王菲菲 孔維怡 段靜丹 岳 康 劉 欣 郭延生

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750021)

目前普遍認(rèn)為產(chǎn)前3周到產(chǎn)后3周是奶牛的圍產(chǎn)期，其中產(chǎn)前3周稱為圍產(chǎn)前期，產(chǎn)后3周稱為圍產(chǎn)后期，圍產(chǎn)期奶牛健康與其生產(chǎn)性能和繁殖性能密切相關(guān)[1]。尤其是圍產(chǎn)后期受分娩、泌乳啟動(dòng)以及飼糧結(jié)構(gòu)改變等諸多應(yīng)激因素的影響，奶牛體內(nèi)激素水平、代謝狀態(tài)和免疫機(jī)能會(huì)發(fā)生巨大擾動(dòng)，這增加了酮癥、瘤胃酸中毒、乳腺炎、胎盤滯留、真胃變位和子宮炎等代謝性和炎性疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，探究奶牛圍產(chǎn)期代謝機(jī)能的變化規(guī)律對(duì)圍產(chǎn)期的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和疾病預(yù)防具有十分重要的意義。圍繞奶牛圍產(chǎn)期血液代謝物的變化國(guó)內(nèi)外學(xué)者也做了大量研究。Douglas等[3]利用酶比色法發(fā)現(xiàn)，奶牛分娩后血清中棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸含量明顯上升。Pilotto等[4]利用紅外檢測(cè)方法探究了奶牛圍產(chǎn)期血液脂肪酸、β-羥基丁酸酯(BHB)和α-生育酚含量變化之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)脂肪酸含量在奶牛分娩時(shí)達(dá)到最大值，BHB含量在奶牛分娩時(shí)增加了27%、產(chǎn)后30 d繼續(xù)增加20%，α-生育酚含量在產(chǎn)犢時(shí)最低。代謝組學(xué)是通過(guò)研究生物體系受外部刺激所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物含量變化的一門科學(xué)[5]。與傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法相比，代謝組學(xué)具有靈敏度和重復(fù)性高、樣品處理簡(jiǎn)單以及可一次性測(cè)定體內(nèi)大多數(shù)代謝物的優(yōu)點(diǎn)[6]。Luo等[7]采用代謝組學(xué)技術(shù)研究了奶牛產(chǎn)前21 d到分娩當(dāng)天血液代謝物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)分娩當(dāng)天與氧化脂質(zhì)相關(guān)的物質(zhì)亞油酸、花生四烯酸、γ-亞麻酸和磷脂酰膽堿較產(chǎn)前21 d顯著上調(diào)，而與氨基酸代謝相關(guān)的代謝物則表現(xiàn)出顯著下調(diào)。不過(guò)，目前對(duì)于奶牛圍產(chǎn)期血液代謝組動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究采用高靈敏度和分辨率的超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)代謝組學(xué)技術(shù)研究了奶牛產(chǎn)后0(分娩當(dāng)天)、7、14和21 d血液代謝物的變化情況，旨在評(píng)價(jià)奶牛圍產(chǎn)后期體內(nèi)代謝水平的變化規(guī)律，為圍產(chǎn)后期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和疾病預(yù)防提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇、分組及采樣

在寧夏某集約化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，選擇7頭體重[(600±20) kg]、胎次(2～3次)和體況評(píng)分(3.2～3.5)相近的荷斯坦奶牛，分別在產(chǎn)后0、7、14和21 d于尾靜脈采集血液。在產(chǎn)后21 d內(nèi)每頭奶牛血酮值均小于1.0，采食量和體溫正常，體細(xì)胞數(shù)小于20萬(wàn)個(gè)/mL，經(jīng)獸醫(yī)診斷健康狀況良好、無(wú)傳染性和炎性等相關(guān)疾病。產(chǎn)后0 d血液樣品依次標(biāo)記為A-1～A-7(A組)，產(chǎn)后7 d血液樣品依次標(biāo)記為B-1～B-7(B組)，產(chǎn)后14 d血液樣品依次標(biāo)記為C-1～C-7(C組)，產(chǎn)后21 d血液樣品依次標(biāo)記為D-1～D-7(D組)；血液樣品制備成血漿在-80 ℃環(huán)境中保存待測(cè)。圍產(chǎn)后期采用統(tǒng)一的全混合日糧(TMR)飼喂，TMR組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 奶牛圍產(chǎn)后期TMR組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels2)泌乳凈能 NEL/(MJ/kg)7.45粗蛋白質(zhì) CP19.10中性洗滌纖維 NDF26.20淀粉 Starch22.80鈣 Ca1.27磷 P0.62

