陳倩 唐秋萍

海南省血液中心臨床輸血研究室（海口 570311）

外泌體（exosomes）是由細胞分泌的磷脂雙分子層胞外囊泡樣小體，直徑30～150 nm，呈典型杯狀結(jié)構(gòu)。外泌體于1983 年P(guān)AN 和JOHNSTONE 觀察綿羊網(wǎng)織紅細胞的體外成熟過程時首次被發(fā)現(xiàn)，并在1987年被JOHNSTONE所命名［1-2］。其組成成分復雜，據(jù)ExoCarta 外泌體數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，至今已發(fā)現(xiàn)的外泌體中包含9 769 種蛋白質(zhì)、3 408 種mRNA、2 838 種miRNA 和1 116 種脂質(zhì)［3］。外泌體廣泛存在于血漿、尿液、唾液、腦脊液以及腹水等體液中。包括血細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、干細胞等在內(nèi)的幾乎人體所有活細胞均可分泌外泌體［4］。由于外泌體可通過自分泌、旁分泌方式作用于臨近細胞，或通過血液循環(huán)長距離運輸至遠端細胞，介導細胞間通訊與遺傳信息傳遞，因而在機體正常生理功能及疾病發(fā)生轉(zhuǎn)歸方面有著重要的作用［5］。來源于循環(huán)血漿的外泌體因易于取樣、侵入性小、成本效益高且便于開展實時檢測等優(yōu)點，非常適合作為不同疾病診斷預后的生物標志物和靶向藥物輸送載體并用于臨床治療，故而成為近年來外泌體研究中的熱點研究對象。本文主要就循環(huán)血漿外泌體在相關(guān)疾病研究和臨床應(yīng)用等方面的進展作一闡述。

1 循環(huán)血漿外泌體與疾病

外泌體最初被認為是一種清除細胞代謝廢物的運輸工具，但越來越多的研究已證明，包括循環(huán)血漿外泌體在內(nèi)的來源于多種體液的外泌體具有重要的生物學功能，在不少疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療中都發(fā)揮著重要作用。

1.1 心血管疾病實驗證明，循環(huán)血漿外泌體既可通過影響多種信號通路介導心血管疾病的病理性損傷過程，同時來自健康供者血漿外泌體中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等特異性分子也可通過促進細胞增殖分化和存活、加速血管生成、減少凋亡以及抑制纖維化等機制發(fā)揮對心臟的保護作用［6-7］。在對慢性心血管疾病充血性心衰發(fā)病機制的研究中就發(fā)現(xiàn)，來自健康供者循環(huán)血漿的外泌體能夠利用miR-126 靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)外周血單核細胞中多種關(guān)鍵細胞因子的產(chǎn)生和旁分泌過程，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性和細胞粘附分子、促炎性蛋白的表達，參與調(diào)控單核細胞-內(nèi)皮細胞的相互作用以及慢性心衰的發(fā)病過程，因而可作為充血性心衰的潛在治療工具［8］。對急性心肌梗死患者的研究也證明，來自健康供者血漿外泌體的miR-342-3p 可分別通過靶向性別決定區(qū)Y 框6 基因（sex determining region Y box 6，SOX6）介導的凋亡和轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）介導的自噬來減輕心肌細胞損傷，從而參與外泌體介導的心臟修復［9］。

1.2 神經(jīng)退行性疾病由于外泌體及其組成成分參與了神經(jīng)系統(tǒng)包括神經(jīng)保護與修復、神經(jīng)炎癥、突觸可塑性和病理分子的擴散傳播等多種生理和病理過程，因此它們被認為是研究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制、診斷和預測疾病進展的理想對象［10］。細胞外毒性β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成神經(jīng)炎性斑和細胞內(nèi)過度磷酸化的tau 蛋白形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)是阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）的主要病理特征。最近的研究表明，外泌體中也含有A? 和tau 蛋白。外泌體不僅可以介導Aβ 寡聚體（Aβ oligomers，oAβ）在神經(jīng)元之間的傳播，也可介導病理性tau蛋白的擴散，從而促進疾病進展。通過阻斷外泌體的形成、分泌或攝取，可以減少Aβ 寡聚體和tau蛋白的擴散及相關(guān)的毒性，表明外泌體在阿爾茨海默病的發(fā)病過程中起著重要作用［11-12］。對比阿爾茨海默病患者和健康對照者循環(huán)血漿外泌體的蛋白質(zhì)表達發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣蛋白42、總tau 蛋白（Ttau）和磷酸化tau 蛋白（P-tau）181 等多種蛋白成分存在差異表達。此外，阿爾茨海默病患者血漿外泌體Aβ1-42 和P-S396-tau 表達水平要顯著高于匹配的健康對照者，而且外泌體的體積相對較小，數(shù)量也較低，這些都有助于區(qū)分阿爾茨海默病患者與健康個體［10，13］。因此從循環(huán)血漿大量的外泌體中尋找發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，對于進一步了解神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進展機制，協(xié)助疾病診斷具有重要意義。

