吳志毅，曹克璠，陳海軍，劉嘉偉，劉 鑫，單玉梅，包立高，王明玖

(1.包頭市生態(tài)環(huán)境局綜合保障中心/包頭市生態(tài)環(huán)境監(jiān)控監(jiān)測中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.草地資源教育部重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室/內(nèi)蒙古自治區(qū)草地管理與利用重點實驗室/內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 草原與資源環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011；3.內(nèi)蒙古科學技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070；4.包頭市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；6.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

1 引言

土壤鹽堿化是一個全球性問題。據(jù)統(tǒng)計，全球的鹽堿地以每年約10×105hm2的速度增長[1]，20%的耕地受到不同程度的影響。鹽堿地會抑制作物的生長，因此，提升作物的耐鹽性并研究其機理是提高作物生長發(fā)育的關(guān)鍵[2,3]。鹽脅迫是對植物生長發(fā)育中重要的非生物脅迫因子，抑制植物種子萌發(fā)[4]。植物受到鹽脅迫時，外部形態(tài)和內(nèi)部生理均會發(fā)生不良的變化，植株生長會減慢，生物產(chǎn)量會降低，嚴重影響著植物生產(chǎn)[5]。

水楊酸(salicylic acid，SA)，化學名為鄰羥基苯甲酸，在植物體內(nèi)普遍存在的、易溶于有機溶劑的小分子酚類化合物，是一種非生物逆境反應得信號分子[6,7]，可調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、增加植物抗病性，調(diào)節(jié)氣孔運動、誘導花熟。

高加索三葉草(Trifoliumambiguum)，為豆科多年生根蘗型長壽命牧草，根系發(fā)達且入土深，在寒、旱的條件下能表現(xiàn)出較強的農(nóng)藝潛力[8]；白三葉(T.repens)是世界上最重要的多年生豆科牧草之一，固氮能力較好，但其耐寒性和耐旱性較差[9]；為了獲得兼具二者優(yōu)良性狀的三葉草品種，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學牧草育種團隊利用高加索三葉草和白三葉雜交并通過胚拯救培養(yǎng)技術(shù)獲得二者的雜交后代，研究發(fā)現(xiàn)雜交后代品系仍具備較強的抗逆性、但無法自發(fā)的結(jié)瘤固氮；紅三葉(Trifoliumpretense)又叫紅車軸草，多年生草本，是車軸草屬的最重要物種之一[10]。

進入21世紀以來，眾多學者開始研究水楊酸對植物逆境下的影響和作用機理，并得出相應結(jié)論。SA在植物逆境反應中起到關(guān)鍵性作用，不僅能減少高溫帶來的氧化脅迫的危害，而且可以顯著改善植物的耐鹽性[11，12]；Pancheva等[13]研究水楊酸對小麥的影響時發(fā)現(xiàn)，水楊酸處理后的小麥，光合系統(tǒng)捕獲光能的效率增加，葉黃素與類胡蘿卜素含量均有所提升，去環(huán)氧化能力增強；馬廣民等[14]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸處理的西瓜幼苗，受到鹽害時體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大幅增加，SA濃度為0.01、0.05 mM處理顯著提高了西瓜幼苗的株高、莖粗及葉面積；唐艷萍等[19]研究表明，用水楊酸濃度為0 mM、0.1 mM、0.5 mM和0.9 mM 浸泡處理大豆幼苗根系，水楊酸對水分脅迫下的大豆幼苗保持較高的光合速率，促進相關(guān)抗水分脅迫基因的表達。王玉萍[15]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，用1.0 mmol/L的SA處理花椰菜種子后，顯著提高了其耐鹽性。閆艷華[7]發(fā)現(xiàn)0.05 mmol/L的SA浸種后，減輕了鹽脅迫對燕麥的傷害，促進了其種子的萌發(fā)和幼苗的生長。

本研究從使用生物措施提高植物鹽害抗性出發(fā)，通過紙上發(fā)芽床的試驗方法，用不同濃度的水楊酸對高加索三葉草雜交后代種子進行浸種，探究其在鹽脅迫下萌發(fā)的影響，初步探索水楊酸對高加索三葉草雜交后代耐鹽性的互作關(guān)系，為以后水楊酸對高加索三葉草耐鹽性的研究提供有價值的參考。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

供試材料為白三葉、紅三葉和高加索三葉草以及高加索三葉草與白三葉雜交后代的成熟種子，以NaCl處理為一級處理，SA浸種為二級處理，以蒸餾水浸種為對照(CK)，共設置18個處理，每個處理重復3次，具體處理組合如表1所示。

