性、經(jīng)濟環(huán)保性等特點。自2020年起，我國飼料中全面禁止添加抗生素，發(fā)現(xiàn)并利用能夠有效替代抗生素的藥食同源的中草藥逐漸成為飼料行業(yè)的研究熱點。近年來，中草藥在替代畜禽飼用抗生素的試驗研究中已被證實具有改善動物生長性能、提高機體抗氧化能力、增強免疫功能等良好效果[2-3]。蒲公英作為一種分布廣泛、價格低廉、營養(yǎng)價值豐富、生物活性良好的中草藥飼料添加劑，可以合理應用于動物生產(chǎn)實踐中[4-7]。但蒲公英中黃酮的含量因產(chǎn)地氣候、土壤和生長期等客觀條件的不同而不同，因此使用時建議對黃酮含量進行測定。蒲公英中黃酮的提取和測定，相關文獻報道較多[8-13]，目前的文獻對黃酮的提取多是采用單一的超聲提取或微波提取，測定方法主要是普通熒光法。用響應面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取的方法目前尚未見報道，響應面法考慮了試驗的隨機誤差，計算簡單，與常用的正交試驗相比，其突出優(yōu)勢是在尋找最佳試驗條件的過程中，可以連續(xù)對試驗的各個水平進行分析，而正交試驗只能對一個個孤立的試驗點進行分析[14-15]。超聲-微波協(xié)同萃取技術近年來以其萃取時間短、萃取效率高、樣品耗量低等突出優(yōu)點，在天然物質(zhì)的提取中得到了廣泛的應用[16-19]。同步熒光法具有選擇性好、靈敏度高、干擾少等優(yōu)點，是多組分混合物熒光測定的一種有效手段。本試驗以煙臺某地區(qū)的蒲公英為試驗對象，采用響應面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取黃酮的工藝，主要確定提取溶劑乙醇濃度、微波功率、萃取時間和料液比等提取因素，同時采用同步熒光法測定其中黃酮的含量，特別是確定最佳波長差值(Δλ)，從而得到最佳提取工藝和檢測方法，為動物飼糧中含黃酮類中草藥的添加提供控制依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：F-2500熒光分光光度計(Hitachi公司)、GW-2000超聲-微波協(xié)同萃取反應儀(上海新拓分析儀器科技有限公司)、PB-10酸度計(北京賽多利斯科學儀器北京有限公司)、GL-12B離心機(上海安亭科學儀器廠)、AR124CN電子天平(常州奧豪斯儀器有限公司)。

蘆丁，純度大于98%，上海麥克林生物化學有限公司；乙醇，色譜純，德國Meker公司；其他試劑為優(yōu)級純分；試驗用水為超純水；蒲公英全草購于山東省煙臺市市場，粉碎后備用。

1.2 同步熒光光譜參數(shù)

狹縫寬度激發(fā)波長(Ex)：5 nm，發(fā)射波長(Em)：5 nm，掃描范圍Ex：400～500 nm，Em：455～555 nm，掃描速度300 nm/min，延遲時間0 s，電壓400 V。

1.3 樣品前處理方法

稱取一定質(zhì)量的蒲公英全草樣品，加入提取溶劑，設置微波功率和萃取時間，進行超聲-微波協(xié)同萃取，將提取后的混合物離心，上清液旋蒸(50 ℃)至干，加入10 mL色譜純乙醇溶解旋蒸后的殘留物，用0.45 μm的一次性濾膜過濾以除去其中的固體顆粒，濾液中加入Al(NO3)3溶液和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，色譜純乙醇定容至50 mL，待測。

1.4 蘆丁同步熒光光譜分析條件的單因素試驗設計

準確移取0.5 mg/mL的蘆丁標準溶液1 mL于25 mL容量瓶，以Δλ、Al(NO3)3溶液濃度、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的pH、反應時間和溫度5個因素為單因素，每次改變1個因素分別進行同步熒光光譜分析，考察各個因素對蘆丁同步熒光強度的影響。具體試驗設計見表1。

表1 同步熒光光譜分析條件的因素和水平

1.5 蒲公英中黃酮提取效果的單因素試驗設計

稱取2.0 g粉碎的蒲公英全草樣品，以乙醇濃度、微波功率、萃取時間、料液比4個因素為單因素，按照1.3的方法對樣品進行前處理，每次改變1個因素分別對提取液進行同步熒光光譜分析，考察各個因素對黃酮提取效果的影響。具體試驗設計見表2。