1.3 內(nèi)分泌疾病1 型糖尿病（type 1 diabetes mel?litus，T1DM）是由于自身反應(yīng)性T 細胞攻擊胰島β 細胞引起的慢性免疫性疾病。雖然關(guān)于T1DM發(fā)病機制尚不完全清除，但有研究認為，胰島β 細胞與免疫細胞，特別是與T 淋巴細胞之間的異常相互作用，是主要致病機制之一［14］。越來越多的證據(jù)顯示，外泌體可能是β細胞和免疫細胞之間的新型介質(zhì)，并通過多種機制參與了T1DM 的進展。T 淋巴細胞釋放的外泌體可通過外泌體miRNA 介導的信號通路誘導β 細胞凋亡，而胰島來源的外泌體含有β 細胞自身抗原，可以被抗原提呈細胞吸收并激活，從而啟動自身免疫反應(yīng)［15-16］。最近有研究團隊分析了與 T1DM 進展相關(guān)的循環(huán)血漿外泌體中circRNA、lncRNA 和mRNA 的表達譜，同時構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA 相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過揭示各種基因及其上游元件在T1DM 進展中的調(diào)控機制，為更好的理解外泌體在T1DM 發(fā)病中的潛在作用提供了新的實驗基礎(chǔ)［17-19］。

1.4 血液系統(tǒng)疾病外泌體可在參與機體正常造血的同時，也在惡性血液病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著干擾正常造血的作用。研究表明，急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）來源的外泌體不僅可通過誘導骨髓基質(zhì)基因的表達改變，使支持正常造血和成骨的相關(guān)基因表達下調(diào)，從而抑制骨髓的正常造血，也可通過抑制正常造血干細胞的功能來影響造血［20-21］。此外，來自患者循環(huán)血漿的外泌體還可將骨髓生態(tài)位改造成有利于白血病細胞生長且抑制正常造血的微環(huán)境［22］。而循環(huán)血漿外泌體中的二肽基肽酶4（dipeptidyl?peptidase 4，DPP4/CD26），是一種具有造血調(diào)節(jié)功能的絲氨酸蛋白酶，它可在體外抑制正常人造血祖細胞的分化，干擾造血功能。實驗證明通過藥理學抑制該病患者血漿外泌體二肽基肽酶4 的活性可以逆轉(zhuǎn)外泌體介導的骨髓抑制作用［23］。這些研究結(jié)果提示阻斷外泌體對造血功能的負面調(diào)控可能是急性髓系白血病和其他白血病的一種新的治療方法。

1.5 其他疾病研究顯示，血漿外泌體作為重要的生物介質(zhì)，不僅參與了調(diào)節(jié)和維持如類風濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性免疫性血小板減少癥等自身免疫性疾病的發(fā)生與進展［24-25］，在對全身感染性疾病膿毒癥的研究中也證明，循環(huán)血漿外泌體對膿毒癥患者的免疫系統(tǒng)也具有潛在調(diào)節(jié)作用，參加了膿毒癥的多種病理過程，且血漿外泌體水平與器官衰竭的嚴重程度以及膿毒癥危重患者的死亡率預測均相關(guān)［26-27］。

2 循環(huán)血漿外泌體的臨床應(yīng)用

最近幾年的研究中，外泌體的臨床應(yīng)用逐漸成為一個主要的探索領(lǐng)域。循環(huán)血漿外泌體在腫瘤的診斷和治療、靶向藥物載體的構(gòu)建和免疫治療藥物的開發(fā)上，均表現(xiàn)出了良好的研究和應(yīng)用前景［28］。

2.1 腫瘤診斷標志物外泌體在不同類型腫瘤診斷方面的巨大潛力已經(jīng)獲得了廣泛的認識，以外泌體作為生物標志物在腫瘤臨床診斷中表現(xiàn)出多種優(yōu)勢：首先外泌體表達其來源的宿主細胞的特異性表面標記物，因而可識別其來源；其次外泌體由脂質(zhì)雙分子層封閉包裹，在保護其所攜帶的生物活性物質(zhì)不被胞外蛋白酶所降解的同時，保證了內(nèi)含物的穩(wěn)定性和完整性；并且外泌體內(nèi)含物的含量和釋放都受到嚴格的生理和病理狀況調(diào)控，可反映身體的生物狀態(tài)，提供活細胞的實時信號［29］。除以上優(yōu)勢外，血漿作為臨床常規(guī)檢測樣本，可通過無創(chuàng)或微創(chuàng)途徑方便獲取，簡便易行、可重復操作、不易感染且成本低，因而相較于其他來源的外泌體，循環(huán)血漿外泌體更加適合用于腫瘤早期診斷、監(jiān)測和預后評估。

