許 瀅，王 蕾，魏貝貝，宿玲恰，陳 晟，吳 敬*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

異麥芽寡糖（isomaltooligosaccharides，IMO）是葡萄糖以α-1，6 糖苷鍵為主連接而成的低聚糖混合物，主要成分為異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖及四糖以上的低聚糖。IMO 甜度柔和，耐熱耐酸，升糖指數(shù)低，是一種良好的低熱量甜味劑，同時(shí)具有降低血清膽固醇含量、改善腸道微生物環(huán)境等益生效益[1]。由于其優(yōu)良的理化性質(zhì)及生理功能，IMO 被廣泛應(yīng)用于功能性食品及醫(yī)藥保健品行業(yè)中，擁有巨大的市場(chǎng)需求量。

天然IMO 主要存在于味噌、黃酒等發(fā)酵食品中，并以游離狀態(tài)微量存在于紅薯、木薯等淀粉作物中。由于天然提取成本高且工藝復(fù)雜，目前市售IMO主要依靠酶法生產(chǎn)，聚合度（degree of polymerization，DP）大概在2～6。主流的工業(yè)制備IMO 方法是以淀粉質(zhì)原料為底物，依靠α-淀粉酶及β-淀粉酶等將淀粉液化、糖化，生成以麥芽糖為主的低聚合度寡糖混合物，再結(jié)合α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷作用生成具有α-1，6 糖苷鍵的復(fù)雜寡糖混合物[2]，該方法制備IMO 得率（IMO 產(chǎn)物質(zhì)量與底物質(zhì)量的比）一般在50%～55%，即為市售的IMO50，其主要成分為異麥芽糖、異麥芽三糖和潘糖。然而，研究表明，IMO 的益生功能主要?dú)w功于三糖及以上的高聚合度組分[3-4]。另一種生產(chǎn)方式是以蔗糖為底物原料，使用葡聚糖蔗糖酶（dextransucrase，DS）合成右旋糖酐，再通過右旋糖酐酶（dextranase，DN）作用水解生產(chǎn)IMO[5]，這種生產(chǎn)方法可通過調(diào)控底物濃度及DS、DN 使用比例來調(diào)整產(chǎn)物聚合度，但由于生產(chǎn)原料蔗糖成本較高，且該方法只能利用蔗糖中的葡萄糖單元，理論得率不超過50%，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。易子玲等通過將4，6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和普魯蘭酶、異普魯蘭酶、異麥芽三糖右旋糖酐酶復(fù)配，以淀粉為底物可制備高純度異麥芽三糖，產(chǎn)物得率為65.3%[6]，為以淀粉為底物制備高聚合度IMO提供了新思路，但是該法存在使用復(fù)配酶種類多、工藝復(fù)雜等問題。因此，如何在低原料成本的基礎(chǔ)上，開發(fā)簡(jiǎn)易新工藝，提升產(chǎn)品得率及聚合度是高效制備IMO 主要攻克的難題。

