林金端，劉紅偉，馮子人，張慧賢 綜述，尹衛(wèi)國(guó) 審校

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院分子診斷中心，廣東清遠(yuǎn) 511500

1999年，VOGELSTEIN創(chuàng)造了“數(shù)字PCR”一詞，文章正式報(bào)道于美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，并表明該技術(shù)可用于發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)的癌癥突變[1]。數(shù)字PCR(dPCR)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，通過(guò)將一個(gè)樣本分配到幾十至幾十萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并收集熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。相較于傳統(tǒng)PCR， dPCR的優(yōu)勢(shì)主要在于：(1)絕對(duì)定量，該技術(shù)結(jié)果判定不依賴(lài)于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值(Ct)，不受擴(kuò)增效率的影響，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。(2)樣品需求量低，在檢測(cè)珍貴樣品和樣品核酸存在降解時(shí)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。(3)高靈敏度，dPCR本質(zhì)上是將一個(gè)傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)分成了數(shù)萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，在這些反應(yīng)中可以精確地檢測(cè)到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，且能避免非同源異質(zhì)雙鏈的形成。(4)高耐受性，由于目的序列被分配到多個(gè)微滴中，顯著降低了體系間的影響及背景序列和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾，擴(kuò)增基質(zhì)效應(yīng)大大減小。因此 dPCR適用于不能依靠Ct值很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域，如拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。在豐度低、樣本珍貴、背景復(fù)雜的腫瘤樣本檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。

盡管近年來(lái)腫瘤診療已取得了許多進(jìn)展，但腫瘤仍然是全世界死亡的主要原因之一?；蚍肿臃中蜋z測(cè)促進(jìn)腫瘤個(gè)體化治療，顯著改善了治療效果。目前分子分型主要依賴(lài)于手術(shù)或活檢組織進(jìn)行PCR、免疫組織化學(xué) (IHC) 和熒光原位雜交檢測(cè) (FISH)等方法。然而，對(duì)于早期或部分晚期腫瘤患者，難以獲得足夠組織樣本進(jìn)行檢測(cè)或因各種原因無(wú)法實(shí)施活檢，此時(shí)進(jìn)行血液檢測(cè)具有重要意義。在腫瘤晚期，凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液時(shí)會(huì)釋放產(chǎn)生外周血游離 DNA(cfDNA)，cfDNA 在血漿中水平較低，片段很短，因此，使用血漿樣本進(jìn)行突變基因檢測(cè)時(shí)如何提高檢測(cè)方法靈敏度至關(guān)重要。當(dāng)前靈敏度較高的檢測(cè)方法主要包括突變擴(kuò)增系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)、dPCR和二代測(cè)序(NGS)等。

dPCR作為第三代PCR技術(shù)，與ARMS-PCR和NGS比較，具有靈敏度高、操作流程簡(jiǎn)單、受背景信號(hào)干擾小等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，dPCR技術(shù)在腫瘤無(wú)創(chuàng)診療領(lǐng)域已開(kāi)始展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文將通過(guò)分析dPCR在常見(jiàn)腫瘤中的應(yīng)用情況探索dPCR液體活檢技術(shù)在大多數(shù)腫瘤診療中的實(shí)際臨床應(yīng)用效果。

1 dPCR技術(shù)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的無(wú)創(chuàng)診療

NSCLC是最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，占所有肺癌的80%～85%。目前可用于指導(dǎo)臨床靶向藥物選擇的驅(qū)動(dòng)基因包括表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)、V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)、人表皮生長(zhǎng)因子受體 2 (HER2)、克氏大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)和間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子，以及間變性淋巴瘤激酶(ALK)、v-ros UR2 肉瘤病毒癌基因同源物1、原癌基因酪氨酸蛋白激酶受體和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶1/2重排等。

1.1dPCR技術(shù)在EGFR突變NSCLC患者無(wú)創(chuàng)診療中的應(yīng)用 EGFR是NSCLC中最常見(jiàn)的突變基因，占10%～35%。其突變類(lèi)型以21號(hào)外顯子L858R 和 L861Q 及19號(hào)外顯子缺失最為常見(jiàn)，約占所有EGFR突變的85%。EGFR突變患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑 (TKI) 敏感。多重 dPCR進(jìn)行血漿EGFR突變檢測(cè)可顯著提高其檢出率，使更多患者有機(jī)會(huì)使用TKI，改善預(yù)后[2]。近期LEE等[3]基于75例早期和晚期NSCLC患者的86份血漿樣本進(jìn)行血漿與組織EGFR突變的檢測(cè)，并將檢出率進(jìn)行比較，利用dPCR檢測(cè)血漿EGFR突變，其檢出率接近組織EGFR突變率(43.2%vs.52.3%)。