表2 黃酮提取效果的因素和水平

1.6 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取溶劑乙醇濃度(A)、微波功率(B)、萃取時間(C)、料液比(D)為自變量，提取液的熒光強度為響應值，設計4因素3水平響應面試驗，優(yōu)化蒲公英中黃酮的提取工藝，確定最佳提取條件。具體試驗設計見表3。

表3 響應面試驗的因素和水平

1.7 蒲公英中黃酮含量的測定

準確吸取樣品待測溶液1 mL于25 mL容量瓶，加入一定量的Al(NO3)3溶液，pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，乙醇定容，反應50 min，同步熒光法測定其熒光強度。樣品中的黃酮以蘆丁標準品作為表述，根據(jù)標準工作曲線求出所測溶液中蘆丁的含量，按照下列公式求出樣品中黃酮的含量。

w=c×V1×V2×10-3/m。

式中：w為樣品中黃酮的含量(mg/g)；c為根據(jù)標準工作曲線計算的所測溶液的濃度(μg/mL)；V1為所測溶液的體積(mL)；V2為樣品處理后所得待測溶液的體積(mL)；m為樣品的質(zhì)量(g)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

優(yōu)化提取工藝試驗采用Box-Behnken設計(BBD)，利用數(shù)據(jù)處理軟件Design-Expert 10.0.4、Origin Pro 2018C和Excel 2017進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁同步熒光光譜分析條件單因素試驗結(jié)果

由圖1-a可知，不同的Δλ對蘆丁的同步熒光強度是有影響的，隨著Δλ的增大，同步熒光強度逐漸增強，當Δλ=55 nm時，蘆丁的光譜圖規(guī)范且同步熒光強度最大。由圖1-b可知，當Al(NO3)3溶液濃度為0.2%時，蘆丁的同步熒光強度最大。由圖1-c可知，當pH<6.0時，蘆丁的同步熒光強度基本不變；pH=6.0時，蘆丁的同步熒光強度最大；pH>6.0時，蘆丁的同步熒光強度下降。由圖1-d可知，隨著反應時間的增加，蘆丁的同步熒光強度逐漸增強，當反應時間超過50 min時，同步熒光強度基本保持不變。由圖1-e可知，隨著溫度的升高，蘆丁的同步熒光強度呈現(xiàn)下降的趨勢，當溫度為25 ℃時，蘆丁的同步熒光強度最大，因此試驗在室溫下進行即可。對同步熒光光譜分析條件單因素試驗結(jié)果進行方差分析，Δλ、Al(NO3)3溶液濃度、pH、反應時間、溫度對應的F值分別為4.08、48.74、1.93、2.19、4.74，顯著性水平α=0.05時，查得其臨界值分別為2.51、2.39、2.66、3.11和3.48，其P值分別為0.006、<0.001、0.130、0.120和0.020，以上結(jié)果說明Δλ和Al(NO3)3溶液濃度對結(jié)果的影響極其顯著，溫度對結(jié)果的影響顯著，而pH和反應時間對結(jié)果的影響不顯著。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定同步熒光法測定蘆丁的最佳光譜條件為：Δλ=55 nm，Al(NO3)3溶液濃度為0.2%，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液使溶液pH=6，室溫下反應50 min。在以上最佳測定條件下，得到蘆丁的同步熒光光譜圖，如圖2所示。

圖1 各因素對蘆丁同步熒光強度的影響

圖2 蘆丁的同步熒光光譜圖

2.2 蘆丁標準工作曲線的線性方程

用作圖法繪制蘆丁工作標準曲線，得出蘆丁標準工作曲線的線性方程為F=15.14c+13.54，線性相關系數(shù)(R2)=0.991 8，c為蘆丁的濃度(μg/mL)，F(xiàn)為同步熒光強度。

