郝怡泓 李大彪

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)自治區(qū)高等學(xué)校重點實驗室，呼和浩特010018)

在乳的合成過程中，乳腺傾向于攝取過量的支鏈氨基酸(branched chain amino acids，BCAA)，這是因為在乳腺上皮細(xì)胞中，BCAA的碳骨架可以通過支鏈α-酮酸脫氫酶部分氧化，為高度活躍的代謝過程提供能量，包括營養(yǎng)物質(zhì)的運輸、蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)以及脂質(zhì)和乳糖的合成，BCAA不僅是細(xì)胞生長和乳蛋白合成的原料，還能作為細(xì)胞因子，對乳蛋白的合成起調(diào)控作用。本文綜述了BCAA對乳糖、乳脂以及乳蛋白合成的影響及氨基酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路，旨在為探明BCAA對乳成分合成的影響。

1 BCAA生物學(xué)功能

亮氨酸(leucine，Leu)、異亮氨酸(isoleucine，Ile)和纈氨酸(valine，Val)是動物體內(nèi)不能合成的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)，因其分子組成中碳鏈都有分支，又被稱為BCAA，屬于功能性氨基酸[1]。其主要氧化部位在肌肉中，占哺乳動物肌肉組織中EAA總量的40%，占牛奶蛋白中EAA的50%[2]，對奶牛乳蛋白合成非常重要，具有提高乳蛋白合成率和降低乳蛋白降解的作用[3]，此外，BCAA還可以促進(jìn)胰島素釋放以及調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路[4]。由于其分解產(chǎn)物不同，Val、Leu、Ile分別屬于生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼生酮氨基酸，雖然BCAA參與乳蛋白的合成和分解，并參與體內(nèi)的代謝，但與其他EAA不同的是，BCAA不能在肝臟中代謝，而是依賴支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶(branched amino acid transferase，BCAT)和支鏈氨基酸脫氫復(fù)合體(branched amino acid dehydrogenation complex，BCKAD)的作用下脫去氨基生成相應(yīng)的α-酮酸，氧化脫羧生成相應(yīng)的脂酰輔酶A(CoA)，經(jīng)過β-氧化生成相應(yīng)的烯脂酰CoA，自此，三者各自進(jìn)行分解，生成生糖或生酮產(chǎn)物，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))生糖或生酮，參與機體氧化供能[5]。

1.1 調(diào)控機體乳糖代謝

在反芻動物中，葡萄糖是合成乳糖的主要前體物。哺乳高峰期，血液中60%～85%的葡萄糖被引導(dǎo)到乳腺，以滿足牛奶中對葡萄糖生產(chǎn)乳糖的需求[6]。乳腺攝取葡萄糖的過程以及有關(guān)乳糖酶活性對乳糖產(chǎn)量有極大影響，能夠影響牛奶中乳糖含量[7]。

目前的研究關(guān)于BCAA對乳糖代謝的影響有不同的意見。一部分研究表明，增加BCAA添加量能夠促進(jìn)乳糖合成。黃紅英[8]試驗表明，隨著BCAA含量的升高，母豬血液葡萄糖含量呈線性增加趨勢，表明BCAA可以促進(jìn)合成糖原，使得母豬體內(nèi)血液葡萄糖含量升高，乳腺攝取血液中葡萄糖合成乳蛋白的量增多。Doi等[4]研究指出，BCAA中Leu和Ile均能促進(jìn)大鼠血漿中葡萄糖代謝，且Ile效果明顯優(yōu)于Leu。Nichols等[9]及Yoder等[10]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈輸注Leu和Ile的乳糖產(chǎn)量增加，表明Ile對乳糖合成有積極影響，或者Leu和Ile共同作用時，二者對乳糖合成有積極影響。

然而還有部分研究表示，BCAA的缺失能夠促進(jìn)乳糖的合成。Xiao等[11]研究表明，與正常小鼠相比，飲食中缺乏Leu的小鼠組織中胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和蛋白激酶B(protein kinase，PKB或AKT)的磷酸化增加。Appuhamy等[12]觀察到，向不含EAA的培養(yǎng)基中添加40%的BCAA時，奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)中的ATP濃度下降了36%。Curtis等[13]研究表明，所有3種BCAA的頸部輸液并沒有改變泌乳牛對葡萄糖的凈攝取或乳糖產(chǎn)量。