除用于驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)外，dPCR在NSCLC診療中的另一個(gè)重要應(yīng)用方向是耐藥監(jiān)測(cè)。通過(guò) dPCR 檢測(cè)T790M突變已經(jīng)成為EGFR突變NSCLC患者使用TKI藥物后耐藥監(jiān)測(cè)的重要手段。SPENCE等[4]利用 dPCR技術(shù)檢測(cè)343例NSCLC 患者血漿中的EGFR突變，發(fā)現(xiàn)24% 的患者中存在EGFR T790M突變，血漿EGFR T790M突變可有效預(yù)測(cè)奧希替尼療效，避免患者接受侵入性組織活檢。LI等[5]通過(guò)回顧性分析dPCR技術(shù)檢測(cè)奧希替尼二線治療后部分反應(yīng)、疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展期的患者血漿cfDNA中的T790M突變頻率，發(fā)現(xiàn)奧希替尼二線治療部分反應(yīng)、疾病穩(wěn)定患者血漿中T790M突變水平高于疾病進(jìn)展期的患者，且血漿中T790M突變水平與患者無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)相關(guān)，但BUDER等[6]卻提出NSCLC患者血漿中T790M水平與患者預(yù)后未存在明顯關(guān)系。因此，目前仍需更多的研究和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估dPCR技術(shù)用于血漿T790M 突變的定量是否可用于預(yù)測(cè)患者TKI治療反應(yīng)。

除T790M突變外，EGFR基因的C797S突變也是NSCLC患者奧希替尼耐藥的主要原因。有20%～40%的奧希替尼耐藥是由C797S 突變引起的，通過(guò)dPCR，縱向評(píng)估治療前后血漿 EGFR T790M和 C797S 水平，顯示血漿 cfDNA不同EGFR突變類(lèi)型可作為評(píng)價(jià)奧希替尼治療期間疾病進(jìn)展的預(yù)后因素，這可能有助于臨床決策的制訂[7]。目前，dPCR 技術(shù)還用于檢測(cè)晚期 NSCLC 患者中EGFR基因不太常見(jiàn)的突變，例如 G719S 和 L851Q[8]。此外dPCR檢測(cè)EGFR突變已開(kāi)始在支氣管沖洗液、細(xì)針抽吸上清液、痰液和尿液等其他體液樣本中進(jìn)行探索。有研究表明，對(duì)于發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的肺癌患者，也可通過(guò)檢測(cè)腦脊液中的EGFR突變來(lái)評(píng)估患者預(yù)后，其預(yù)測(cè)效果優(yōu)于血漿樣本[9]。

1.2dPCR技術(shù)在KRAS突變NSCLC患者無(wú)創(chuàng)診療中的應(yīng)用 KRAS是一種致癌驅(qū)動(dòng)基因，25%～30%的NSCLC患者中存在KRAS突變[10]。盡管針對(duì)其突變的多種靶向藥物對(duì)患者臨床結(jié)果的影響已得到證實(shí)，但目前只有索托拉西布獲得美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于KRAS G12C NSCLC 患者[11]。目前已有多重dPCR技術(shù)可用于檢測(cè)KRAS基因最常見(jiàn)的 G12/G13突變的，實(shí)現(xiàn)對(duì)血漿 cfDNA 進(jìn)行靈敏、快速、準(zhǔn)確的基因分型，其檢出限至少可達(dá)0.2%，幫助臨床醫(yī)生快速判斷患者是否適合使用索托拉西布[11-12]。另外，dPCR技術(shù)也用于NSCLC KRAS突變患者預(yù)后判斷，目前已觀察到NSCLC患者血漿KRAS突變水平隨著疾病進(jìn)展而增加，Ⅰ期8%，Ⅱ期30%，Ⅲ期71%，Ⅳ期73%[12]。此外，一項(xiàng)基于dPCR技術(shù)的研究已發(fā)現(xiàn)血漿 ctDNA KRAS突變水平與NSCLC患者的生存時(shí)間、化療療效等相關(guān)[10]。