1.2 血液樣品預(yù)處理

血液樣品解凍后渦旋混勻，取50 μL于EP管中，加300 μL純甲醇內(nèi)標(biāo)提取液；渦旋混勻，4 ℃ 12 396 ×g離心10 min，吸取200 μL上清液到新的EP管中，于-20 ℃靜置30 min后以12 396 ×g再離心3 min，取150 μL上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS檢測(cè)

超高液相色譜(UPLC)條件：色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸超純水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)；梯度洗脫0～10 min、95% A，10～11 min、10% A，11～14 min、95% A；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)條件：電噴霧離子源(ESI)設(shè)為溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓為5 500和-4 500 V，離子源氣體Ⅰ為55 psi、氣體Ⅱ?yàn)?0 psi，氣簾氣為25 psi。碰撞誘導(dǎo)電離設(shè)置為高，根據(jù)去簇電壓和碰撞能掃描檢測(cè)每個(gè)離子對(duì)。

質(zhì)控過(guò)程：按一定比例混合血樣提取液，制備質(zhì)控(QC)樣本，每10個(gè)檢測(cè)分析樣本中插入1個(gè)質(zhì)控樣本，監(jiān)測(cè)分析樣本在相同處理方法下的重復(fù)性；并通過(guò)對(duì)不同QC樣本質(zhì)譜檢測(cè)分析的總離子流圖進(jìn)行重疊展示分析，判斷代謝物提取和檢測(cè)的重復(fù)性。

1.4 血液代謝組學(xué)分析

獲得的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 2019，生成包含樣品編號(hào)、代謝物名稱和代謝物峰值的數(shù)據(jù)矩陣。將上述處理過(guò)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為csv格式導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0軟件(https://www.metaboanalyst.ca/)，進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，PCA用于觀察組內(nèi)變異情況和組間分離趨勢(shì)，OPLS-DA用于篩選確定組間差異代謝物。采用Simca 14.1軟件進(jìn)行模型驗(yàn)證，將原始分類的Y矩陣、模擬200次不同排列的Y矩陣與R2Y、Q2Y進(jìn)行線性回歸，得到的回歸直線與y軸的截距值分別為R2和Q2，用來(lái)衡量模型是否過(guò)擬合。根據(jù)OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值，選取VIP≥1的代謝物，同時(shí)結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)(fold change,FC)值，進(jìn)一步篩選FC≥2或FC≤0.5且P<0.05的代謝物，視為最終的血液差異代謝物。將最終篩選出的血液差異代謝物聚類分析，繪制熱圖，考察差異代謝的可靠性。結(jié)合京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)、人類代謝數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)構(gòu)建差異代謝物相關(guān)通路。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛圍產(chǎn)后期血液代謝輪廓變化規(guī)律

從奶牛血液中共鑒定出532種代謝物，其中包含脂質(zhì)168種，氨基酸及其代謝物98種，有機(jī)酸及其衍生物78種，核苷酸及其代謝物39種，碳水化合物及其代謝物32種，苯及其衍生物23種，雜環(huán)化合物21種，醇、胺類17種，膽汁酸17種，輔酶和維生素14種，激素及激素相關(guān)物質(zhì)9種和其他16種。QC樣本質(zhì)譜檢測(cè)顯示，代謝物檢測(cè)總離子流的曲線重疊性高，表明質(zhì)譜對(duì)同一樣品不同時(shí)間檢測(cè)時(shí)，信號(hào)穩(wěn)定性較好，結(jié)果可靠。