已有越來越多的證據(jù)表明循環(huán)血漿中的外泌體參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，可為腫瘤的早期診斷提供重要信息。在肝細胞癌（hepatocel?lular carcinoma，HCC）的研究中發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中長鏈非編碼RNA RP11-85G21.1（lnc85）的表達水平在肝細胞癌患者中顯著升高，對肝細胞癌的診斷具有重要意義［30］。對肺腺癌（lung adenocarci?noma，LUAD）的研究則顯示，肺腺癌患者血漿外泌體中趨化因子配體7（C-X-C chemokine ligand 7，CXCL7）mRNA 和蛋白表達均明顯增加，提示血漿外泌體CLCL7 可成為肺腺癌早期診斷的有效生物標志物［31］，而血漿外泌體miR-221 則認為對非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）表現(xiàn)出較好的輔助診斷價值［32］。此外，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者中，血漿外泌體miRNA-23b 的低表達被證明與與多個不良臨床病理學因素及較短的總生存期密切相關(guān)，并有助于結(jié)直腸癌的預后評估［33］。由于與傳統(tǒng)的生物標志物相比，外泌體表現(xiàn)出更高的診斷靈敏度、準確性和可靠性，因而可作為腫瘤早期輔助診斷的一種新型理想生物標記物。

2.2 腫瘤免疫治療隨著研究認識到外泌體作為細胞間通訊的關(guān)鍵信使，可參與腫瘤和免疫細胞間的信號傳導和免疫調(diào)控，外泌體在腫瘤免疫治療中的作用引起廣泛關(guān)注。研究表明，腫瘤患者血漿外泌體可向免疫細胞遞送抑制性貨物，誘導免疫抑制，降低免疫細胞的的抗腫瘤活性。對頭頸部腫瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者血漿外泌體攜帶免疫抑制分子，可通過誘導CD8+T 細胞凋亡，抑制CD4+T 細胞增殖，抑制NK 細胞細胞毒性來干擾免疫細胞的功能，抑制抗腫瘤的免疫反應(yīng)［34］。而對B 細胞的研究同樣顯示，血漿外泌體在體外對B 細胞的增殖、存活和功能也具有生理性抑制作用［35］。HONG 等［36］發(fā)現(xiàn)患有晚期惡性腫瘤的患者血漿中的外泌體可以干擾免疫治療，對急性髓系白血病患者接受NK-92 細胞過繼性免疫治療的研究顯示，來自患者血漿的外泌體除攜帶白血病相關(guān)抗原外，還含有細胞程序性死亡配體1（programmed death-1 ligand，PD-L1）等多種免疫抑制分子，在體外可抑制NK-92 細胞的細胞毒性、分化、增殖和定向遷移等多種功能，并對NK-92 細胞進行重新編程，從而干擾活化免疫細胞的抗白血病活性，并可能限制過繼細胞療法的預期治療效果 。

腫瘤患者血漿中外泌體是腫瘤細胞來源的外泌體（tumor-derived exosomes，TEX）和非腫瘤細胞來源的外泌體的混合物，后者主要是免疫細胞來源的外泌體（immune cell-derived exosomes，IEX）。因此，對腫瘤患者血漿外泌體的檢測，可以部分反映腫瘤狀態(tài)和機體的免疫功能。比如，腫瘤患者血漿中外泌體的數(shù)量和外泌體表面免疫調(diào)節(jié)蛋白PD-L1 的水平，被認為與疾病的活動性、腫瘤分期和預后具有相關(guān)性，患者血漿外泌體中PD-L1 水平越高，疾病活動性越強且分期更晚。此外，PDL1+外泌體可劑量依賴性抑制T 細胞活性，血漿外泌體PD-L1 含量越高，其抑制CD8+效應(yīng)T 細胞活化的能力就越強［37］。最近THEODORAKI 等［38］的研究結(jié)果顯示，腫瘤患者接受化療治療和隨訪期間，總外泌體蛋白水平，腫瘤/免疫細胞來源外泌體的比例以及外泌體的免疫抑制活性均會發(fā)生顯著變化，表明通過檢測循環(huán)血漿外泌體可以準確反映腫瘤患者的整體免疫狀態(tài)以及治療過程中免疫反應(yīng)的變化。因而血漿外泌體有望作為一種潛在的非侵入性生物標記物，代替免疫細胞，用于患者對腫瘤治療反應(yīng)的監(jiān)測以及預后療效的評價。