1.3dPCR技術(shù)在ALK基因重排NSCLC患者無(wú)創(chuàng)診療中的應(yīng)用 約5%的NSCLC患者存在ALK基因重排，其中以與棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(EMLA4)發(fā)生融合為多見(jiàn)，重排的ALK基因常導(dǎo)致持續(xù)信號(hào)激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。出現(xiàn)ALK-EMLA4重排的患者對(duì)克唑替尼、色瑞替尼等ALK-TKI敏感[13]，因此，高靈敏的檢測(cè)技術(shù)可使更多患者獲得靶向治療機(jī)會(huì)。目前，F(xiàn)ISH 或 IHC是ALK基因重排檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其靈敏度較低，檢出限約為15%[14]。作為一種高靈敏度技術(shù)，dPCR 檢測(cè)已被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)石蠟樣品中的ALK-EMLA4基因易位，其檢出限達(dá)0.25%[14]。

在耐藥監(jiān)測(cè)方面，約有20% ALK基因重排患者在接受第1代 ALK-TKI 克唑替尼治療后，由于激酶結(jié)構(gòu)域的突變而產(chǎn)生耐藥性。因此，如何快速、高通量檢測(cè)ALK突變并及時(shí)更改用藥，對(duì)提高患者預(yù)后具有重要作用。目前已報(bào)道超過(guò)10個(gè)突變與第1代ALK-TKI 耐藥相關(guān)，包括G1202R、F1174C/L、L1196M、G1269A、C1156Y、1151Tins、L1152R、S1206Y、I1171T、D1203N和V1180L等。已有多重dPCR用于檢測(cè)多種ALK突變，在一個(gè)由7例ALK陽(yáng)性NSCLC患者組成的小型隊(duì)列中，多重dPCR成功地監(jiān)測(cè)了疾病過(guò)程中不同的ALK耐藥突變狀態(tài)[15]。由于該隊(duì)列入組人數(shù)較少，仍需更多的數(shù)據(jù)和研究來(lái)進(jìn)一步評(píng)估dPCR檢測(cè)ALK繼發(fā)性突變的臨床意義及其對(duì)NSCLC患者預(yù)后的影響。即便如此，該隊(duì)列利用dPCR方法快速而靈敏的技術(shù)特點(diǎn)，通過(guò)微創(chuàng)的方法監(jiān)測(cè)ALK耐藥性突變，為臨床制訂用藥決策提供新思路。

2 dPCR技術(shù)與乳腺癌(BC)的無(wú)創(chuàng)診療

BC是女性頭號(hào)殺手，其發(fā)病率最近已超過(guò)肺癌，位居癌癥之首。臨床實(shí)踐中，BC根據(jù)組織學(xué)和5種分子特征分為3種亞型：激素受體 (HR) 陽(yáng)性 BC， HER2陽(yáng)性BC，不表達(dá)HR和HER2的BC(三陰性乳腺癌) 。這些標(biāo)志物可用于預(yù)測(cè)BC患者對(duì)內(nèi)分泌治療藥物和免疫治療藥物的反應(yīng)。其他靶點(diǎn)包括PIK3CA、雄激素受體、v-akt 鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1、雌激素受體1(ESR1)和程序性死亡受體配體1等也是目前新藥研發(fā)關(guān)注的靶點(diǎn)。dPCR技術(shù)已開(kāi)始用于BC患者的無(wú)創(chuàng)診療過(guò)程。研究表明dPCR 等比 Sanger 測(cè)序更靈敏的技術(shù)證實(shí)了早期 BC 患者手術(shù)前后可在患者血漿中檢測(cè)到ctDNA，甚至比傳統(tǒng)方法提前 11 個(gè)月預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)，可作為指導(dǎo)臨床診療的高靈敏度的檢測(cè)方法[16]。

2.1dPCR技術(shù)在BRCA基因突變BC患者無(wú)創(chuàng)診療中的應(yīng)用 10%的BC患者具有遺傳性，與家族病史有關(guān)。BRCA家族基因是 BC 中最常發(fā)生突變的基因，其畸變會(huì)使發(fā)生BC的風(fēng)險(xiǎn)增加70%。攜帶BRCA基因突變患者可能會(huì)受益于ADP-核糖聚合酶抑制劑，從而改善預(yù)后。BRCA基因改變多樣，包括點(diǎn)突變、大基因組重排或拷貝數(shù)變異(CNV)。Sanger測(cè)序和多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增 (MLPA) 被認(rèn)為是最可靠的方法[17]。有研究表明， dPCR 在檢測(cè)BRCA1基因組重排方面與MLPA具有良好的一致性[18]，但其成本約為MPLA的1/6。另外，MLPA檢測(cè)每個(gè)基因外顯子至少需要一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)，操作煩瑣，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種基于多通道的更具成本效益的多重dPCR，涵蓋所有編碼和非編碼外顯子，以及2個(gè)參考基因(RPP30和ALB)，可克服MLPA這個(gè)缺點(diǎn)[17]。