1.2 調(diào)控乳脂肪合成

乳蛋白與乳脂肪合成可通過mTORC1-S6蛋白激酶1(protein S6 kinase 1，S6K1)途徑相互作用，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1，SREBP 1)被磷酸化的S6K1激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳脂肪的合成。Jenkins等[14]研究表明，一定比例的氨基酸能夠促進(jìn)SREBP1的表達(dá)。王立娜[15]研究表明，Leu不僅對乳蛋白合成具有積極的影響，還能上調(diào)BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因SREBP1表達(dá)和增加甘油三酯(triglyceride，TG)的合成。此外，趙艷麗[16]研究發(fā)現(xiàn)，適宜的Leu含量能夠激活mTOR信號通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子SREBP1和過氧化物酶體增殖物γ(peroxisome proliferator activated receptor-gamma，PPARγ)的表達(dá)，激活酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)通路上調(diào)SREBP1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，進(jìn)而促進(jìn)了短鏈和中鏈脂肪酸(short and medium chain fatty acids，SMCFA)的合成，抑制長鏈脂肪酸(long chain fatty acids，LCFA)的攝取與轉(zhuǎn)運，乳脂肪合成量增加。此外，Ile和Val對乳脂肪的合成也具有調(diào)控作用。李珊珊[17]向BMECs中添加108 μg/mL的Val時，SREBP1基因表達(dá)水平增加，表明較低的Val含量能夠刺激細(xì)胞，通過增加乳脂肪合成基因的表達(dá)，誘導(dǎo)乳脂肪的合成。高學(xué)軍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，提高BMECs中Ile含量能增加SREBP1c蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)乳脂肪的合成。

1.3 調(diào)控乳蛋白合成

BCAA作為第2限制性氨基酸，對乳蛋白的合成具有重要意義。Moshel等[19]扣除牛乳腺上皮細(xì)胞中幾種氨基酸發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中不含Leu的組，mTOR磷酸化水平、真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)和真核翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)的含量顯著降低，與正常氨基酸含量組相比乳蛋白合成量降低。Appuhamy等[20]和Arriola等[21]研究證明，Ile在體外刺激乳腺mTORC1時幾乎與Leu一樣有效，Ile對mTOR磷酸化有顯著影響，且Leu和Ile與核糖體蛋白S6(ribosomal protein S6，RPS6)的磷酸化呈線性關(guān)系。Doelman等[22]研究發(fā)現(xiàn)，從EAA中扣除可代謝Leu可顯著降低乳蛋白含量。董賢文[23]研究表明，提高細(xì)胞中Ile和Val含量，能促進(jìn)BMECs中正向調(diào)控酪蛋白合成通路的活性，提高mTOR和RPS6的磷酸化水平，促進(jìn)酪蛋白合成。

Weekes等[24]對低蛋白質(zhì)水平飼糧飼喂的奶牛進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與真胃灌注總氨基酸組相比，灌注單一缺乏3種BCAA對奶牛乳產(chǎn)量和乳成分沒有影響。Appuhamy等[25]研究表明，當(dāng)?shù)鞍彼岷唾嚢彼岵幌拗迫榈鞍缀铣蓵r，BCAA的注入并不能增加乳蛋白的合成。Haque等[26]通過真胃灌注試驗發(fā)現(xiàn)，降低灌注液中Ile的供給量，使血液中Ile含量下降34%時，對乳蛋白合成無顯著影響。徐小宇[27]研究發(fā)現(xiàn)，提高Leu含量伴隨著Ile、Val等氨基酸含量的降低，但乳蛋白合成量有上升的趨勢。