2.3 蒲公英中黃酮提取效果的單因素試驗結(jié)果

由圖3-a可知，低濃度范圍內(nèi)提取液的熒光強度隨乙醇濃度的增加而增大，當乙醇濃度超過50%時，熒光強度開始降低。由圖3-b可知，提取液的熒光強度隨著微波功率的增加而增大，當微波功率超過300 W時，熒光強度開始下降。由圖3-c可知，提取液的熒光強度隨著萃取時間的增加而增大，當萃取時間超過30 min時，熒光強度開始下降。由圖3-d可知，萃取劑量少時熒光強度隨著料液比的增加而增大，當料液比超過1∶30(g∶mL)時，熒光強度基本趨于穩(wěn)定。對蒲公英中黃酮提取效果的單因素試驗結(jié)果進行方差分析，乙醇濃度、微波功率、萃取時間和料液比4個因素對應的F值分別為13.53、4.22、1.70和4.59，顯著性水平α=0.05時，查得其臨界值分別為3.11、3.48、3.48、3.48，其P值分別為<0.001、0.029、0.226、0.023，說明乙醇濃度對提取效果的影響極顯著，微波功率和料液比對提取效果的影響顯著，而萃取時間對提取效果的影響不顯著。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定超聲-微波協(xié)同萃取蒲公英中黃酮的最佳提取條件為：50%乙醇水溶液作為提取溶劑，微波功率300W，萃取時間30min，料液比1∶30 (g∶mL)。

圖3 各因素對黃酮提取效果的影響

2.4 響應面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取條件

2.4.1 響應面試驗模型和數(shù)據(jù)

響應面試驗模型設計以提取溶劑乙醇濃度(A)、微波功率(B)、萃取時間(C)、料液比(D)為自變量，提取液的熒光強度為響應值，設計4因素3水平響應面試驗，共29組，所得數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 響應面法Box-Behnken設計和結(jié)果

續(xù)表4試驗號 Test numberABCD熒光強度 Fluorescence intensity1901-1094.0020110088.2821100186.17220000109.0023001192.48240000110.1125-1-10080.03260-10188.32270000116.4728100-180.0329010198.55

2.4.2 響應面試驗結(jié)果

通過回歸分析，得出以熒光強度為響應值的二次多項回歸方程：F=112.78+2.61A+2.21B-0.53C+2.15D+0.25AB+1.32AC+0.25AD+1.03BC+1.23BD+1.13CD-19.21A2-9.21B2-10.29C2-11.65D2。

式中：F為提取液中黃酮的熒光強度；A、B、C、D分別為乙醇濃度、微波功率、萃取時間和料液比。

響應面法數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果如表5所示，由分析結(jié)果可知，模型的P值<0.000 1，說明回歸模型極顯著，失擬項數(shù)值表明其差異不顯著；因素的顯著性分析結(jié)果顯示，單因素萃取時間對試驗結(jié)果的影響不顯著，其他各項對試驗結(jié)果的影響均達到顯著水平；同時可以看出，乙醇濃度對提取效果的影響最大，其次是微波功率和料液比，萃取時間對提取效果的影響較小，這和單因素試驗結(jié)果基本一致。

表5 響應面法數(shù)據(jù)方差分析

續(xù)表5方差來源Sources of variation平方和Sum of squares自由度df均方Mean squareF值F-valueP值P-value顯著性Significant殘差 Residual121.94148.71純誤差Lack of ft48.59104.860.270.959 7NS純誤差Pure error73.34418.34所有項 Cor total3 459.8428

表6 黃酮提取的二次多項式擬合分析

2.4.3 各因素交互作用響應面分析

響應面圖是響應值對各試驗因素所構成的三維空間曲面圖，曲線走勢越陡，影響越顯著，曲線走勢平滑，則影響較小；等高線橢圓形狀能反映出交互作用的強弱，等高線呈橢圓形說明交互作用顯著，呈圓形則反之[20-21]。

從圖4可以看出，在交互項的相互影響中，乙醇濃度與微波功率、萃取時間、料液比之間的交互作用顯著，而其他因素之間的交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。根據(jù)建立的模型，得到蒲公英中黃酮的最佳提取條件：乙醇濃度51.64%，微波功率251.4 9 W，萃取時間29.03 min，料液比1∶32.08 (g∶mL)。結(jié)合試驗情況，確定最佳提取條件為：乙醇濃度50%，微波功率250 W，萃取時間30 min，料液比1∶30 (g∶mL)，這也與單因素試驗結(jié)果基本一致。在此最佳提取條件下，所得蒲公英中黃酮的含量為3.52 mg/g。