盡管dPCR可用于對(duì)液體活檢中的BRCA基因分型，但目前仍處于起步階段，仍需要更多的隊(duì)列研究數(shù)據(jù)，進(jìn)一步優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，以闡明其臨床應(yīng)用和意義。

2.2dPCR技術(shù)在PIK3CA突變BC患者無(wú)創(chuàng)診療中的應(yīng)用 激素療法極大地改善了HR陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性BC(mBC)患者預(yù)后。然而，PIK3CA 9號(hào)外顯子 E545K 和 E542K，以及20號(hào)外顯子H1047R 和 H1047L 突變常導(dǎo)致激素療法耐藥。采用dPCR技術(shù)檢測(cè)血漿 ctDNA 中這些生物標(biāo)志物可用于預(yù)測(cè) BC 療效。已有大量的臨床試驗(yàn)如PALOMA-3、MIRHO 和 BOLERO-2，采用dPCR技術(shù)用于分析BC患者血漿PIK3CA 突變與臨床療效的關(guān)系。盡管 PALOMA-3 和 MIRHO 試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)PIK3CA基線水平與PFS之間存在關(guān)聯(lián)，但該研究發(fā)現(xiàn)了血漿PIK3CA突變患者接受氟維司群聯(lián)合治療可延長(zhǎng)其PFS[18]。相比之下， BOLERO-2 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PIK3CA突變對(duì)其不能從哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制劑依維莫司二線治療中獲益，不能作為該藥的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)[19]?？梢?jiàn)，應(yīng)用dPCR技術(shù)早期鑒定 mBC 患者血漿PIK3CA突變狀態(tài)，可用于更好地指導(dǎo)臨床治療，避免患者重復(fù)接受組織活檢的痛苦。

2.3dPCR技術(shù)在ESR1突變BC患者無(wú)創(chuàng)診療中的應(yīng)用 在雌激素受體陽(yáng)性mBC患者中，有30%～40%患者發(fā)生ESR1突變[20]。研究表明，多數(shù)接受一線芳香化酶抑制劑(AI)治療的mBC患者在內(nèi)分泌治療期間會(huì)獲得ESR1突變，導(dǎo)致耐藥[21]。通過(guò)dPCR，一些研究人員分析了外周血中的ESR1突變狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與僅接受輔助AI治療的患者相比，已接受一線AI治療患者的突變發(fā)生率顯著增加。進(jìn)一步的分析表明ESR1基因Y537S和D538G突變與較短的OS相關(guān)。通過(guò)dPCR技術(shù)連續(xù)監(jiān)測(cè)BC患者治療過(guò)程中ESR1 Y537S、Y537N、Y537C和D538G位點(diǎn)突變水平，結(jié)果顯示AI治療可導(dǎo)致血漿ESR1突變水平波動(dòng)，治療后ESR1突變水平的增加是導(dǎo)致預(yù)后不良的原因[22]。目前采用dPCR技術(shù)能在2.5%～7.0%的原發(fā)性BC中檢測(cè)到ESR1突變[23]。此外，有研究顯示，血漿ESR1突變檢出率甚至高于組織檢出率[24]。

2.4應(yīng)用dPCR技術(shù)檢測(cè)血漿HER2水平在BC患者無(wú)創(chuàng)診療中的應(yīng)用 在20%～30%的侵襲性BC患者中存在HER2擴(kuò)增。HER2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和隨后的不良預(yù)后。目前，曲妥珠單抗聯(lián)合帕妥珠單抗可改善HER2(+)的早期BC和mBC患者的PFS和OS[25]。目前評(píng)估HER2擴(kuò)增的“金標(biāo)準(zhǔn)”是組織IHC或FISH。盡管對(duì)液體活檢中的HER2擴(kuò)增檢測(cè)知之甚少，但已有團(tuán)隊(duì)通過(guò)優(yōu)化dPCR檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)血漿中的HER2 CNV。為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，該團(tuán)隊(duì)使用EFTUD2基因作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)了HER2 dPCR檢測(cè)方案，該技術(shù)對(duì)76例BC患者的檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)以腫瘤活檢結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，該方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)100%，特異度達(dá)98%[26]。盡管該方法主要是為檢測(cè)血漿衍生的cfDNA而開(kāi)發(fā)的，但它也可以適用于甲醛固定石蠟包埋(FFPE)或新鮮冷凍組織樣本。這些研究提示HER2擴(kuò)增的微創(chuàng)測(cè)試將是一個(gè)臨床轉(zhuǎn)機(jī)。此外，可以進(jìn)一步優(yōu)化這種方法用于檢測(cè)其他擴(kuò)增基因。

