張慶琛，劉應(yīng)敏，朱曉琴，韓 霜，黃夢晴，裴冬麗

（1.商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院·河南省特色微生物資源開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心 河南商丘 476000；2.商丘師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 河南商丘 476000）

植物內(nèi)生細菌（Endophyte）是定殖在健康植物組織內(nèi)部，并與植物建立共生關(guān)系的一類微生物[1]。已有研究表明，植物內(nèi)生菌最早發(fā)現(xiàn)于禾本科植物，如牧草等，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)廣泛存在于至少80 個屬的290 多種禾本科植物中，重要的經(jīng)濟林木如針葉類（冷杉、云杉、紅杉、松、柏等）、闊葉類（櫟樹、樺樹、桉樹等）、灌木、草本植物以及栽培作物、果樹、藻類和蕨類植物[2]。大量有益的內(nèi)生菌在植物體內(nèi)能產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)（內(nèi)生共生固氮）、激素等物質(zhì)，參與植物的代謝過程，能夠促進植物生長和增強植物抗逆、抗病、抗蟲等能力[3]，這些特性引起了植物學(xué)家、植物生理學(xué)家、植物病理學(xué)家的高度關(guān)注。

薄荷（Mentha canadensis）為唇形科（Lamiaceae）薄荷屬（Mentha）多年生草本中藥材。薄荷中包含多類化合物如精油、多酚類、黃酮類等，被廣泛地應(yīng)用于抑菌[4-5]、抗病[6-7]、抗腫瘤[8]。截止到目前，薄荷內(nèi)生菌的研究主要是內(nèi)生細菌多樣性及組成分析[9-10]，內(nèi)生真菌篩選及多樣性分析[11-12]，有關(guān)薄荷內(nèi)生菌對植物促生、生物防治方面的研究鮮有報道。筆者從薄荷上分離并鑒定內(nèi)生細菌，分析內(nèi)生菌對不同病原菌的廣譜抗性，同時對獲得的拮抗菌進行鑒定，并進一步探討拮抗菌對番茄黃萎病的生物防效及其生理機制，旨在為微生物菌劑的研發(fā)提供生防菌種和番茄黃萎病生物防治的分子機制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）和黃萎病菌（Verticillium dahliae）由商丘師范學(xué)院植物與微生物互作重點實驗室提供，串珠鐮刀菌（F.verticillioides）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

2020 年5 月對示范園區(qū)溫室內(nèi)健康無病的薄荷（Mentha canadensis）進行內(nèi)生細菌的分離，2022年4 月對室內(nèi)盆栽的Moneymaker 番茄進行生物防效相關(guān)指標的測定。薄荷（Mentha canadensis）、Moneymaker 番茄由商丘師范學(xué)院植物與微生物互作重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 薄荷內(nèi)生細菌的分離、純化與形態(tài)學(xué)觀察

將新鮮無病薄荷的根、莖和葉用流水沖洗，室溫晾干。用75%（φ，后同）乙醇消毒1 min 后無菌水沖洗5 次，再用2%NaClO 溶液浸泡1 min 后無菌水沖洗5 次。將消毒后的根、莖、葉分別加適量無菌水，研磨至勻漿，靜置10 min，吸取100 μL 涂布于溶菌肉湯（LB）固體培養(yǎng)基平板，以最后一次的無菌水作對照。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d，用接種環(huán)分別挑取平板中不同形態(tài)、大小、顏色等的菌落，平板劃線純化后獲得單菌落，并對純化后的單菌落進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 薄荷內(nèi)生拮抗細菌的篩選 采用平板對峙培養(yǎng)法，以5 個供試菌株為病原菌，挑取病原菌菌餅置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板中心，于其周圍同等距離（約距中心2.3 cm）3 處接種待篩薄荷內(nèi)生細菌，以不接內(nèi)生細菌作對照。于28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，待對照的病原菌長滿平板（直徑為9 cm）時，觀察對峙平板薄荷內(nèi)生細菌對病原菌的抑菌效果；利用病原菌與內(nèi)生細菌兩點劃線法，測量對峙平板的病原菌向內(nèi)生細菌擴展的距離，即處理菌落半徑，并按下列公式計算抑菌率[13]，每個薄荷內(nèi)生細菌對單一病原菌的抑菌率均由其3 個對峙平板計算，每個對峙平板測定3 個數(shù)據(jù)，即9 次重復(fù)。經(jīng)篩選獲得拮抗作用較好的菌株做進一步試驗。