采用PCA法考察奶牛產(chǎn)后0、7、14和21 d血液代謝輪廓的變化。首先，對(duì)0 d與7 d、7 d與14 d、14 d與21 d血液代謝輪廓分別進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝輪廓存在明顯差異(圖1-a)；7 d與14 d血液代謝輪廓雖有一定差異，但大部分已重合(圖1-b)；14 d與21 d血液代謝輪廓已完全重合(圖1-c)。其次，對(duì)0、7、14和21 d血液代謝輪廓一起進(jìn)行比較，也得到了相似的變化趨勢(shì)(圖1-d)。這說(shuō)明奶牛在產(chǎn)后0～7 d代謝狀態(tài)和代謝物水平發(fā)生了顯著變化，之后基本趨于穩(wěn)定。

圖1 奶牛圍產(chǎn)后期血液代謝物PCA 2D散點(diǎn)圖

2.2 奶牛圍產(chǎn)后期血液差異代謝物的篩選及通路分析

采用OPLS-DA考察導(dǎo)致產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝輪廓差異的相關(guān)代謝物。由圖2-a可見，構(gòu)建OPLS-DA模型能夠?qū)a(chǎn)后0 d與7 d血液樣本明顯區(qū)分開。OPLS-DA模型驗(yàn)證圖(圖2-b)顯示，隨著相關(guān)系數(shù)降低(置換保留度降低)，Q2和R2逐漸降低，Q2回歸曲線與縱坐標(biāo)軸相交于0點(diǎn)以下且R2≤1，說(shuō)明構(gòu)建的模型置換檢驗(yàn)過(guò)關(guān)，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象，可用于差異代謝物的篩選。從該模型中選取VIP≥1的代謝物，通過(guò)單變量方差分析的P值(P<0.05)和FC值(FC≥2或FC≤0.5)篩選出了72個(gè)差異代謝物，19個(gè)差異代謝物在產(chǎn)后7 d顯著升高(VIP≥1，P<0.05，F(xiàn)C≥2)，見表2和圖3；53個(gè)差異代謝物在產(chǎn)后7 d顯著降低(VIP≥1，P<0.05，F(xiàn)C≤0.5)，見表3和圖3。

圖2 奶牛產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝物OPLS-DA得分圖(a)和驗(yàn)證圖(b)

圖中每一個(gè)點(diǎn)表示一種代謝物，藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)的差異代謝物(P<0.05)，紅點(diǎn)代表上調(diào)的差異代謝物(P<0.05)，灰色的點(diǎn)則代表差異不顯著的代謝物(P>0.05)。

表2 奶牛產(chǎn)后7 d表達(dá)上調(diào)的血液代謝物及其相關(guān)參數(shù)

表3 奶牛產(chǎn)后7 d表達(dá)下調(diào)的血液代謝物及其相關(guān)參數(shù)

續(xù)表3差異代謝物Differential metabolites平均峰值A(chǔ)verage peak value7 d0 d差異倍數(shù)FC變量重要性投影VIPP值P-value差異代謝物Differential metabolites平均峰值A(chǔ)verage peak value7 d0 d差異倍數(shù)FC變量重要性投影VIPP值P-value檸檬酸 Citric acid3.77×1061.17×1070.241.132.97×10-2腎上腺素 Epinephrine8.27×1041.21×1050.501.705.95×10-6己六醇 Dulcitol1.00×1041.77×1040.421.303.96×10-3皮質(zhì)醇 Cortisol3.20×1043.32×1050.071.696.88×10-6D-山梨糖醇 D-sorbitol5.56×1031.58×1040.271.611.37×10-42-甲基鳥苷 2-methylguanosine1.23×1061.98×1060.481.531.52×10-3D-葡萄糖 D-glucose1.27×1053.52×1050.261.751.31×10-67-甲基鳥苷 7-methylguanosine1.23×1061.98×1060.481.531.52×10-3蘇糖醇 Threitol7.94×1032.63×1040.221.759.31×10-7磷酸肌酸鈉 Creatine phosphate1.21×1061.93×1060.461.794.92×10-8sn-甘油-3-磷酸膽堿sn-glycero-3-phosphocholine1.07×1052.52×1050.281.209.60×10-35-甲基尿苷 5-methyluridine1.36×1052.30×1050.431.324.43×10-3黃嘌呤核苷 Xanthosine3.43×1041.28×1050.171.277.55×10-35-L-谷氨酰-L-丙氨酸 5-L-glutamyl-L-alanine2.25×1043.50×1040.501.123.51×10-2N-乙酰神經(jīng)氨酸 N-acetylneuraminic acid4.62×1047.30×1040.471.348.88×10-3N-乳酰基苯丙氨酸 N-lactoyl-phenylalanine2.85×1049.10×1040.231.703.03×10-6N-乙?；拾彼?N-acetylglycine3.84×1075.80×1070.471.495.40×10-4L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸 L-Phe-L-Phe6.91×1032.82×1040.181.269.99×10-3蛋氨酸亞砜 Methionine sulfoxide1.03×1061.75×1060.431.785.74×10-8高精氨酸 Homoarginine6.98×1042.97×1050.171.671.25×10-5半胱氨酰甘氨酸 Cys-Gly3.44×1047.97×1040.321.281.30×10-2還原型谷胱甘肽 Reduced glutathione2.20×1045.25×1040.301.613.07×10-5L-半胱氨酸 L-cysteine1.21×1043.51×1040.261.301.13×10-211-順視黃醇 11-cis-retinol2.78×1045.14×1040.401.407.86×10-4D-甘露醇 D-mannitol3.10×1044.06×1050.051.431.01×10-3

