林智城, 李佳男, 汪宏濤, 徐 娟, 唐曉鳳

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

番茄(Solanumlycopersicum)是全球第一大經(jīng)濟(jì)作物[1],其營養(yǎng)豐富、口感良好以及含有多種天然的維生素、礦物元素和纖維素,在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和蔬菜供給中占有不可或缺的地位。番茄還是植物特別是漿果類遺傳、進(jìn)化、生殖生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式植物[2-7]。番茄屬于呼吸躍變型果蔬,而且其水份含量高、鮮嫩皮薄、極易損傷,給貯運(yùn)帶來許多不便,在貯藏期間也易受疫病、軟腐病、實(shí)腐病、潰瘍病等多種病害的影響或侵染,極易導(dǎo)致霉變腐敗,因此,番茄的貯藏品質(zhì)顯得尤為重要。番茄果實(shí)硬度是果實(shí)品質(zhì)構(gòu)成要素之一,與采后貯藏特性有密切關(guān)系,因此保持番茄果實(shí)硬度是提高番茄貨架壽命的有效途徑之一[8]。

番茄果實(shí)在貯藏過程中可能會(huì)遭遇各種各樣的病原微生物,而植物在與病原微生物的攻防協(xié)同進(jìn)化中形成了復(fù)雜的防御機(jī)制,包括對(duì)病原微生物的感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病基因表達(dá),最終激活抗病相關(guān)酶,合成防衛(wèi)次生代謝物[9-11]。如過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶等,在植物受到病原菌侵襲時(shí)表達(dá)量升高、活性增強(qiáng),參與活性氧清除和酚類等抗病代謝物質(zhì)的合成,以增強(qiáng)植物對(duì)病害的防御能力[12]。

紫外線抗性位點(diǎn)8(UV resistance locus 8,UVR8)蛋白負(fù)責(zé)UV-B感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。UVR8基因首次在紫外敏感植物的突變篩選中被發(fā)現(xiàn),該突變體對(duì)UV-B輻射敏感。突變體uvr8的UV-B抵抗能力被破壞是由于UV誘導(dǎo)的涉及UV損傷修復(fù)和UV保護(hù)的防御基因表達(dá)失敗造成的,例如查爾酮合酶基因,它是吸收紫外線的類黃酮和花色苷生物合成的重要酶。目前,關(guān)于UVR8在植物體內(nèi)的生理功能主要集中在擬南芥的研究中,包括抑制下胚軸的生長、葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞的伸展、表皮氣孔放大、調(diào)節(jié)生物節(jié)律、提高光合速率和提高對(duì)灰霉菌的抗性,其他植物可能還有許多未知的功能[13-17]。目前認(rèn)為UVR8還參與調(diào)控其他的生理反應(yīng),包括向光性、熱形態(tài)發(fā)生、晝夜節(jié)律、生長素信號(hào)、防御、耐鹽、避蔭、葉綠體發(fā)育、氣孔開放、葉片發(fā)育和葉片向下卷曲等[18]。

本研究以UVR8轉(zhuǎn)基因番茄植株果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料,野生型AC(WT)為對(duì)照,對(duì)其功能進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)UVR8能調(diào)控番茄果實(shí)的硬度,改變番茄果實(shí)的貯藏期,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其影響番茄果實(shí)中CAT、POD的酶活性,提高番茄果實(shí)的抗病能力,為提高番茄果實(shí)的貨架壽命及其采后商品化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 番茄材料

野生型(WT)、UVR8過表達(dá)(UVR8-OE)和UVR8基因沉默(UVR8-Ri)番茄種子,2種突變的基因型番茄種子均由本實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得[19]。種子催芽并露白后播種于50孔育苗盤(裝有濕潤育苗土)中,在16 h/8 h(光/暗)條件下發(fā)芽和育苗。待4片真葉展開時(shí),將小苗移栽植于標(biāo)準(zhǔn)聚碳酸酯日光溫室中生長。