1.2.3 薄荷內(nèi)生拮抗細菌生理生化鑒定 參照趙詩佳等[14]的方法對薄荷內(nèi)生拮抗細菌菌株進行革蘭氏染色試驗、淀粉水解試驗、吲哚乙酸試驗、甲基紅試驗、過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗，參照東秀珠等[15]的方法對薄荷內(nèi)生拮抗細菌菌株進行乙酰甲基甲醇試驗（V-P test）和乳糖、甘油、檸檬酸鹽利用試驗，參照夏明聰?shù)萚16]的方法測定薄荷內(nèi)生拮抗細菌菌株生防特性相關(guān)的β-1，3 葡聚糖酶活性和蛋白酶活性。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《伯杰細菌鑒定手冊》[17]對薄荷內(nèi)生拮抗細菌菌株進行初步鑒定。

1.2.4 X7 菌株分子生物學(xué)鑒定 提取拮抗細菌基因組DNA，利用Mastercycler?nexus PCR 儀對其16S rDNA 進行PCR 分析。所用引物為：fD1（5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’）和 rP1（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR 反應(yīng)體系為50.0 μL：模板DNA 50～80 ng、上下游引物（10 μmol · μL-1）各1.0 μL、dNTP 5.0 μL、buffer（Mg2+）0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O 補至50.0 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，委托南京金斯瑞生物科技有限公司對產(chǎn)物進行測序。所測序列遞交GenBank，并通過BLASTn 對測定16S rDNA 基因序列進行同源性分析，利用MEGA 5.0 軟件基于鄰接法（Neighborhood Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 X7 菌株對番茄黃萎病的生物防效測定 取健康飽滿的番茄種子消毒后，將番茄按照表1 進行3 種不同處理，即對照組、致病組、防病組。試驗采用室內(nèi)盆栽方式，按照表1 傷根法對長至5～6 片真葉的番茄植株接種黃萎病病原菌，處理至20 d 調(diào)查番茄的發(fā)病率，并按下列公式分別計算病情指數(shù)[18]和防治效果，每個處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)10 盆，每盆種植1 株。發(fā)病程度分級標準參照陸家云等[19]的標準。0 級：外部無癥狀，植株健康；1 級：病葉面積占總?cè)~片的10%以下，葉脈間黃化；2 級：病斑面積占總?cè)~片的10%～50%，葉脈變黃且萎蔫；3級：病葉面積占總?cè)~片的50%以上，整株萎蔫；4級：植株死亡。

表1 X7 菌株對番茄黃萎病生物防治的處理方式

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件基于Fisher LSD（最小顯著性差異）法對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，采用Excel2019 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄荷內(nèi)生細菌的分離、純化與形態(tài)學(xué)觀察

從薄荷根、莖、葉組織中一共分離出25 株內(nèi)生細菌菌株，根中9 株、莖中8 株、葉中8 株。根據(jù)菌落及菌體形態(tài)學(xué)特征觀察，這25 株菌株被初步劃分為4 個類型（圖1），分別包含3、6、7、9 株內(nèi)生細菌菌株。每個類型選取1 個菌株分別命名為X3、X6、X7、X9，菌落及菌體形態(tài)特征詳見表2。

圖1 薄荷內(nèi)生細菌的4 種主要類型

表2 薄荷內(nèi)生細菌的菌落形態(tài)特征

2.2 薄荷內(nèi)生拮抗細菌的篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法，將上述分離純化的不同類型內(nèi)生細菌菌株進行病原菌廣譜抗性篩選。結(jié)果表明，薄荷內(nèi)生細菌X7 和X9 菌株對葡萄座腔菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、黃萎病菌、串珠鐮刀菌5 種供試病原菌均有抑制活性，對黃萎病菌的抑菌效果最好，抑菌率分別為73.33%、70.62%（表3）；X7 菌株對5 種病原菌的抑菌率均略高于X9 菌株（圖2，表3），說明X7 菌株拮抗活性較高，具有相對較大的生物防治潛力。