將72個(gè)差異代謝物進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果顯示這些差異代謝物能明顯將產(chǎn)后0 d與7 d血液樣品進(jìn)行區(qū)分(圖4)，說(shuō)明篩選出的差異代謝物能真實(shí)反映產(chǎn)后0 d與7 d血液代謝輪廓情況。通路分析結(jié)果顯示，差異代謝物主要涉及能量代謝、脂代謝、膽汁酸代謝、激素代謝和氧化應(yīng)激等通路(圖5)。與能量代謝相關(guān)代謝物為丙酮酸、L-乳酸、D-葡萄糖和甜菜堿，與脂代謝相關(guān)代謝物有肉堿C11∶DC、肉堿C12∶1、肉堿C13∶0等和氧化三甲胺(TMAO)，與氧化應(yīng)激相關(guān)的代謝物有還原型谷胱甘肽和L-半胱氨酸，激素類物質(zhì)包括腎上腺素和皮質(zhì)醇，與膽汁酸代謝相關(guān)代謝物有甘氨膽酸、甘氨脫氧膽酸、23-脫甲脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸。相關(guān)代謝物在產(chǎn)后0、7、14和21 d血液相對(duì)濃度變化趨勢(shì)見圖6。

圖4 奶牛產(chǎn)后0 d與7 d血液中72個(gè)差異代謝物聚類熱圖

Enteral：腸內(nèi)；TMAO：氧化三甲胺 trimethylamine oxide；POPC：磷脂酰膽堿 phosphatidylcholine；Choline：膽堿；Bacteria：細(xì)菌；TMA：三甲胺 trimethylamine；L-carnitine：L-肉堿；Betaine：甜菜堿；CA：檸檬酸 citric acid；DCA：脫氧膽酸 deoxycholic acid；Blood：血液；COR：皮質(zhì)醇 cortisol；AD：腎上腺素 epinephrine；Hepatocytes：肝細(xì)胞；FMOs：黃素單氧酶 flavin monoxygenases；AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶 adenosine monophosphate activated protein kinase；ME：甲基 methyl；PR：蛋白質(zhì) protein；GSH：谷胱甘肽 glutathione；GS：谷胱甘肽合成酶 glutathione synthetase；GCL：谷氨酸半胱氨酸連接酶 glutamate-cysteine ligase；L-cysteine：L-半胱氨酸；Glu：葡萄糖 glucose；G6P：葡萄糖-6-磷酸 glucose-6-phosphate；F6P：果糖-6-磷酸 fructose-6-phosphate；TP：磷酸丙糖 triose phosphate；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸 phosphoenolpyruvic acid；Pyr：丙酮酸 pyruvic acid；Acetyl-CoA：乙酰輔酶A acetyl coenzyme A；TC：總膽固醇 total cholesterol；CYP8B1：甾醇12α-羥化酶 sterol 12α-hydroxylase；CYP7A1：膽固醇7α-羥化酶 cholesterol 7α-hydroxylase；CYP7B1：25-羥基膽固醇7α-羥化酶 25-hydroxycholesterol 7α-hydroxylase；CYP27A1：甾醇27α-羥化酶 sterol 27α-hydroxylase；Gly：甘氨酸 glycine；CDCA：鵝脫氧膽酸 chenodesoxycholic acid；GC：甘氨膽酸 glycocholic acid；GCDCA：甘氨鵝脫氧膽酸 glycochenodeoxycholic acid；GDCA：甘氨脫氧膽酸 glycine deoxycholic acid；OAA：草酰乙酸 oxaloacetic acid；TCA：三羧酸循環(huán) tricarboxylic acid cycle；HL：乳酸 lactic acid；TG：甘油三酯 triglyceride；GI：甘油 glycerin；LCFA：長(zhǎng)鏈脂肪酸 long-chain fatty acid；CoA：輔酶A coenzyme A；Lcco As：長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A long-chain fatty acyl CoA；Mcco As：中鏈脂酰輔酶A mid-chain fatty acyl CoA；Scco As：短鏈脂酰輔酶A short-chain fatty acyl CoA；CPT1：肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1 carnitine palmitoyl transferase 1；CPT2：肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2 carnitine palmitoyl transferase 2；CACT：肉毒堿/?；舛緣A轉(zhuǎn)移酶 carnitine/acylcarnitine transferase；L-chain acyl carnitine：長(zhǎng)鏈?；鈮A long-chain acyl carnitine；M-chain acyl carnitine：中鏈?；鈮A mid-chain acyl carnitine；Carnitine acyltransferase：肉堿?；D(zhuǎn)移酶；Mitochondria：線粒體。