α-葡萄糖苷酶依靠轉(zhuǎn)移單個(gè)葡萄糖基生成IMO，其反應(yīng)機(jī)理決定了產(chǎn)物主要集中為二糖、三糖等低DP 組分。在催化轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的同時(shí)，α-葡萄糖苷酶還會(huì)進(jìn)行水解反應(yīng)，形成大量葡萄糖，不利于高DP 組分的生成及穩(wěn)定[7-8]。環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）屬于糖基水解酶13 家族及α-淀粉酶家族，可發(fā)生3 種轉(zhuǎn)苷反應(yīng)（歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)）及一種水解反應(yīng)，其中歧化反應(yīng)為分子間轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。不同于α-葡萄糖苷酶，CGTase 能以直鏈麥芽低聚糖為供體[9]，將葡萄糖、麥芽糖等小分子糖作為受體[10]，催化分子間轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，具有提高受體穩(wěn)定性、改善理化性質(zhì)等作用[11]。當(dāng)其以直鏈多糖為供體和葡萄糖、麥芽糖等為受體時(shí)，可以生產(chǎn)得到線性寡糖混合物，進(jìn)而提高淀粉制糖體系底物利用率[12]。針對(duì)工業(yè)生產(chǎn)IMO 的問題，在以往制備IMO主要用酶（α-葡萄糖苷酶）的基礎(chǔ)上，復(fù)配使用了CGTase，提出一種以麥芽糊精為底物，通過使用黑曲霉（Aspergillus niger）來源的α-葡萄糖苷酶復(fù)配嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus NO2）來源的CGTase 制備IMO 的新方法，將這種雙酶復(fù)配法制備的聚合度提高的IMO 命名為IMOH。通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合雙酶復(fù)配對(duì)酶轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間、加酶量、底物種類、復(fù)配酶加酶量及復(fù)配酶反應(yīng)時(shí)間等，在最優(yōu)條件下制備得到反應(yīng)液后，將產(chǎn)品經(jīng)活性干酵母消化并冷凍干燥處理，對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如相對(duì)分子質(zhì)量、鏈長(zhǎng)分布、鍵型比例進(jìn)行測(cè)定分析，同時(shí)通過體外腸道微生物的發(fā)酵對(duì)產(chǎn)品的益生效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。與市售IMO50 比較，雙酶復(fù)配制備的IMOH中α-1，6 糖苷鍵鍵型占比更高，平均相對(duì)分子質(zhì)量更大，益生效果更好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 畢赤酵母（Pichia pastoris）KM71、長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、具有A.niger 來源的α-葡萄糖苷酶基因的質(zhì)粒pPIC9K[13]、具有B.stearothermophilus NO2 來源的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）基因的質(zhì)粒pET-24a（+）[14]均保藏于作者所在實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 材料與試劑 麥芽糊精：菏澤天邦生物制品有限公司產(chǎn)品；商業(yè)化異麥芽寡糖IMO50：山東百龍生物有限公司產(chǎn)品；高溫α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、普魯蘭酶：山東隆大生物工程有限公司產(chǎn)品；酵母粉、胰蛋白胨：英國(guó)Oxoid 公司產(chǎn)品；牛肉浸粉：美國(guó)Neogen 公司產(chǎn)品；異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品：日本Glycarbo 公司產(chǎn)品；其他試劑（均為國(guó)產(chǎn)分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)、Hi-Plex Ca（7.7 mm×300 mm）色譜柱：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；高效凝膠排阻色譜儀：美國(guó)懷雅特技術(shù)公司產(chǎn)品；HYPERSIL APS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱、離子色譜儀：美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)品；全數(shù)字化核磁共振波譜儀：德國(guó)布魯克公司產(chǎn)品；厭氧工作站：英國(guó)依萊泰科公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基 腸道微生物基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨2.0，酵母粉2.0，NaCl 0.1，K2HPO40.04，KH2PO40.04，CaCl2·2H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.01，NaHCO30.5，半胱氨酸鹽酸鹽0.5，膽鹽0.5，吐溫80 2.0。MRS 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉50，牛肉浸粉10.0，葡萄糖20.0，檸檬酸氫二銨2.0，乙酸鈉5.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，吐溫80 1.0。其余培養(yǎng)基為培養(yǎng)大腸桿菌及畢赤酵母常用培養(yǎng)基：LB、TB、YPD、BMGY、BMMY 等培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶及CGTase 酶液的制備 以P.pastoris KM71 為宿主，對(duì)α-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行表達(dá)；以E.coli BL21（DE3）為宿主，對(duì)CGTase 基因進(jìn)行表達(dá)。使用大腸桿菌[14]及畢赤酵母[13]常用培養(yǎng)方法培養(yǎng)對(duì)應(yīng)重組菌株，發(fā)酵結(jié)束后于8 000 r/min 下離心20 min 收集上清液，即得到對(duì)應(yīng)粗酶液。