3 dPCR技術(shù)與結(jié)直腸癌(CRC)的無(wú)創(chuàng)診療

眾所周知，CRC是由參與細(xì)胞復(fù)制、增殖和侵襲性密切相關(guān)調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵基因，如腺瘤性大腸息肉、KRAS、BRAF、PIK3CA和SMAD4集中的幾個(gè)突變的積累引發(fā)的。研究發(fā)現(xiàn)CRC組織可釋放大量DNA到血液中，dPCR技術(shù)檢測(cè)血漿cfDNA在腫瘤診斷、耐藥監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等患者全程管理方面有良好的應(yīng)用前景[27]。

3.1dPCR技術(shù)與血漿KRAS 和 BRAF檢測(cè)及其臨床意義 研究表明，5%～80% CRC患者中可發(fā)現(xiàn)EGFR信號(hào)過(guò)度激活[28]。過(guò)去十余年，大多數(shù)療法主要是針對(duì)MAPK 通路的激活或異常信號(hào)傳導(dǎo)。然而，KRAS或BRAF突變會(huì)導(dǎo)致抗EGFR單克隆抗體治療失敗。一項(xiàng)基于Bio-Rad dPCR、BioCartis Idylla、Roche COBAS z480 和 Sysmex BEAMing 4個(gè)檢測(cè)平臺(tái)用于檢測(cè)血漿 ctDNA KRAS突變的檢測(cè)效能的比對(duì)研究表明，在4個(gè)平臺(tái)中，dPCR 和 BEAMing靈敏度最高，此外，dPCR和COBAS 可以在單個(gè)反應(yīng)中分析多個(gè)樣本[29]。另一項(xiàng)回顧性研究表明，無(wú)論在與組織檢測(cè)結(jié)果的一致性還是檢測(cè)通量、重復(fù)性、檢測(cè)速度方面，dPCR檢測(cè)血漿KRAS突變的能力優(yōu)于COLD-PCR[30]。有研究表明cfDNA 水平與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC) 中的腫瘤突變負(fù)荷之間存在良好的相關(guān)性[30]，也可通過(guò)dPCR技術(shù)進(jìn)行CRC的早期篩查，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)防治。在預(yù)后判斷方面，mCRC患者血漿KRAS突變水平具有預(yù)測(cè)患者預(yù)后和治療監(jiān)測(cè)的能力。在來(lái)自前瞻性多中心AIO KRK0207試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用dPCR技術(shù)對(duì)患者血漿中的KRAS突變進(jìn)行量化，可通過(guò)檢測(cè)基線和治療過(guò)程中的KRAS突變情況，預(yù)測(cè)其OS和PFS[31]。dPCR檢測(cè)血漿KRAS突變影像學(xué)可提早10個(gè)月預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展[32]?？梢?jiàn)，dPCR技術(shù)檢測(cè)血漿KRAS突變波動(dòng)和最終消失可作為預(yù)測(cè)CRC患者抗EGFR療效的手段[33]。

3.2dPCR技術(shù)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (MSI)及其臨床意義 DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷(dMMR)導(dǎo)致DNA微衛(wèi)星中大量DNA復(fù)制錯(cuò)誤的積累，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為MSI。早期階段CRC患者dMMR/高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI-H) 的頻率為 15%，在 mCRC 中占2%～4%[33]。dMMR/ MSI-H是免疫治療療效的預(yù)測(cè)性泛腫瘤生物標(biāo)志物。ctDNA微創(chuàng)檢測(cè)MSI-H是一種很有前途的診斷和治療監(jiān)測(cè)工具。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種 dPCR 測(cè)定方法來(lái)評(píng)估微衛(wèi)星標(biāo)志物 BAT-26、ACVR2A 和DEFB105A/B。MSI-dPCR 測(cè)定在組織和血液樣本中得到驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了<0.1%的檢測(cè)靈敏度，其檢測(cè)結(jié)果與最常用的商業(yè)試劑盒 pentaplex-PCR的測(cè)定結(jié)果100%一致[34]。新的 MSI-dPCR 檢測(cè)有望成為一種經(jīng)濟(jì)、高效、簡(jiǎn)單、快速的診斷工具，用于檢測(cè)具有高臨床敏感性的 MSI。此外，該測(cè)定同樣適用于固體和液體活檢，還包括具有低 MSI 頻率的腫瘤組織樣本。