a：丙酮酸 pyruvic acid；b：L-乳酸 L-lactic acid；c：D-葡萄糖 D-glucose；d：甜菜堿 betaine；e：肉堿C11∶DC carnitine C11∶DC；f：肉堿C12∶1 carnitine C12∶1；g：肉堿C17∶1∶DC carnitine C17∶1∶DC；h：肉堿C14-OH carnitine C14-OH；i：肉堿C14∶1 carnitine C14∶1；j：肉堿C13∶1 carnitine C13∶1；k：肉堿C13∶0 carnitine C13∶1；l：還原型谷胱甘肽 reduced glutathione；m：氧化三甲胺 TMAO；n：L-半胱氨酸 L-cysteine；o：腎上腺素 epinephrine；p：皮質(zhì)醇 cortisol；q：甘氨膽酸 glycocholic acid；r：甘氨脫氧膽酸 glycine deoxycholic acid；s：23-脫甲脫氧膽酸 23-deoxydeoxycholic acid；t：甘氨鵝脫氧膽酸 glycochenodeoxycholic acid。

3 討 論

3.1 奶牛圍產(chǎn)后期能量代謝動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

大部分奶牛(尤其是高產(chǎn)奶牛)無(wú)法短期內(nèi)攝入足量干物質(zhì)以滿足分娩過(guò)程和產(chǎn)后泌乳啟動(dòng)對(duì)能量的需求[8]，使其處于能量代謝負(fù)平衡(NEB)的應(yīng)激狀態(tài)[9]。葡萄糖是主要供能物質(zhì)，奶牛泌乳時(shí)機(jī)體內(nèi)需要?jiǎng)訂T大量的葡萄糖合成乳糖[10]。葡萄糖首先被氧化為丙酮酸，后者不僅可以通過(guò)有氧氧化途徑進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)產(chǎn)生檸檬酸，還可以通過(guò)無(wú)氧糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸。Zhang等[11]報(bào)道，血清中乳酸的主要來(lái)源是糖酵解，其特征是丙酮酸通過(guò)乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為乳酸。另有研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿是一種內(nèi)源性的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活劑，通過(guò)肝激酶B1(LKB1，AMPK上游主要的激酶)去磷酸化激活A(yù)MPK，在細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用，是脂代謝和糖代謝的主要調(diào)控因子，能夠促進(jìn)ATP的積累[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后7 d血漿葡萄糖、丙酮酸、檸檬酸、乳酸和甜菜堿含量較產(chǎn)后0 d顯著下調(diào)，而產(chǎn)后7、14和21 d之間，上述代謝物含量無(wú)顯著差異。這表明奶牛在圍產(chǎn)后期受泌乳啟動(dòng)的影響，能量需要激增，機(jī)體處于較分娩時(shí)更嚴(yán)重的NEB應(yīng)激狀態(tài)。