圖2 薄荷內(nèi)生細菌X7 和X9 對番茄黃萎病菌的拮抗作用

表3 薄荷內(nèi)生細菌X7 和X9 對5 種病原菌的抑菌率 %

2.3 薄荷內(nèi)生拮抗細菌生理生化鑒定

2.4 X7菌株分子生物學(xué)鑒定

以細菌基因組DNA 為模板，利用引物fD1/rP1經(jīng)PCR 獲得約1200 bp 的目的片段（圖3），測序獲得內(nèi)生拮抗細菌X7 的序列長度為1163 bp，該序列提交至GenBank 后獲得登錄號（OM956127）。BLASTn 分析并下載較高同源性的序列，利用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖4 可知，X7菌株與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis（MT013384）聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征的結(jié)果，鑒定薄荷內(nèi)生拮抗細菌X7 菌株為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 薄荷內(nèi)生拮抗細菌X7 菌株16SrDNA 的PCR 分析

圖4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的X7 菌株的系統(tǒng)進化樹

2.5 X7菌株對番茄黃萎病的生物防效

采用表1 的處理方法，室內(nèi)盆栽番茄接種黃萎病病原菌20 d 后，統(tǒng)計并計算薄荷內(nèi)生拮抗細菌X7 對番茄黃萎病的生物防效指標列于表5。對照組番茄植株均未發(fā)??；致病組的番茄植株幾乎全部發(fā)病，病情指數(shù)達70.83；拮抗菌X7 產(chǎn)生有活性的β-1，3 葡聚糖酶和蛋白酶（表4）可有效抑制番茄黃萎病菌的正常生長，防病組番茄植株的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著下降，防治效果達到67.16%。結(jié)果表明，薄荷內(nèi)生拮抗細菌X7 對番茄黃萎病的生物防效較好。

表4 薄荷內(nèi)生拮抗細菌X7 和X9 的生理生化特征

表5 薄荷內(nèi)生拮抗細菌X7 對番茄黃萎病的生物防效

3 討論與結(jié)論

筆者的研究共分離獲得25 株薄荷內(nèi)生菌株，經(jīng)抑菌譜篩選獲得2 株薄荷內(nèi)生拮抗細菌X7 和X9，對番茄黃萎病的抑菌率分別為73.33%和70.62%，X7 拮抗活性更高；經(jīng)鑒定X7 為貝萊斯芽孢桿菌?；诖_立種分類地位較晚[20-21]，貝萊斯芽孢桿菌存在菌種資源保藏量較少的問題[22]。已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）2A-2B[23]能有效拮抗辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、茄病鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani），抑菌率在60%以上；B.velezensisYP2[24]能 有 效 拮 抗Cercesporaspp.、Septoriasp.、Phomasp.、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和油菜菌核病菌（Sclerotinia scleotiorum）等真菌。這與筆者研究的貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株對供試真菌病原菌的抑制效果類似，進一步證明貝萊斯芽孢桿菌確有抑菌譜廣的特性；筆者獲得的貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株豐富了貝萊斯芽孢桿菌菌種資源。

番茄黃萎病（V.dahliae）是番茄生產(chǎn)特別是保護地栽培的重要病害之一，嚴重降低了番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[25]。前人研究結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌能夠有效防治小麥紋枯病[16]、紅葉芥菜白粉病[24]、日本大葉黃楊炭疽病[26]、稻瘟病[27]、松材線蟲[28]、番茄青枯病[29]等，展現(xiàn)出較廣泛的生物防效。筆者研究證明，貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株顯著降低了盆栽試驗番茄的黃萎病發(fā)病率、病情指數(shù)，生物防效較佳；分析發(fā)現(xiàn)該菌株能夠產(chǎn)生有活性的β-1，3 葡聚糖酶和蛋白酶，這些酶能夠降解病原菌細胞壁中的β-葡聚糖、蛋白質(zhì)[30-31]，這是貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株有效生物防治番茄黃萎病的重要生理機制之一，有關(guān)其防治番茄黃萎病的分子機制尚需進一步研究。筆者擬利用致病組和防病組的番茄植株，通過轉(zhuǎn)錄組與代謝組的聯(lián)合分析進一步探討X7 防治番茄黃萎病的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的分子機制。

筆者的研究結(jié)果表明，從薄荷獲得的貝萊斯芽孢桿菌X7 是一株極具生防菌劑研發(fā)潛力的菌株，可用于番茄黃萎病的防治。同時，研究結(jié)果可為貝萊斯芽孢桿菌防治番茄黃萎病分子機制的探討提供材料支撐和理論參考。