1.2.2 酶活力測(cè)定 α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷酶活力在pH 5.5 的50 mmol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液中測(cè)定，緩沖液中溶有50 g/L 的麥芽糖溶液。在45 ℃下，以900 μL 麥芽糖溶液為底物，加入100 μL 稀釋一定倍數(shù)的酶液，精確反應(yīng)5 min 后煮沸滅酶。體系中轉(zhuǎn)苷生成的異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖含量由HPLC測(cè)定。酶活力定義：在上述條件下，將每分鐘催化轉(zhuǎn)苷1 μmol 葡萄糖基所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。CGTase 的歧化酶活力測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[15]中的EPS 法。酶活力定義：該測(cè)定條件每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol EPS 所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.2.3 高聚合度異麥芽寡糖的制備 以溶于50 mmol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液的300 g/L 麥芽糊精為底物，加入一定量的α-葡萄糖苷酶酶液及CGTase酶液，在一定溫度下于轉(zhuǎn)速為150 r/min 水浴搖床中反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)完成后煮沸滅酶。將反應(yīng)體系pH 調(diào)整為5.0，加入100 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)）高溫α-淀粉酶、20 U/g 淀粉葡萄糖苷酶（以底物質(zhì)量計(jì)）及1 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)）普魯蘭酶消化處理未反應(yīng)完全的麥芽糊精，于60 ℃、150 r/min 水浴搖床中反應(yīng)2 h 后煮沸滅酶，離心得到產(chǎn)物IMOH。

1.2.4 高聚合度異麥芽寡糖的制備工藝優(yōu)化

1）時(shí)間優(yōu)化 反應(yīng)條件為pH 5.5、45 ℃，底物為DE 值在15～20 的300 g/L 麥芽糊精，α-葡萄糖苷酶加酶量控制為2 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)），每隔6 h取樣，至24 h 反應(yīng)結(jié)束。

2）溫度優(yōu)化 控制其他條件不變，將反應(yīng)溫度分別設(shè)置為40、45、50、55、60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為12 h。

3）pH優(yōu)化 控制其他條件不變，將反應(yīng)pH 分別設(shè)置為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反應(yīng)時(shí)間為12 h。

4）底物種類優(yōu)化 控制其他條件不變，將底物種類分別設(shè)置為DE 值為2、DE 值為8～10、DE 值為15～20 的麥芽糊精，反應(yīng)時(shí)間為12 h。

5）加酶量?jī)?yōu)化 控制其他條件不變，將α-葡萄糖苷酶加酶量分別設(shè)置為2、5、10、15、20 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)），反應(yīng)時(shí)間為12 h。

6）復(fù)配酶加酶量?jī)?yōu)化 控制其他條件不變，α-葡萄糖苷酶加酶量為5 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)），將復(fù)配酶（CGTase）加酶量分別設(shè)置為10、15、20、25 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)），每隔6 h 取樣至24 h 反應(yīng)結(jié)束。

1.2.5 酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè) 將酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行一定比例的稀釋后使用0.22 μm 濾膜過濾，制備得到液相檢測(cè)樣品，使用HPLC 檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)物的含量，計(jì)算得率，其中IMOH包含DP≥3 的高聚合度組分和異麥芽糖。測(cè)定高聚合度成分使用的HPLC 程序及參數(shù)：Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)，RID 示差檢測(cè)器，Hi-Plex Ca（7.7 mm×300 mm）色譜柱，柱溫80 ℃，檢測(cè)器溫度為40 ℃，以純水作為流動(dòng)相，流量為0.5 mL/min，通過面積歸一法對(duì)產(chǎn)物定量。測(cè)定異麥芽糖使用的HPLC 程序及參數(shù)：Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)，RID 示差檢測(cè)器，HYPERSIL APS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫及檢測(cè)器溫度為35 ℃，以體積分?jǐn)?shù)為75%的乙腈為流動(dòng)相，流量為0.8 mL/min，通過外標(biāo)法對(duì)產(chǎn)物定量。