1.2 UVR8轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株的鑒定

在遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)將篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ)轉(zhuǎn)入植物基因組中。以篩選標(biāo)記基因設(shè)計(jì)引物NPTⅡ-F/R見表1所列,野生型番茄基因組DNA為負(fù)對(duì)照、pBI121質(zhì)粒為陽性對(duì)照,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,以初步鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株。

表1 本研究所用引物序列

1.3 番茄硬度檢測

在番茄紅熟期(red ripe,RR)時(shí)取樣,WT、UVR8-OE和UVR8-Ri果實(shí)硬度用質(zhì)構(gòu)儀(Model TA.XT Plus,SMSTA,UK)帶探頭(Model SMS P/2N)進(jìn)行分析。用0.005 N的起始?jí)毫Σ⒁?.50 mm/s速度壓入15 mm,硬度值取每次測量最大值。對(duì)每個(gè)番茄的赤道面3點(diǎn)進(jìn)行測定,3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 貯藏期分析

在番茄紅熟期(RR)時(shí)取樣,將WT、UVR8-OE和UVR8-Ri果實(shí)統(tǒng)一放置在保鮮盒中,于25 ℃烘箱中恒溫貯藏,每隔5 d進(jìn)行觀察和拍照。

1.5 轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中CAT、POD酶活的測定

粗酶提取液的制備。取少量番茄外果肉,于研缽中加入液氮充分研磨成粉末,每次只取約0.3 g粉末,用1 mL冰上預(yù)冷的PBS緩沖液(0.1 mol/LKH2PO4、0.1 mol/L Na2HPO4、pH值7.0,加入1% TritonX-100、5%PVPP、5 mmol/L EDTA),充分混勻,于4 ℃離心機(jī)中13 000 r/min離心20 min。吸取上清液,再用上述的PBS緩沖液稀釋3倍,即粗酶液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)CAT量的測定[22-23]。吸取30 μL粗酶液,加入240 μL的0.05 mol/L PBS緩沖液,混勻后置于酶標(biāo)板中。迅速加入30 μL的0.1 mol/L的過氧化氫溶液,震蕩5 s后立即測定240 nm吸光度,每隔30 s再測量1次A240,連續(xù)測量10次。每g番茄中CAT物質(zhì)的量的計(jì)算公式為:

其中:ΔA240/t為吸光值的變化斜率,ΔA240為變化值,t為時(shí)間;Vt為提取酶液體積;Vs為反應(yīng)體系中提取液體積;m為番茄樣品質(zhì)量。

(2)POD量的測定[22,24]。吸取60 μL粗酶液,加入210 μL0.3%愈創(chuàng)木酚,30 ℃孵育10 min。加入0.1 mol/L過氧化氫溶液,震蕩5 s后立即測定470 nm吸光度。每隔30 s再測量1次A470,連續(xù)測量10次。每g番茄中POD物質(zhì)的量的計(jì)算公式為:

(1)株洲段河岸沉積物中的重金屬含量變化均較大，且自主城區(qū)入河口到出城口處沉積物重金屬元素含量變化的穩(wěn)定性明顯降低；沉積物中明顯富集Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Pb等重金屬元素，自市域河流上段 → 下段，其富集程度明顯加深．

其中:ΔA470/t為吸光值的變化斜率,ΔA470為變化值,t為時(shí)間;Vt為提取酶液體積;Vs為反應(yīng)體系中提取液體積;m為番茄樣品質(zhì)量。

1.6 轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中MDA量的測定

MDA量的測定[22,25]。吸取300 μL粗酶液,加入0.5 mL的0.5%TBA溶液(0.5%硫代巴比妥酸、10%三氯乙酸),95 ℃加熱20 min后迅速冰浴5 min,然后4 ℃、1 000g離心10 min。取300 μL上清液于酶標(biāo)板中,檢測450、532、600 nm吸光度。每g番茄中MDA物質(zhì)的量的計(jì)算公式為:

其中:Vt為提取酶液體積;Vs為反應(yīng)體系中提取液體積;m為番茄樣品質(zhì)量。

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。測定數(shù)據(jù)利用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UVR8轉(zhuǎn)基因番茄植株的鑒定

分別提取WT、UVR8-OE和UVR8-Ri植株的基因組DNA,以篩選標(biāo)記基因NPTⅡ特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入基因的番茄植株擴(kuò)增得到與正對(duì)照相同的預(yù)期條帶約750 bp,而WT未有擴(kuò)增條帶如圖1所示,圖1表明已獲得轉(zhuǎn)基因陽性番茄植株。圖1中,M表示DNA Marker;P表示pBI121質(zhì)粒,陽性對(duì)照;1～5分別表示UVR8轉(zhuǎn)基因番茄植株;N表示W(wǎng)T番茄,陰性對(duì)照。

圖1 UVR8轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA陽性鑒定

進(jìn)一步提取WT、UVR8-OE和UVR8-Ri陽性植株RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。UVR8表達(dá)水平如圖2所示,圖2中，*表示與WT相比有顯著性差異(P<0.05)。

由圖2可知,分別獲得UVR8表達(dá)水平高于和低于WT的2個(gè)獨(dú)立的UVR8-OE和UVR8-Ri植株,分別命名為UVR8-OE1、UVR8-OE2和UVR8-Ri1、UVR8-Ri2。鑒定結(jié)果表明,植物表達(dá)載體插入片段已在番茄基因組中整合,并獲得UVR8基因上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株。

圖2 UVR8轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分析

2.2 紅熟期番茄果實(shí)硬度的比較

番茄果實(shí)硬度是果實(shí)品質(zhì)構(gòu)成要素之一,與采后貯運(yùn)藏特性有密切關(guān)系,番茄果實(shí)的硬度測定結(jié)果如圖3所示,圖3中：相同字母表示沒有顯著性差異;不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

由圖3可知,與WT相比,UVR8-OE番茄果實(shí)的硬度顯著增加,UVR8-Ri番茄果實(shí)的硬度顯著降低,說明UVR8基因表達(dá)水平的提高可以顯著提高番茄果實(shí)的硬度。

圖3 番茄果實(shí)硬度比較

2.3 紅熟期番茄果實(shí)貯藏期的比較

因?yàn)閁VR8-OE轉(zhuǎn)基因番茄的硬度明顯強(qiáng)于野生型,所以對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的貯藏期進(jìn)行探究。在對(duì)番茄果實(shí)的貯藏期進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)UVR8-OE番茄果實(shí)較WT腐敗速度延緩。番茄果實(shí)的自然腐敗情形如圖4所示。

圖4 番茄果實(shí)的自然腐敗情形

從圖4可以看出，同日采摘的WT、UVR8-OE和UVR8-Ri番茄果實(shí)放置于25 ℃恒溫烘箱中,存放15 d后,UVR8-Ri和WT番茄相繼出現(xiàn)軟化腐敗,而UVR8-OE番茄品質(zhì)完好。

2.4 番茄果實(shí)酶活測定

為了探究其中可能存在的其他原因,對(duì)WT、UVR8-OE和UVR8-Ri株系果實(shí)中的CAT、POD和MDA酶活進(jìn)行測定。

2.4.1 CAT、POD酶活的測定

當(dāng)植物受到外界不良環(huán)境的脅迫以及病原菌侵襲時(shí),體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生并積累大量的活性氧[26]。植物通過激活清除活性氧的關(guān)鍵酶,例如CAT、POD,兩者協(xié)同配合,使植物體內(nèi)的氧自由基始終維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平,以此減輕活性氧對(duì)細(xì)胞膜的氧化損害,保護(hù)植物內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu),從而延長果實(shí)的貯藏期。番茄果實(shí)酶活測定的結(jié)果如圖5所示。圖5中：相同字母表示沒有顯著性差異,不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