表1 處理方案

2.2 試驗方法

試驗采用紙上發(fā)芽床法，由于車軸草屬植物的種子硬實率高，種子在發(fā)芽實驗前先用砂紙對種皮進行打磨。種子用水選法，去除水面漂浮的雜質(zhì)以及不飽滿的種子。將種子浸于0.1% HgCl2溶液中消毒10 min后，用蒸餾水洗滌3～4次。將種子浸泡于6個水楊酸(SA)濃度溶液中處理24 h后，蒸餾水漂洗3～4次，再用濾紙擦拭種子，吸干表面的水分。將兩層濾紙鋪放于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿(已消毒)中，倒入鹽溶液使濾紙吸水到飽和狀態(tài)，以培養(yǎng)皿傾斜45°無明水為準。然后挑選均勻一致、無破損的50粒種子整齊擺放在培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿加入等量的處理鹽溶液。每個處理重復3次。將所有種子都放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱(培養(yǎng)箱用75%的乙醇進行消毒)中培養(yǎng)7 d。每間隔24 h觀察一次種子萌發(fā)的狀況，記錄種子萌發(fā)個數(shù)，以肉眼能夠觀察到白色幼根判斷是否萌發(fā)。種子萌發(fā)過程中保持濾紙飽和，每3 d更換1次濾紙。培養(yǎng)第7 d時選取10株幼苗測量的根長、芽長及重量，并計算萌發(fā)指標。

2.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理、萌發(fā)指標的計算以及灰色關(guān)聯(lián)度的計算，釆用SPSS 20.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan方法多重比較，顯著水平設置為0.05，并用Origin 2018軟件作圖。

統(tǒng)計計算公式：

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽初期(指定日期內(nèi))正常發(fā)芽種子數(shù)/供檢驗種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽末期(指定日期內(nèi))正常發(fā)芽種子數(shù)/供檢驗種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=Σ(Gt/Dt)。Gt為第t天種子發(fā)芽數(shù)；Dt為對應的種子發(fā)芽的天數(shù)。

活力指數(shù)=生物學產(chǎn)量(植株的全部干重)×發(fā)芽指數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 SA對鹽脅迫下白三葉萌發(fā)的影響

鹽脅迫影響種子發(fā)芽率，相同水楊酸濃度下，鹽濃度增加發(fā)芽率則降低。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，SA為0.1 mM時發(fā)芽率與對照無差異(P>0.05)，SA為0.4 mM的發(fā)芽率63.33%為最低，顯著低于對照(P<0.05)。鹽濃度為50 mM，0.2 mM SA發(fā)芽率最低，SA為0.4 mM時發(fā)芽率24.11%為最高，與對照和0 mM差異顯著(P<0.05)。鹽濃度為100 mM時，0.1 mM SA發(fā)芽率23.22%為最高，SA濃度增大發(fā)芽率下降。

鹽脅迫降低種子的發(fā)芽勢。相同水楊酸濃度下，鹽濃度升高發(fā)芽勢降低。在相同鹽處理下，鹽濃度為0mM時，SA為0.1 mM發(fā)芽勢最低為52%，與對照顯著差異(P<0.05)；鹽濃度為50 mM時，SA為0.4 mM發(fā)芽勢最高為24.67%，差異不明顯(P>0.05)。鹽濃度為100 mM時，水楊酸濃度增加發(fā)芽勢下降，SA為0.1 mM發(fā)芽勢最高。

相同水楊酸濃度下，鹽脅迫使發(fā)芽指數(shù)降低。在同一鹽處理水平下。鹽濃度為50 mM時，SA為0.3 mM發(fā)芽指數(shù)最高13.59。鹽濃度為100 mM時僅SA為0.3 mM發(fā)芽指數(shù)無顯著差異，其它濃度有顯著差異(P<0.05)。

相同水楊酸濃度下，鹽脅迫使活力指數(shù)降低，與對照有顯著差異(P<0.05)。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，SA為0.2 mM的活力指數(shù)顯著高于對照(P<0.05)。當鹽濃度為50 mM，SA為0.3 mM時的活力指數(shù)顯著高于對照(P<0.05)，此時的活力指數(shù)最高。當鹽濃度為100 mM，SA為0.3 mM時的活力指數(shù)最高。

鹽脅迫下根、芽生長均受到阻礙，在相同水楊酸濃度下，根與芽的長度顯著低于對照(P<0.05)。相同鹽處理下，SA為0.4 mM時的根與芽的長度顯著長于對照(P<0.05)。