1.2.6 酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物理化性質(zhì)測(cè)定方法

1）酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離 將得到的酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心后，加入0.33 g/g（以底物質(zhì)量計(jì)）的活性干酵母消化[16]去除葡萄糖，于30 ℃、200 r/min 搖床下反應(yīng)8 h 后煮沸滅菌，離心分離后得到上清液。將上清液冷凍干燥，得到產(chǎn)品，即為IMOH粉末。

2）相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 使用高效凝膠排阻色譜法（HPSEC）測(cè)定IMOH產(chǎn)物的平均相對(duì)分子質(zhì)量，HPSEC 利用產(chǎn)物在流動(dòng)相中的體積大小、流動(dòng)速度對(duì)其進(jìn)行大小測(cè)定。HPSEC 設(shè)置程序及參數(shù)：采用ULtrahydrogelTMLinear（300 mm×7.8 mm）凝膠柱，柱溫為45 ℃，以0.1 mol/L NaNO3為流動(dòng)相，流量為0.9 mL/min。

3）鏈長(zhǎng)分布 使用高效陰離子交換色譜（HPACEPAD）對(duì)產(chǎn)物成分進(jìn)行分析。HPACE-PAD 利用微孔聚合陰離子交換樹脂對(duì)DP≤12 的糖組分進(jìn)行交換層析，隨后進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行分析。采用DIONEX ICS-5000+SP-5 離子色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，使用CarboPac PA1 色譜柱（4 mm× 250 mm），以0.6 mol/L乙酸鈉為流動(dòng)相，流量為1.0 mL/min，使用麥芽糊精作為標(biāo)準(zhǔn)品。

4）核磁光譜分析（1H-NMR）稱取20 mg 冷凍干燥后的產(chǎn)物，溶于500 μL 重水中，其中重水中含有用于校準(zhǔn)化學(xué)位移的內(nèi)標(biāo)物0.3 g/L 三甲基硅烷磷酸酯（TMSP）。使用全數(shù)字化核磁共振波譜儀AVANCE III 在環(huán)境溫度下以400 MHz 對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行氫譜分析。通過在δ 為5.00 和5.39 處的信號(hào)峰峰面積的積分來計(jì)算產(chǎn)品的鍵型比例。

1.2.7 腸道微生物的培養(yǎng) 將菌株于37 ℃恒溫恒濕厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24～48 h 進(jìn)行活化。在活化擴(kuò)大培養(yǎng)后，取一定量的菌液分別轉(zhuǎn)接至含有10 g/L IMOH、市售IMO50、未添加其他碳源（空白）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使得初始OD600為0.05，于37 ℃恒溫恒濕厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。分別在6、12、24、36、48 h 取樣，測(cè)定菌液在600 nm 處吸光度及發(fā)酵液pH 變化，分別繪制對(duì)應(yīng)曲線，比較不同碳源下不同腸道微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高聚合度異麥芽寡糖產(chǎn)物制備

2.1.1 酶轉(zhuǎn)化單因素優(yōu)化 為了提高IMO 產(chǎn)量，對(duì)酶轉(zhuǎn)化涉及參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用單因素實(shí)驗(yàn)分析了反應(yīng)時(shí)間、pH、溫度、底物種類、加酶量對(duì)IMOH制備的影響（見圖1）。初步分析得到了IMOH制備最優(yōu)條件為反應(yīng)時(shí)間12 h，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)pH 為5.5，底物選擇葡萄糖含量較高的DE 值為15～20 的麥芽糊精，α-葡萄糖苷酶加酶量為5 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)），在此最優(yōu)條件下IMO 得率最高可達(dá)41.34%。

圖1 α-葡萄糖苷酶制備IMO 優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of IMO synthesis by α-glucosidase