3.2 奶牛圍產(chǎn)后期?；鈮A(ACC)變化規(guī)律

目前關(guān)于ACC與動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康需求之間的關(guān)系還需深入研究[13]。奶牛從妊娠過(guò)度到哺乳期時(shí)，將脂肪酸完全氧化為二氧化碳(CO2)的能力降低，而不完全氧化為酸溶性代謝物的能力升高[14]。動(dòng)物體內(nèi)肉堿分為游離肉堿和ACC，主要分布在對(duì)能量需求較高的組織中，是參與細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵物質(zhì)[15]。游離肉堿又稱左旋肉堿，是長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體所必須的載體，β-氧化的關(guān)鍵步驟是形成ACC，在脂肪酸氧化代謝中起重要作用[16]。大多數(shù)高產(chǎn)奶牛在圍產(chǎn)期都會(huì)經(jīng)歷NEB過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致不同組織出現(xiàn)代謝紊亂，尤其是脂肪組織。位于細(xì)胞質(zhì)的長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶(ACSL)將脂肪酸轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈脂?；o酶A，然后在肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1a(CPT-1a)的催化作用下，長(zhǎng)鏈脂酰基輔酶A與游離肉堿發(fā)生酯交換反應(yīng)生成ACC[17]。ACC先后通過(guò)線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)和線粒體內(nèi)膜的肉毒堿/?；舛緣A轉(zhuǎn)移酶(CACT)進(jìn)入線粒體基質(zhì)，參與脂肪酸的β-氧化[18]。ACC的積累不僅反映了脂肪酸氧化能力的降低，也反映了脂肪酸向甘油三酯合成和胰島素拮抗的脂質(zhì)介質(zhì)的分配[19]。ACC代謝也與非酒精性脂肪肝(FLD)發(fā)展有關(guān)，F(xiàn)LD患者肝?；鈮A含量升高。有研究認(rèn)為，肝臟ACC的積累可通過(guò)有機(jī)陽(yáng)離子/肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2機(jī)制促進(jìn)其在循環(huán)中的積累[20]。如Rico等[21]發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)后動(dòng)員更多脂肪酸的奶牛血漿肉堿C14∶0、肉堿C16∶0、肉堿C18∶0和肉堿C20∶0含量升高，同時(shí)血漿總ACC水平與循環(huán)總FA濃度以及神經(jīng)酰胺呈正相關(guān)[13]。未被氧化的肝臟FA可以作為甘油三酯酯化反應(yīng)的底物或用于合成神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺能拮抗胰島素刺激的葡萄糖的攝取[21]。本研究結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后7～21 d血漿ACC(包括中鏈和長(zhǎng)鏈酰基肉堿)含量較產(chǎn)后0 d顯著下降，說(shuō)明奶牛產(chǎn)后脂肪酸氧化能力較分娩前有一定程度的恢復(fù)。

3.3 奶牛圍產(chǎn)后期TMAO變化規(guī)律

TMAO是一種腸源性菌群代謝產(chǎn)物，由肝臟中的黃素單氧酶(FMOs)氧化三甲胺(TMA)生成。腸道中部分菌群將直接攝入或間接產(chǎn)生的膽堿、磷脂酰膽堿、甜菜堿和游離肉堿分別通過(guò)膽堿-TMA裂解酶(CutC)、甘氨酸甜菜堿還原酶(GrdH)和肉堿加氧酶(CntA)轉(zhuǎn)化為TMA，后者經(jīng)肝門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟氧化生成TMAO[22]。Makrecka-Kuka等[23]報(bào)道，TMAO可減少心臟線粒體中丙酮酸和脂肪酸氧化，通過(guò)減少丙酮酸脫氫酶(PDH)底物通量，并抑制β-氧化，從而導(dǎo)致心臟細(xì)胞能量產(chǎn)生不足。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TMAO還與脂肪肝的形成有關(guān)，TMAO通過(guò)改變膽汁酸的合成和運(yùn)輸或阻斷肝臟胰島素信號(hào)通路，從而影響脂代謝、肝臟甘油三酯含量和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪肝的形成[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后7 d血清TMAO含量較產(chǎn)后0 d顯著上調(diào)，而與TMAO生成相關(guān)的代謝物，除了?；鈮A外，還有甜菜堿和磷酸膽堿的含量也顯著下調(diào)，而產(chǎn)后7、14和21 d之間上述代謝物含量無(wú)顯著差異。這提示血清TMAO極可能是奶牛圍產(chǎn)期后期NEB發(fā)展和脂肪肝形成的潛在生物標(biāo)志物，但還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.4 奶牛圍產(chǎn)后期氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物變化規(guī)律