綜合以上結(jié)果，鹽脅迫抑制白三葉種子的萌發(fā)，適宜水楊酸濃度浸種對其有緩解作用，有效促進該品系種子的萌發(fā)力，但高濃度水楊酸會抑制種子萌發(fā)。SA 0.4 mM為最適宜濃度(圖1)。

圖中同一水楊酸處理水平下不同鹽濃度間差異不顯著(P>0.05)為相同大寫字母，同一鹽脅迫水平下不同水楊酸處理間差異不顯著(P>0.05)為相同小寫字母，下同。圖1白三葉萌發(fā)指標

3.2 SA對鹽脅迫下紅三葉萌發(fā)的影響

相同水楊酸濃度下，鹽濃度為50 mM發(fā)芽率最高，100 mM發(fā)芽率最低。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，SA為0.4 mM的發(fā)芽率25%為最低。鹽濃度為50 mM，除SA為0 mM、0.1 mM外，其余濃度有顯著差異(P<0.05)。鹽濃度為100 mM時，SA為0.1 mM時發(fā)芽率18.33%為最高。

相同水楊酸濃度下，除SA為0.4 mM的其它濃度，50 mM鹽處理發(fā)芽勢最高。在相同鹽處理下，鹽濃度為0mM時，SA為0.2 mM發(fā)芽勢最低為21.33%，0.5 mM發(fā)芽勢最高為55.33%，且差異顯著(P<0.05)。鹽濃度為50 mM時，SA為0.1 mM發(fā)芽勢最高82%，顯著高于對照和0 mM處理47.33%和74%。鹽濃度為100 mM時，SA為0.1 mM發(fā)芽勢最高。

相同水楊酸濃度下，鹽濃度為50 mM發(fā)芽指數(shù)最高，100 mM發(fā)芽指數(shù)最低。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，與對照相比SA 各濃度均顯著(P<0.05)。

相同水楊酸濃度下，除SA為0.4 mM的其它濃度，50 mM活力指數(shù)最高。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，SA 各濃度與對照相比差異顯著(P<0.05)，SA為0.4 mM時的活力指數(shù)最高。當鹽濃度為50 mM，SA 各濃度與對照相比差異顯著(P<0.05)，但與SA為0 mM差異不顯著(P>0.05)。當鹽濃度為100 mM，SA 各濃度與對照相比差異顯著(P<0.05)，但與SA為0 mM沒有顯著差異(P>0.05)。

鹽脅迫抑制根、芽的生長，在相同水楊酸濃度下，根和芽的長度隨著鹽濃度增加而變短，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。相同鹽處理下，SA較低濃度時的根、芽長度最長。

以上結(jié)果表明，低濃度鹽能促進紅三葉種子的萌發(fā)。適宜低濃度水楊酸濃度浸種，鹽脅迫下種子的萌發(fā)得到促進，高濃度則不利于種子萌發(fā)。SA 0.1 mM為鹽脅迫下萌發(fā)的最適宜濃度，0.3 mM對根與芽生長的促進作用最明顯(圖2)。

圖2 紅三葉萌發(fā)指標

3.3 SA對鹽脅迫下高加索三葉草萌發(fā)的影響

鹽脅迫使發(fā)芽率降低，相同水楊酸濃度下，鹽濃度為100 mM的發(fā)芽率顯著低于對照(P<0.05)。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，除SA為0.1 mM以外的其他濃度顯著低于對照58.11%(P<0.05)。鹽濃度為50 mM，SA為0.1 mM發(fā)芽率與對照相比差異不顯著(P>0.05)，其余濃度差異顯著(P<0.05)。鹽濃度為100 mM時，除SA為0.1 mM的其它濃度，隨SA濃度增大發(fā)芽率逐漸降低，與對照相比差異顯著(P<0.05)。

相同水楊酸濃度下，除SA為0.5 mM、僅有鹽濃度為100 mM發(fā)芽勢差異顯著(P<0.05)。在相同鹽處理下，鹽濃度為0mM時，SA為0.2 mM發(fā)芽勢最低為39.33%， 0.5 mM發(fā)芽勢最高為54%，與對照相比差異不顯著(P>0.05)。鹽濃度為50 mM時，與對照相比差異不顯著(P>0.05)。鹽濃度為100 mM時，SA為0.4 mM發(fā)芽勢最高，與對照相比差異顯著(P<0.05)。