2.1.2 雙酶復(fù)配優(yōu)化 基于單因素研究結(jié)果，復(fù)配使用CGTase，探究了復(fù)配酶加酶量及反應(yīng)時(shí)間對(duì)得率的影響。產(chǎn)物得率在不同復(fù)配酶加酶量下隨時(shí)間的變化結(jié)果如圖2 所示。在復(fù)配酶加酶量為15 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)），反應(yīng)時(shí)間為18 h 時(shí)，得率達(dá)到較為穩(wěn)定的水平，IMOH得率最高可達(dá)64.27%，其中三糖及以上高聚合度組分占比可達(dá)71.57%。此后再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，得率不能得到進(jìn)一步提升，同時(shí)可能因?yàn)槊傅乃庾饔?，?duì)生成產(chǎn)物進(jìn)行水解，從而降低制備效率。

圖2 雙酶復(fù)配優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Results of optimization by the dual-enzyme combination

對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物消化前葡萄糖含量和消化后高聚合度組分含量進(jìn)行分析，如表1 所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在復(fù)配CGTase 后，產(chǎn)物的葡萄糖組分明顯減少，IMOH得率得到大幅度提升，證明雙酶復(fù)配法在一定程度上利用了葡萄糖并生成了更長(zhǎng)鏈的糖分子。

表1 IMOH 組分Table 1 Content of IMOH

根據(jù)α-葡萄糖苷酶和CGTase 作用機(jī)制，作者繪制如圖3 的雙酶復(fù)配原理示意圖。α-葡萄糖苷酶主要以底物中麥芽糖、麥芽三糖為主的寡糖為供體底物，通過第一步反應(yīng)生成葡萄糖-α-葡萄糖苷酶復(fù)合物，第二步以水分子或葡萄糖、麥芽糖等做受體，發(fā)生水解或轉(zhuǎn)苷反應(yīng)[19-20]，最終分別生成葡萄糖或異麥芽糖、潘糖等IMO 成分。α-葡萄糖苷酶的水解活性較高，因此體系中會(huì)存在大量葡萄糖，在轉(zhuǎn)苷反應(yīng)中該葡萄糖同時(shí)也會(huì)與生成的異麥芽糖、潘糖等競(jìng)爭(zhēng)，不利于三糖及以上聚合度寡糖生成。在復(fù)配使用CGTase 后，CGTase 可直接利用反應(yīng)液中的麥芽多糖作供體，以葡萄糖、麥芽糖等小分子糖為受體發(fā)生轉(zhuǎn)苷反應(yīng)[10]，利用體系產(chǎn)生的葡萄糖；同時(shí)，也會(huì)將麥芽多糖轉(zhuǎn)化成聚合度降低的麥芽寡糖，為α-葡萄糖苷酶提供轉(zhuǎn)苷反應(yīng)底物。這些可能是復(fù)配CGTase 能夠提高產(chǎn)物聚合度和得率的原因。

圖3 雙酶復(fù)配原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of the principle of dual-enzyme combination

2.2 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

IMO 的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)取決于聚合度、糖苷鍵鍵型比例、葡萄糖單元連接方式等，其中聚合度越高，α-1，6 糖苷鍵比例越高，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，IMO 越不易在消化道中被消化，益生效果更好[21]。為確定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，對(duì)IMOH平均相對(duì)分子質(zhì)量、鏈長(zhǎng)分布及鍵型比例進(jìn)行測(cè)定。如圖4（a）所示，對(duì)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，其中相對(duì)分子質(zhì)量與出峰時(shí)間之間的關(guān)系由不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正，IMOH平均相對(duì)分子質(zhì)量MW為706，這說明產(chǎn)物的平均聚合度為4.36，相較于市售IMO50 的平均聚合度（3.12）更高。同時(shí)，為了確定實(shí)際產(chǎn)物組分，使用高效陰離子交換色譜對(duì)鏈長(zhǎng)分布進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4（b）所示，相較于市售IMO50，IMOH高聚合度組分占比更高。為進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物鍵型，使用1H-NMR 分析，結(jié)果如圖4（c）所示，在δ=5.00和δ=5.39 處出現(xiàn)了分別對(duì)應(yīng)于α-1，4 糖苷鍵和α-1，6 糖苷鍵的特征峰，按照峰面積比例計(jì)算，產(chǎn)物α-1，6 糖苷鍵達(dá)到70.67%，相較于市售IMO50 的鍵型占比（53.27%），IMOH更占優(yōu)勢(shì)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，可以推測(cè)出IMOH具有更優(yōu)良的產(chǎn)品性質(zhì)。