飽和脂肪酸使線粒體超負(fù)荷工作導(dǎo)致氧化還原反應(yīng)穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致大量活性氧(ROS)自由基生成，最終引起氧化應(yīng)激。ROS的持續(xù)產(chǎn)生會(huì)激活絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制胰島素誘導(dǎo)的受體底物的感應(yīng)[25]。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激與非反芻動(dòng)物胰島素抵抗和FLD發(fā)展存在一定聯(lián)系，胰島素抵抗可以增加肝臟內(nèi)脂質(zhì)含量，并促進(jìn)單純性脂肪變性。氧化應(yīng)激也可促進(jìn)Kupffer細(xì)胞活化，激活氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，包括核因子-κB，并上調(diào)促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，進(jìn)一步降低抗氧化能力并促進(jìn)肝細(xì)胞損傷[13]。Videla等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大量ROS可引起肝臟脂肪酸去飽和作用降低和過(guò)氧化增強(qiáng)，使n-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸耗竭。多不飽和脂肪酸氧化形成具有多種炎癥功能的氧化脂質(zhì)。如由n-6花生四烯酸和亞油酸衍生的氧化脂質(zhì)羥基十八烷二烯酸和羥基二十烷四烯酸具有促炎作用。圍產(chǎn)期奶牛大多數(shù)經(jīng)歷氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激又會(huì)增強(qiáng)脂解作用，生成的不飽和脂肪酸既可以氧化為過(guò)氧化氫和異前列腺素[27]，又可生成β-羥基丁酸鹽，這可引起ROS介導(dǎo)的p38絲裂原活化蛋白激酶活化，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡[28]。另外，脂肪酸可能通過(guò)ROS依賴的炎癥機(jī)制誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)核因子-κB，參與了FLD的病理變化。大量研究還表明，ROS或氧化脂質(zhì)的積累可能會(huì)影響牛的免疫反應(yīng)[13]。還原性谷胱甘肽(GSH)是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除物，不僅參與緩解機(jī)體氧化應(yīng)激，還能夠促進(jìn)膽汁酸代謝和腸道消化吸收，增強(qiáng)肝臟脂肪代謝[29]。半胱氨酸是GSH的前體物，半胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)作用下先轉(zhuǎn)變成γ-谷氨酰胺半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶(GS)作用下轉(zhuǎn)化為GSH，參與緩解奶牛圍產(chǎn)期氧化應(yīng)激[30]。Li等[30]報(bào)道，甜菜堿除了能調(diào)節(jié)糖脂代謝外，還通過(guò)調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生，保護(hù)牛乳腺上皮細(xì)胞免受熱暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡，可用于緩解奶牛熱應(yīng)激和提高產(chǎn)奶量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后7 d較0 d血漿GSH、L-半胱氨酸和甜菜堿的含量顯著下降，而產(chǎn)后7、14和21 d這些代謝物含量均無(wú)顯著差異，這提示健康奶牛圍產(chǎn)后期抗氧化能力較產(chǎn)前下降。