鹽脅迫使發(fā)芽指數(shù)降低，相同水楊酸濃度下，發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)隨著鹽濃度增加而降低的趨勢。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，各水楊酸處理發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照21.12(P<0.05)。鹽濃度為50 mM時，SA為0.3 mM發(fā)芽指數(shù)最高為18.02，顯著高于對照11.45(P<0.05)。鹽濃度為100 mM時 SA為0.3 mM發(fā)芽指數(shù)9.58為最高，與對照相比差異顯著(P<0.05)，0.5 mM發(fā)芽指數(shù)9.58為最低，差異顯著(P<0.05)。

鹽脅迫使活力指數(shù)降低，相同水楊酸濃度下，活力指數(shù)呈現(xiàn)隨著鹽濃度增加而降低的趨勢。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，SA為0.05 mM的活力指數(shù)最低為0.5，差異顯著(P<0.05)。當鹽濃度為50 mM，差異不顯著(P>0.05)。當鹽濃度為100 mM，SA為0.3 mM時的活力指數(shù)最高，與對照相比差異顯著(P<0.05)。

鹽脅迫使根長、芽長均受到抑制，在相同水楊酸濃度下，根與芽的長度隨著鹽濃度增加而變短，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。在相同鹽處理下，0.3 mM、0.4 mM水楊酸處理促進鹽脅迫下的根長、芽長。

以上結(jié)果表明，鹽脅迫使高加索三葉草種子的萌發(fā)受到抑制。適宜低濃度水楊酸浸種可以提高鹽脅迫下高加索三葉草種子的萌發(fā)能力，高濃度的水楊酸會抑制種子萌發(fā)，0.3 mM SA為最適宜濃度(圖3)。

圖3 高加索三葉草萌發(fā)指標

3.4 SA對鹽脅迫下高加索三葉草與白三葉雜交后代萌發(fā)的影響

相同水楊酸處理下，SA為0.3 mM，鹽濃度為50 mM發(fā)芽率顯著高于0 mM鹽處理發(fā)芽率(P<0.05)，100 mM鹽處理顯著低于對照(P<0.05)。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，除SA為0.1 mM的發(fā)芽率的其他濃度，顯著低于對照(P<0.05)。鹽濃度為50 mM，發(fā)芽率隨SA濃度的增加降低。鹽濃度為100 mM時，SA為0.4 mM時發(fā)芽率最高。

相同水楊酸濃度下，SA為0.2和0.3mM，50 mM鹽處理下發(fā)芽勢最高，其它隨著鹽濃度的增加而降低。在相同鹽處理下，鹽濃度為0mM時，SA為0.2 mM發(fā)芽勢最低為36.67%，與對照相比差異顯著(P<0.05)。鹽濃度為50 mM時，SA為0.1 mM發(fā)芽勢最高54.67%。鹽濃度為100 mM時，SA為0.1 mM發(fā)芽勢最高，與對照相比差異顯著(P<0.05)。

相同水楊酸濃度下，除對照外鹽濃度為50 mM發(fā)芽指數(shù)最高，100 mM發(fā)芽率最低。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，SA為0.3 mM的發(fā)芽指數(shù)19.73為最高，與對照相比差異顯著(P<0.05)。鹽濃度為50 mM時，SA 各濃度與對照相比差異顯著(P<0.05)。鹽濃度為100 mM時，SA各濃度與對照相比差異顯著(P<0.05)。

相同水楊酸濃度下，除對照以外，50 mM活力指數(shù)最高。在相同鹽處理下，鹽濃度為0 mM時，SA為0.3 mM時的活力指數(shù)0.6為最高。當鹽濃度為50 mM，SA為0.2 mM活力指數(shù)0.68為最高。當鹽濃度為100 mM，SA 各濃度與對照比差異顯著(P<0.05)，但與SA為0 mM差異不顯著(P>0.05)。

鹽脅迫抑制該品系根長、芽長，在相同的濃度水楊酸下，鹽濃度增加使根與芽的長度越短，與對照組相比差異顯著。相同鹽處理下，SA較低濃度時根、芽長度最長。

結(jié)果表明，鹽濃度的增加使該品系的萌發(fā)能力逐漸減弱。低濃度鹽促進使高加索三葉草與白三葉雜交后代種子的萌發(fā)，高濃度阻礙萌發(fā)。50 mM鹽脅迫下，0.3 mM SA為最適宜濃度。100 mM鹽脅迫下，0.4 mM SA為最適宜濃度(圖4)。

圖4 高加索三葉草與白三葉雜交后代萌發(fā)指標

3.5 基于灰色關(guān)聯(lián)度的不同品系處理的分析

由于測定的單個指標無法準確判斷出最優(yōu)品系及處理組合，所以本文選用灰色關(guān)聯(lián)綜合測定的6個萌發(fā)指標對發(fā)芽狀況綜合評判，分別選出4種三葉草中最優(yōu)處理組合及最耐鹽品種。