2 BCAA調(diào)控乳成分合成的作用機理

2.1 調(diào)控乳糖合成的作用機理

在乳腺上皮細(xì)胞中，BCAA含量降低傾向于刺激細(xì)胞膜上的糖基化和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)的表達(dá)對乳糖合成速率進(jìn)行調(diào)控。Silva等[28]研究發(fā)現(xiàn)，減少對乳腺組織的BCAA供應(yīng)會增強GLUT1和己糖激酶(hexokinase，HK)的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖攝取和利用，但不影響乳糖合成率。這與細(xì)胞外BCAA缺乏與GLUT1的膜靶向性增加、GLUT1的N-糖基化和BMECs中葡萄糖攝取有關(guān)[29]。N-糖基化是GLUT1的一種重要的翻譯后修飾，它增強了從胞漿到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運、穩(wěn)定性和對葡萄糖的親和力[30]。在BMECs中，BCAA缺乏通過促進(jìn)糖基化增加GLUT1在細(xì)胞膜中的表達(dá)，從而使GLUT1從胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，雖然GLUT1到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位不依賴于胰島素，但它的轉(zhuǎn)錄被發(fā)現(xiàn)是通過乳腺上皮細(xì)胞和乳腺組織中AKT和mTOR介導(dǎo)的細(xì)胞信號而被胰島素增強的[31]。此外，在高爾基體中催化乳糖合成的β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)因BCAA缺乏而降低，表明BCAA對乳糖合成途徑上、下游相關(guān)酶的豐度的影響是相反的。也有部分研究表明乳糖合成量增加是因為哺乳動物細(xì)胞中的一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶2(general control nonrepressed 2，GCN2)/轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)能夠感知到氨基酸缺乏[10]，激活GCN2抑制mTORC1/S6K1信號通路，或是激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)信號通路，促進(jìn)胰島素信號通路開放，使胰島素敏感性發(fā)生變化[32]，導(dǎo)致乳腺對于血液中葡萄糖吸收利用效率增加。

此外，單獨添加BCAA對奶牛乳糖合成有相反的影響。王立娜[15]研究表明，提高BMECs中Leu的添加量能使AKT和GLUT1的基因表達(dá)水平顯著升高，乳糖含量增加；提高Ile和Val的添加量，乳糖含量無明顯變化。十二指腸注入Leu會減少乳糖產(chǎn)量[33]，而皺胃或頸靜脈注入Ile往往會增加乳糖產(chǎn)量。其可能的原因是當(dāng)血液中葡萄糖含量豐富時，細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)通透性受到胰島素調(diào)節(jié)發(fā)生改變，使得細(xì)胞對氨基酸和葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)攝取量增加，最終調(diào)控機體糖代謝[11]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和糖原的合成增加。

2.2 調(diào)控乳脂肪合成的作用機理

mTOR是乳腺泌乳信號通路中重要的核心成員，對乳蛋白和乳脂肪合成具有顯著促進(jìn)作用[34]。前人研究表明，AKT可能以多種方式針對SREBP，包括使其蛋白體降解途徑失活，促進(jìn)SREBP前體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體運輸，并促進(jìn)mTOR的活性[35]。Che等[36]研究發(fā)現(xiàn)，Val能激活A(yù)KT/mTOR途徑，促進(jìn)SREBP1從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運，上調(diào)SREBP1c介導(dǎo)的豬乳腺上皮細(xì)胞(porcine mammary epithelial cells，PMECs)中脂肪合成酶的表達(dá)，增加脂肪生成酶的蛋白表達(dá)，促進(jìn)乳脂肪的合成。添加磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)抑制劑LY294002后，Val對細(xì)胞TG含量的影響顯著下降，AKT和mTOR的磷酸化程度降低，SREBP1的靶基因乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)和脂肪酸激活與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白3(fatty acid activation and intracellular transport 3，F(xiàn)ABP3)基因表達(dá)水平顯著降低。孟春雨等[37]研究結(jié)果顯示，添加Leu顯著促進(jìn)乳脂的分泌。BCAA能通過氨基酸轉(zhuǎn)運體鈉離子依賴的中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白2(sodium-dependent neutral amino acid transporter 2，SNAT2)誘導(dǎo)激活mTOR，促進(jìn)S6K1磷酸化[38]，也可通過PI3K及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)等調(diào)控mTOR通路，調(diào)控乳脂肪合成。