圖4 產(chǎn)物性質(zhì)測(cè)定結(jié)果Fig.4 Properties detection of the production

2.3 體外益生效果評(píng)價(jià)

2.3.1 生長(zhǎng)曲線變化 目前，許多研究利用腸道微生物對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)確定其實(shí)際益生效果。腸道益生菌如雙歧桿菌可選擇性利用含有α-1，6 糖苷鍵的益生元進(jìn)行增殖，在大量增殖后可產(chǎn)生局部厭氧環(huán)境，抑制好氧有害菌的生長(zhǎng)[17-18]。因此，通過腸道微生物的體外生長(zhǎng)狀況可推測(cè)產(chǎn)品的益生功能。作者將IMOH及市售IMO50 作為碳源添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（空白）為對(duì)照，選取成人腸道益生菌雙歧桿菌中占比最高的兩種菌種——青春雙歧桿菌及長(zhǎng)雙歧桿菌[22]和腸道條件致病菌大腸桿菌作為研究對(duì)象，考察了IMOH對(duì)益生菌、條件致病菌生長(zhǎng)狀況的影響。圖5（a）及圖5（b）分別為青春雙歧桿菌及長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線，IMOH對(duì)益生菌青春雙歧桿菌更具有增殖作用，對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌作用效果與IMO50 相近；圖5（c）為腸道條件致病菌大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，IMOH對(duì)腸道條件致病菌大腸桿菌具有抑制作用，具有一定的體外益生功能[22-23]。

圖5 腸道微生物體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of intestinal microorganisms cultivated in vitro

2.3.2 pH 變化 腸道益生菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)代謝如乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，這些化合物會(huì)降低腸道環(huán)境pH，抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)，同時(shí)減少有害代謝物質(zhì)的生成[24]。通過pH 變化情況，可推斷腸道微生物生長(zhǎng)環(huán)境的變化及有益代謝物質(zhì)的生成。如圖6（a）及圖6（b）所示，與空白組相比，青春雙歧桿菌及長(zhǎng)雙歧桿菌在含IMOH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生酸性物質(zhì)降低環(huán)境pH，其pH 變化與IMO50 中的接近；圖6（c）為腸道條件致病菌大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，大腸桿菌在含IMOH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)pH變化相較于IMO50 中的更小。

圖6 腸道微生物體外培養(yǎng)pH 變化情況Fig.6 pH of intestinal microorganisms cultivated in vitro

3 結(jié)語

作者基于α-葡萄糖苷酶生產(chǎn)IMO 的生產(chǎn)工藝，復(fù)配使用了CGTase，研究了IMOH的制備工藝、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及體外益生功能。結(jié)果顯示，在經(jīng)過酶轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，產(chǎn)品IMOH得率達(dá)到64.27%，其中三糖及以上高聚合度組分占比達(dá)到71.57%。經(jīng)過消化、冷凍干燥后的產(chǎn)物平均相對(duì)分子質(zhì)量為706，α-1，6 糖苷鍵鍵型占比達(dá)到70.67%，對(duì)益生菌青春雙歧桿菌具有增殖效果，且對(duì)于腸道條件致病菌大腸桿菌具有抑制效果。IMOH相較于市售IMO50 具有更良好的產(chǎn)品性質(zhì)及體外益生功能。研究結(jié)果為IMO 的工業(yè)制備提供了新思路。在后續(xù)研究中，可對(duì)α-葡萄糖苷酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析并改造，提高其轉(zhuǎn)苷活性，或?qū)ふ移渌麃碓吹霓D(zhuǎn)苷活性更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高IMO 得率。