將參試的4個品種共72個處理組合所測定的6個指標作為一個灰色關(guān)聯(lián)系統(tǒng)，求得每個處理組合6個指標的等權(quán)關(guān)聯(lián)度，最后根據(jù)等權(quán)關(guān)聯(lián)度的值評判最佳處理組合與品系。

由灰色系統(tǒng)內(nèi)的關(guān)聯(lián)系數(shù)計算得出不同品系不同處理各指標的等權(quán)關(guān)聯(lián)度，值越大則說明該品系的處理組合綜合效果越好。計算結(jié)果如表2所示。CK1關(guān)聯(lián)度最高為0.880，即不進行鹽脅迫與水楊酸處理時白三葉萌發(fā)最好，其次是H5和H4(僅用0.5 mM、0.4 mM SA處理的白三葉)。由表2可知L7關(guān)聯(lián)度為0.726，即紅三葉用50 mM NaCl、0.1 mM SA處理組合綜合表現(xiàn)最好。僅進行鹽脅迫和鹽脅迫與水楊酸共同處理時，紅三葉綜合表現(xiàn)最好。

表2 參試品系加權(quán)關(guān)聯(lián)度及排名

4 討論

鹽脅迫下植物生物量減少是一種普遍現(xiàn)象。有大量報告表明鹽脅迫對不同植物的生物量產(chǎn)生了不利影響[16]。在本次試驗中也得到了幾乎類似的結(jié)論。據(jù)報道，通過外源SA浸種可有效的增加鹽脅迫下植物的生物量[17]。在植物生命周期內(nèi)，外部環(huán)境和內(nèi)部生理生化共同影響著種子萌發(fā)以及幼苗的形態(tài)建成，鹽害對種子萌發(fā)階段不利影響極大。鹽脅迫會引起植物細胞滲透脅迫，種子吸水受阻，種子內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不能分解而釋放能量，胚得不到有效的養(yǎng)分供給，最終種子萌發(fā)受到抑制。

鹽脅迫下種子發(fā)芽率低的主要原因是滲透效應[18]。有研究表明，作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，SA可通過降低籽粒淀粉含量來克服鹽脅迫對水稻(OryzaSativaL.)種子萌發(fā)的抑制作用[19]，外源SA還能緩解鹽脅迫對孔雀草(TagetespatulaL.)種子萌發(fā)的影響[20]。趙春旭[21]研究外源水楊酸對高羊草耐鹽脅迫時發(fā)現(xiàn)，低濃度的水楊酸可減輕高羊草的鹽害，高濃度的水楊酸不能減輕鹽脅迫的危害；曹克璠等[22]以“蒙農(nóng)三葉草1號”為材料研究了不同濃度水楊酸浸種對其種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響，結(jié)果顯示，鹽脅迫下，低濃度的水楊酸(0.1，0.2，0.3 mM)浸種會抑制種子的萌發(fā)及幼苗生長；而高濃度的水楊酸(0.4，0.5 mM)浸種則可以緩解鹽處理對“蒙農(nóng)三葉草1號”的傷害。以上研究結(jié)果與本研究得到了相似的結(jié)果。

5 結(jié)論

以4個三葉草品種的種子為試驗材料，采取裂區(qū)試驗設計(鹽脅迫為主處理，水楊酸浸種為副處理)，探究了水楊酸對鹽脅迫下三葉草種子萌發(fā)的影響。得到了如下結(jié)果：

(1)鹽脅迫使高加索三葉草4個雜交后代種子的萌發(fā)能力下降，鹽濃度的越高，種子萌發(fā)狀況越差。

(2)適宜的低濃度水楊酸可促進鹽脅迫4個三葉草品種種子的萌發(fā)。鹽脅迫下，白三葉最適宜萌發(fā)的水楊酸濃度為0.1 mM，0.3 mM分別對根、芽的促進作用最明顯。紅三葉最適宜萌發(fā)的水楊酸濃度為0.4 mM；高加索三葉草最適宜SA濃度為0.3 mM；高加索三葉草與白三葉雜交后代最適宜SA濃度為0.3 mM 。

(3)基于灰色關(guān)聯(lián)度綜合分析評價了各處理組合的萌發(fā)狀況。種子在低濃度水楊酸和鹽脅迫的處理組合下綜合表現(xiàn)好，紅三葉耐鹽性綜合表現(xiàn)最好。