2.3 調(diào)控乳蛋白合成的作用機理

2.3.1 mTOR信號通路

BCAA刺激乳腺上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的機制可能與mTOR激活mRNA翻譯啟動有關(guān)。mTOR與S6K1磷酸化呈正相關(guān)，與4EBP1磷酸化呈負(fù)相關(guān)，4EBP1的磷酸化可以通過促進(jìn)elF4F復(fù)合體的形成來促進(jìn)翻譯啟動，而elF4F復(fù)合體又將43S預(yù)啟動復(fù)合體招募到大多數(shù)mRNAs的5’端。被磷酸化的4EBP1與eIF4E疏遠(yuǎn)，翻譯起始正常形成[39]，從而對蛋白質(zhì)的起始和翻譯進(jìn)行調(diào)控?？鄢鼴MECs中Leu后，mTOR、4EBP1和eIF4E的磷酸化比率降低，乳蛋白合成量減少[19]。Ile或Leu增加Mac-T細(xì)胞和牛乳腺組織切片中S6K1的磷酸化，使mTOR活化，促進(jìn)酪蛋白的合成[20]。

當(dāng)Leu刺激G蛋白偶聯(lián)受體信號后，PI3K的p85亞基被募集到臨近質(zhì)膜的位置，p110亞基通過與p85亞基結(jié)合將底物磷酸化[40]，與AKT的受體結(jié)合物激活后，使PI3K活化，激活A(yù)KT，直接將mTOR磷酸化，或通過結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體(tuberous sclerosis complex，TSC)1/TSC2-Rheb調(diào)節(jié)mTOR信號[35]，影響基因和蛋白表達(dá)。龐學(xué)燕等[41]向BMECs中添加mTOR抑制劑LY294002后發(fā)現(xiàn)，添加抑制劑能顯著抑制Leu對κ-酪蛋白(CSN3)基因和蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，且mTOR、S6K1、eIF4E、eEF2基因表達(dá)水平降低。

2.3.2 GCN2信號通路

通常哺乳動物細(xì)胞中的GCN2/ATF4用來感知氨基酸限制或氨基酸失衡[42]。當(dāng)BCAA或Leu缺失導(dǎo)致tRNA空載時，GCN2與未帶電的tRNAs結(jié)合而被激活[43]。激活的GCN2引起自噬基因的轉(zhuǎn)錄，對體內(nèi)剩余氨基酸進(jìn)行循環(huán)利用，使氨基酸總量得到維持[35]。此外，eIF2α將GCN2激活并反過來使eIF2a磷酸化[44]，由于磷酸化的eIF2α抑制eIF2B和相應(yīng)的功能eIF2復(fù)合體的減少，使翻譯啟動重新發(fā)生在ATF4編碼區(qū)，ATF4蛋白的合成選擇性地增加，ATF4與異源二聚體結(jié)合，通過CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer-binding protein，C/EBP)激活轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答元件(C/EBP activating transcription factor response elements,CARE)，調(diào)節(jié)一系列涉及氨基酸轉(zhuǎn)運、新陳代謝、氧化狀態(tài)和能量管理的基因，使細(xì)胞內(nèi)氨基酸缺乏得到緩解[43]。Doelman等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與全部EAA相比，減去BCAA或Leu可降低乳蛋白產(chǎn)量。Edick等[45]研究表明，在離體培養(yǎng)牛乳腺上皮細(xì)胞時，精氨酸、Leu和賴氨酸同時缺失時，能激活細(xì)胞GCN2信號通路，使S6K1磷酸化水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致BMECs中酪蛋白合成量降低。然而，目前的研究多集中在BCAA通過GCN2信號通路影響肌肉和肝臟中蛋白質(zhì)及脂肪的合成，BCAA如何通過GCN2信號通路影響B(tài)MECs中乳成分的合成仍有待于進(jìn)一步的研究和探討。