圖4 各因素交互作用響應面圖

3 討 論

3.1 測定條件對蘆丁同步熒光強度的影響

同步熒光法近幾年在黃酮的分析測定中得到了一定的應用[22-24]。在恒波長同步熒光法中，Δλ的選擇十分重要，這將直接影響到同步熒光光譜的形狀、帶寬和信號強度[25-27]，它是同步熒光檢測方法中最重要的檢測參數(shù)，本試驗從Δλ=10 nm開始，每隔5～10 nm進行設置，討論Δλ對蘆丁同步熒光強度的影響，當熒光強度有明顯增強時，細化Δλ的數(shù)值，每隔5 nm進行討論，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Δλ=55 nm時，蘆丁的光譜圖規(guī)范且同步熒光強度最大。相關文獻[22-24]對Δλ的數(shù)值討論基本是間隔10 nm，數(shù)值相對粗略。黃酮類化合物能與Al3+反應形成熒光絡合物[28-30]，從而使化合物的熒光強度增強，當蘆丁的熒光強度最大時，說明絡合反應達到飽和，因此可以確定溶液中Al(NO3)3的適宜濃度為0.2%；本試驗采用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)整溶液為弱酸性，發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境對熒光強度的影響一般，pH=7.0時同步熒光強度開始有下降趨勢，這可能是因為黃酮類化合物在偏中性環(huán)境中與鈉鹽生成了螯合物[11]，從而造成熒光強度減弱；蘆丁與Al3+的絡合反應需要一定的時間，當反應時間超過50 min時，熒光強度基本保持不變，說明Al3+與蘆丁已反應充分；絡合反應與溫度有直接的關系，隨著溫度的升高，蘆丁的熒光強度呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因為隨著溫度的升高，熒光絡合物的解離反應趨勢增大[23]，本試驗顯示在室溫條件蘆丁的熒光強度最大，相關文獻幾乎沒有對溫度這一影響因素進行討論。

3.2 不同因素對蒲公英中黃酮提取效果的影響

蒲公英中黃酮的提取采用超聲-微波協(xié)同萃取法，影響提取效果的主要因素有乙醇濃度、微波功率、萃取時間和料液比。不同濃度的乙醇溶液對黃酮的提取效果不同，低濃度范圍內(nèi)提取液的熒光強度隨乙醇濃度的增加而增大，當乙醇濃度超過50%時熒光強度開始降低，這可能是因為乙醇濃度過高時，蒲公英中的脂溶性物質(zhì)的析出量也會增加，從而抑制了黃酮的進一步溶解，導致熒光強度下降。微波功率對提取效果也有影響，隨著微波功率的增加，熒光強度增強，說明黃酮類化合物溶出量增多，當微波功率超過300 W時，熒光強度開始下降，這是因為微波功率過大，提取液的溫度會有明顯的提升，溫度過高會造成部分黃酮類化合物的分解[31-32]，從而導致黃酮含量降低，熒光強度下降。熒光強度隨著萃取時間的增加而增大，說明蒲公英中的黃酮隨著萃取時間的延長溶出量增多，但超過30 min時熒光強度開始下降，這可能是因為超聲波的熱效應能使黃酮類化合物分子的溶出加劇，但是時間過長，微波的高能作用和超聲波振動的空化作用加劇，使得提取液產(chǎn)生的熱量過多，溫度升高；同時，超聲波的機械作用可能也會使部分黃酮類化合物分子結(jié)構遭到破壞，甚至加劇其分解，從而造成溶液中黃酮含量的減少。熒光強度隨著料液比的增加而增大，這是因為料液比較小時，黃酮類化合物分子與溶劑的接觸不充分，溶出速度慢而且溶出不徹底，所以黃酮的溶出量少；隨著料液比的逐漸增加，提取溶劑的量增多，蒲公英樣品與溶劑充分接觸，溶解效果增強，當料液比達到一定數(shù)值時熒光強度基本趨于穩(wěn)定，說明黃酮的溶出量已達到飽和；料液比過高，樣品處理過程中旋蒸濃縮耗時多，試驗成本也會增加。

4 結(jié) 論

① 響應面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取技術提取蒲公英中的黃酮，其最佳提取條件為乙醇濃度50%，微波功率250 W，萃取時間30 min，料液比1∶30 (g∶mL)。

② 同步熒光法測定黃酮具有選擇性好、靈敏度高、干擾少、檢測結(jié)果準確度高的優(yōu)點，最佳測定條件為Δλ=55 nm，Al(NO3)3濃度0.2%，加入pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 mL，室溫條件下反應50 min。