2.3 靶向藥物輸送載體外泌體可將宿主細胞本身所包含的多種生物活性分子從供體細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞，并影響后者的生物學特性，所以天然的成為一種富有吸引力的藥物輸送載體。不同于之前的脂質(zhì)體或聚合物納米顆粒等合成納米藥物載體，外泌體作為一種高效納米級藥物輸送系統(tǒng)，具有許多獨特的優(yōu)點：如出色的生物相容性、高度的代謝穩(wěn)定性、低免疫原性、低毒性、主動靶向性和特異性以及良好的生物膜滲透能力［29］。目前通過運用細胞轉(zhuǎn)染、聲波降解、電穿孔、凍融循環(huán)、表面活性劑處理和透析等多種物理、化學以及生物技術(shù)，可將治療藥物裝載到外泌體中并封存，進而實現(xiàn)不同的治療效果，同時發(fā)揮藥物的最佳有效性［39］。血液特別是血漿，是外泌體的豐富來源，非常適合治療中的應(yīng)用。神經(jīng)退行性疾病的治療過程中，血腦屏障的存在往往阻礙了大多數(shù)藥物的通過。研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)修飾的血液外泌體對大腦具有良好的天然靶向能力。通過飽和溶液培養(yǎng)法，可將治療藥物多巴胺有效裝載到血液外泌體中，并成功輸送到包括紋狀體和黑質(zhì)在內(nèi)的大腦區(qū)域，在帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）小鼠模型中已顯示出良好的治療效果［40］。在對另一神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病的治療中發(fā)現(xiàn)，裝載治療藥物懈皮素（quercetin，Que） 的血漿外泌體，可增強懈皮素的腦靶向性，顯著提高藥物的生物利用率［41］。表明血液尤其是循環(huán)血漿外泌體可作為未來富有前景的疾病靶向治療藥物輸送平臺。

2.4 恢復期血漿外泌體免疫治療過去20 年間，人們曾在包括流感、嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和中東呼吸綜合征（middle east respiratory syndrome，MERS）等在內(nèi)的歷次病毒爆發(fā)中都成功使用了恢復期血漿治療這一方法［42］。新型冠狀病毒感染（coronavirus dis?ease 2019，COVID-19）疫情期間，對于部分嚴重感染者，這種被動免疫療法再次發(fā)揮了重要作用。然而該療法中，供者的血漿會存在廣泛的抗體效價變異，且伴隨傳播傳染性病原體的風險，此外對于危重患者可能增加炎癥和血栓級聯(lián)反應(yīng)，罕見情況下，還可能導致輸血相關(guān)急性肺損傷。因此更多的研究圍繞恢復期血漿的衍生產(chǎn)品而展開，其中恢復期血漿外泌體被認為對COVID-19 重癥感染者的治療具有重要意義［43］。在對恢復期血漿外泌體免疫機制及生物活性的研究中發(fā)現(xiàn)，血漿中源于活化的免疫調(diào)節(jié)細胞如Th1 細胞、CD8+細胞毒性 T 細胞以及NK 細胞等分泌的外泌體，可能在恢復期血漿的治療中發(fā)揮了有效的免疫功能。這些外泌體大多能以足夠的敏感性和特異性識別抗原，并觸發(fā)細胞的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。同時外泌體在細胞間轉(zhuǎn)移包括tRNA、rRNA、mRNA 和miRNA 等在內(nèi)的RNA，也會在表觀遺傳學上影響受體對病毒的反應(yīng)［44-45］?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，研究者們最近利用COVID-19 感染患者恢復期免疫血漿源性外泌體開發(fā)了新型治療劑ChipEXO?。該制劑在體外試驗中顯示出強大的抗病毒特性，并具有促進組織保護和免疫調(diào)節(jié)功能［46］。在隨后進行的單中心前瞻性、開放標簽、單臂介入研究中，ChipEXO? 作為霧化吸入物用于治療因呼吸衰竭而入住ICU 的重癥COVID-19 患者，也顯示出了良好的安全性和有效性，未來有望成為治療COVID-19 介導肺損傷的一種新型治療策略［47］。

3 展望

外泌體作為一個嶄新的、迅速擴展的研究熱點，近年來受到了國內(nèi)外研究者們的廣泛關(guān)注，圍繞外泌體的結(jié)構(gòu)和生物學功能研究取得了相當成功，外泌體分離提取技術(shù)已極大優(yōu)化，臨床應(yīng)用研發(fā)進程也在被快速推進。然而外泌體尤其是循環(huán)血漿外泌體的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究仍面臨不少瓶頸問題，比如如何更有效的獲得高產(chǎn)量和高純度的循環(huán)血漿外泌體，如何明確循環(huán)血漿外泌體與其他組織和器官相互作用的具體機制，以及如何更好的增強循環(huán)血漿外泌體作為藥物輸送載體的負載能力和靶向性。相信隨著外泌體研究工作的深入，通過開展更廣泛的多學科研究，克服現(xiàn)有生物技術(shù)的局限性，將能更好的提高外泌體在臨床診斷和治療中的應(yīng)用潛力。