3 BCAA的拮抗作用對乳成分合成的影響

據(jù)文獻(xiàn)報道，Harper等在1954年首次發(fā)現(xiàn)Ile能消除Leu過量所導(dǎo)致大鼠生長遲緩和采食量下降[46]，由此推測BCAA之間可能存在相互作用。Allen[47]研究發(fā)現(xiàn)，BCAA尤其是Leu會損害另一種BCAA的利用，并導(dǎo)致禽采食量和生長減少。Maynard等[48]觀察到禽飼糧BCAA之間存在明顯的相互作用。Cemin等[49]研究表示，飼喂高Leu水平飼糧可降低血漿和其他幾種組織中Ile和Val的含量，影響仔豬采食量。劉財禮等[50]、冉學(xué)光等[51]研究表明，適量的Leu能促進(jìn)仿刺參幼參、中國花鱸等水產(chǎn)動物的生長，但過量添加Leu會加速蛋白質(zhì)的合成作用，引起Ile和Val缺乏，影響機體生長。

現(xiàn)有研究表明，BCAA的相互作用主要表現(xiàn)為BCAA拮抗，由于三者間相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使得他們的拮抗主要表現(xiàn)為：1)運載體的競爭由于BCAA結(jié)構(gòu)相似，在通過各種膜被動物體消化吸收時，彼此之間競爭運載系統(tǒng)。2)酶活性的競爭，作為組成蛋白質(zhì)的EAA，蛋白質(zhì)及組織中的BCAA含量較為穩(wěn)定。當(dāng)BCAA在動物體內(nèi)的含量發(fā)生改變時，通過降低BCAA的tRNA連接酶活性，使BCAA參與蛋白質(zhì)的合成過程受阻。3)相同酶的催化競爭，BCAA的轉(zhuǎn)氨和脫氫作用都是由BCAT和α-酮酸脫氫酶催化的，因此，同一生化反應(yīng)將會引起B(yǎng)CAA同時進(jìn)行分解代謝，這時3種BCAA為競爭相同分解反應(yīng)的酶而表現(xiàn)出強烈的拮抗作用[52]。

對BMECs的研究也發(fā)現(xiàn)了BCAA的這種相互作用。Haque等[26]觀察到去除EAA中的Val時，總的BCAA含量下降至28%，乳蛋白合成量降低。推測BCAA之間存在一種平衡狀態(tài)，某種BCAA過量或不足可能會使乳腺對其他2種BCAA的攝取和利用造成影響。這與徐小宇[27]的研究結(jié)果一致，其給泌乳山羊頸靜脈梯度灌注Leu，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Leu部分或全部缺失時，Ile和Val含量上升，乳蛋白產(chǎn)率降低。相當(dāng)于創(chuàng)造了高Ile、Val含量、低Leu含量的條件，即BCAA不平衡，故推測BCAA之間存在拮抗或交互作用能夠影響乳蛋白的合成。趙素曼[53]在BMECs上的研究驗證了這一猜想，盡管Leu、Ile的缺失對BMECs細(xì)胞增殖沒有影響，但對蛋白信號通路的一些mRNA表達(dá)量及蛋白磷酸化程度產(chǎn)生影響，證明BCAA之間確實存在相互作用，影響乳中蛋白質(zhì)的合成和分解。但目前關(guān)于BCAA的研究多集中在單胃動物和水產(chǎn)動物上，其在BMECs上的研究較少，對乳成分的影響及其作用機制相關(guān)研究仍不清楚，有待于進(jìn)一步的研究和探索。

4 小 結(jié)

綜上所述，BCAA除作為動物體所需的EAA外，還具有調(diào)節(jié)機體糖代謝、調(diào)控乳脂肪和促進(jìn)乳蛋白合成的能力，然而BCAA對乳成分影響結(jié)果并不一致，可能是因為BCAA之間的相互作用，但目前有關(guān)BCAA拮抗作用對乳成分及乳品質(zhì)有何影響相關(guān)報道仍較少，其機理尚不明確，依然有待于進(jìn)一步研究和探討。