圖5 UVR8轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中CAT、POD的量

從圖5可以看出,與WT相比,UVR8-OE番茄果實(shí)中CAT、POD的活力顯著提高,其中UVR8-OE番茄果實(shí)的CAT酶活是WT的2.5倍,POD酶活是WT的2.3倍;UVR8-Ri番茄果實(shí)中CAT、POD的活力顯著降低,僅為WT酶活水平的1/2,這說明UVR8基因表達(dá)水平的提高可以增強(qiáng)防御CAT、POD的酶活性。

2.4.2 MDA量的測定

以MDA的含量作為判斷植物細(xì)胞損失程度及抗病、抗脅迫能力的指標(biāo)[27]。MDA含量越高,說明細(xì)胞損失程度越高,抗脅迫的能力越弱。每g番茄果實(shí)中MDA物質(zhì)的量如圖6所示。圖6中：相同字母表示沒有顯著性差異；不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。從圖6可以看出,與WT相比,UVR8-OE番茄果實(shí)中MDA的量有所降低,僅為WT的1/2,而且UVR8-Ri番茄果實(shí)中MDA的量顯著提高,說明UVR8基因表達(dá)水平的提高可以降低膜系統(tǒng)的損傷,從而提升番茄的耐貯藏品質(zhì)。

圖6 UVR8轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中MDA的量

3 討 論

番茄果實(shí)硬度是果實(shí)品質(zhì)構(gòu)成要素之一,與采后貯藏特性有密切關(guān)系。在對(duì)UVR8轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的硬度進(jìn)行測定時(shí)發(fā)現(xiàn),UVR8-OE番茄果實(shí)的硬度顯著高于野生型,而且UVR8-Ri番茄果實(shí)的硬度顯著下降,表明UVR8基因參與了果實(shí)硬度形成這一重要的生理過程。在對(duì)番茄貯藏期的研究中發(fā)現(xiàn),UVR8-OE番茄果實(shí)有比野生型更長的貯藏期,說明UVR8基因的過量表達(dá)能夠顯著提升番茄的貯藏品質(zhì),為番茄的品質(zhì)改良提供了重要的理論依據(jù)。

CAT可以將過氧化氫分解為水和氧氣,使植物體免受過氧化氫的傷害[28-30]。POD作為植物體內(nèi)重要的呼吸酶類,它的活性高低直接影響了酚類物質(zhì)的代謝,并且與病原微生物的抗性密切相關(guān),是反映植物抗性的一個(gè)重要指標(biāo)[31]，它們均對(duì)植物起著重要的逆境保護(hù)作用。在UVR8-OE番茄果實(shí)中CAT、POD活性與WT相比均顯著提高。相應(yīng)地,作為植物體內(nèi)膜脂過氧化物重要產(chǎn)物之一,同時(shí)也是膜系統(tǒng)損傷程度、植物抗逆性重要反映指標(biāo)的MDA[32-33],其在UVR8-OE番茄果實(shí)中有所降低。結(jié)果表明，UVR8可能通過促進(jìn)抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),最終使防御酶活性增強(qiáng),在宿主保護(hù)、抑制病原微生物生長中發(fā)揮作用。

4 結(jié) 論

本研究從表型(耐貯藏及硬度)和果實(shí)酶活的測定證實(shí)了UVR8基因在提高番茄果實(shí)的貨架壽命中的作用,后續(xù)將通過對(duì)UVR8轉(zhuǎn)基因番茄植株的進(jìn)一步擴(kuò)繁,進(jìn)行較大規(guī)模植物葉片、果實(shí)病原菌接種實(shí)驗(yàn),并對(duì)UVR8-OE植株中激活的下游基因進(jìn)行分析,將有助于對(duì)UVR8基因功能的深入了解。