3.5 奶牛圍產(chǎn)后期皮質(zhì)醇和腎上腺素的變化規(guī)律

已有研究證實(shí)，奶牛分娩時(shí)皮質(zhì)醇、腎上腺素、去甲腎上腺素、催產(chǎn)素、加壓素和內(nèi)啡肽等激素的分泌水平會(huì)發(fā)生不同程度改變[31-32]。本研究采用UPLC-MS/MS代謝組學(xué)方法僅檢測(cè)到了血漿中含有皮質(zhì)醇和腎上腺素2種激素，結(jié)果顯示奶牛產(chǎn)后0 d血漿皮質(zhì)醇和腎上腺素含量顯著高于產(chǎn)后7、14和21 d，而兩者在7、14和21 d之間差異不顯著。皮質(zhì)醇主要功能是通過(guò)增強(qiáng)氨基酸糖異生的方式提高血糖濃度，尤其支持對(duì)葡萄糖需求高的生理活動(dòng)例如生產(chǎn)和泌乳早期[33]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇還是與子宮炎、低鈣血癥和乳腺炎相關(guān)的應(yīng)激和疼痛的一個(gè)既定的指標(biāo)[34]。Sgorlon等[34]報(bào)道，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重應(yīng)激時(shí)血液中皮質(zhì)醇含量顯著增加。Vannucchi等[35]報(bào)道，奶牛在分娩后出現(xiàn)高血糖且與血液皮質(zhì)醇含量呈正相關(guān)。由于劇烈疼痛以及胎兒和母體之間的相互作用，引起奶牛分娩時(shí)血漿中腎上腺素含量上升[36]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期奶牛NEB程度與哺乳早期腦垂體活動(dòng)和腎上腺皮質(zhì)反應(yīng)性之間存在關(guān)聯(lián)[37]。因此，奶牛產(chǎn)后0 d高血漿皮質(zhì)醇和腎上腺素含量可能是圍產(chǎn)前期代謝應(yīng)激、分娩應(yīng)激和疼痛的綜合作用結(jié)果。

3.6 奶牛圍產(chǎn)后期膽汁酸代謝變化規(guī)律

膽汁酸在肝臟中產(chǎn)生，其在膽汁酸穩(wěn)態(tài)、營(yíng)養(yǎng)吸收和膽固醇穩(wěn)態(tài)等代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[38]。肝臟中生成的膽汁酸，首先進(jìn)入腸道參與消化吸收，后經(jīng)腸道重吸收，大約95%的膽汁酸經(jīng)門靜脈返回肝臟，僅有少部分進(jìn)入血液循環(huán)[39]。另外，膽汁酸還可以通過(guò)激活法尼醇X受體(FXR)和G蛋白偶聯(lián)的膽汁酸受體1(GPBAR1/TGR5)來(lái)充當(dāng)信號(hào)分子。初級(jí)膽汁酸通過(guò)經(jīng)典(中性)和替代(酸性)2種途徑合成[40]。其中，經(jīng)典途徑占膽汁酸總合成的75%，肝臟中膽固醇在膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)作用下轉(zhuǎn)化為7α-羥膽固醇，隨后被甾醇12α-羥化酶(CYP8B1)氧化裂解為膽酸[41]。在替代途徑中膽固醇在甾醇27α-羥化酶(CYP27A1)的催化下生成27α-羥基膽固醇，隨后在25-羥基膽固醇7α-羥化酶(CYP7B1)作用下生成鵝脫氧膽酸[42]。游離膽汁酸包括膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸4種，這些結(jié)合膽汁酸可進(jìn)一步與甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合生成次級(jí)膽汁酸包括甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸和?；悄懰岬?。Li等[43]研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸在控制腸肝系統(tǒng)中葡萄糖和脂質(zhì)的代謝以及外周組織的能量消耗方面也起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。Mazalli等[46]報(bào)道，奶牛泌乳啟動(dòng)后，肝臟中與膽汁酸合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量升高。本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù)也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，即奶牛產(chǎn)后7 d血漿中與膽汁酸代謝相關(guān)的物質(zhì)甘氨膽酸、甘氨脫氧膽酸、23-脫甲脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸含量顯著高于產(chǎn)后0 d，而產(chǎn)后7、14和21 d之間這些代謝物含量無(wú)顯著差異，推測(cè)這可能與奶牛分娩后泌乳啟動(dòng)、采食量和消化吸收逐漸恢復(fù)有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù)研究了奶牛產(chǎn)后0、7、14和21 d血液代謝物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，結(jié)果表明產(chǎn)后7 d內(nèi)代謝輪廓發(fā)生了明顯改變，圍產(chǎn)后期奶牛處于代謝應(yīng)激和氧化應(yīng)激狀態(tài)。