4 dPCR技術(shù)與胰腺癌(PC)的無(wú)創(chuàng)診療

雖然PC并不常見(jiàn)，但其預(yù)后極差，病死率極高，已成為全球第7大癌癥。已有研究通過(guò)多重 dPCR 檢測(cè)到的KRAS熱點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，PC晚期患者KRAS突變水平更高，且與遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的存在顯著相關(guān)性[35]，血漿KRAS突變發(fā)生率與預(yù)后不良有關(guān)[36]。在一個(gè)局部晚期不可切除的 PC 隊(duì)列中，治療后血漿KRAS突變水平顯著降低[37]。在一項(xiàng)類(lèi)似的研究中，研究人員觀察到在治療后 6 個(gè)月內(nèi)無(wú)法在血漿中檢測(cè)到KRAS 突變的患者，其預(yù)后更好[38]。這些結(jié)果與另一項(xiàng)使用多重 dPCR 測(cè)定法檢測(cè) 16 個(gè)KRAS突變的研究結(jié)果一致[35]。

5 其 他

周?chē)[瘤區(qū)域中的液體(例如腹膜液)已被證明是有用的 cfDNA 液體活檢來(lái)源[39]。在腹膜轉(zhuǎn)移 CRC 患者中，在腹膜液中檢測(cè)到的KRAS或BRAF ctDNA 水平明顯高于血漿中的水平[40]。由于尿液收集方便，且具有可重復(fù)多次采集等優(yōu)點(diǎn)，尿液也被列為腫瘤生物標(biāo)志物液體活檢樣本，用于疾病進(jìn)展和藥物反應(yīng)監(jiān)測(cè)。在KRAS陽(yáng)性 mCRC 隊(duì)列驗(yàn)證研究中，從尿液和匹配的血漿樣本中篩選出KRAS或BRAF突變。盡管二者的一致性很低，但它們表明了使用尿液樣本進(jìn)行非泌尿生殖道腫瘤突變篩查的可行性[41]。

已有研究證明，腫瘤組織周?chē)鷧^(qū)域中的其他 DNA 來(lái)源(例如外泌體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和其他體液等)可提供有關(guān)疾病演變的信息[39,42]。dPCR技術(shù)除了檢測(cè)血漿中ctDNA外，還可用于血漿外泌體檢測(cè)。外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的囊性結(jié)構(gòu)，可提供有關(guān)疾病演變的信息。有研究表明，dPCR用于評(píng)估來(lái)自外泌體衍生DNA中的KRAS熱點(diǎn)突變，靈敏度和特異度分別為75.4%和92.6%，外泌體中的KRAS突變檢測(cè)在所有階段都優(yōu)于血漿cfDNA。此外，局部切除前和切除后突變率分別從66%急劇下降至5%[43]。

6 展 望

液體活檢被認(rèn)為是癌癥管理的良好替代和補(bǔ)充工具。通過(guò)靈敏度檢測(cè)技術(shù)對(duì)特定生物標(biāo)志物的研究可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生在靶向治療期間監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展。盡管dPCR已被證明其在檢測(cè)罕見(jiàn)的可操作突變方面具有很高的靈敏度和特異度，但仍需要進(jìn)一步的研究以在所有臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。另一方面，相較于數(shù)字酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)軌蛱岣邔⒚庖邫z測(cè)的靈敏度提高到fg/mL級(jí)別，實(shí)現(xiàn)了高敏蛋白的檢測(cè)，dPCR盡管發(fā)展更早，卻在臨床應(yīng)用方面一直難以取得突破，主要是由于dPCR過(guò)程有很多技術(shù)難點(diǎn)。因此如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR擴(kuò)增，如何進(jìn)行靈敏的信號(hào)檢測(cè)和分析，如何提高自動(dòng)化程度是實(shí)現(xiàn)所謂的第3代PCR臨床應(yīng)用推廣的重要突破。