邢 宇，王添譽(yù)，陳曉藝，李 苗，王淑婧，李 僉，李憲臻

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

漆酶是降解多酚類物質(zhì)的關(guān)鍵酶之一，其能夠催化多種酚類、芳香族有機(jī)物形成自由基，形成的自由基能夠發(fā)生聚合或解聚等非酶促次級反應(yīng)，并且以氧原子為最終受體，產(chǎn)物為水，無其他有害產(chǎn)物。自1883 年日本學(xué)者首次從日本紫膠漆樹中發(fā)現(xiàn)漆酶以來[1]，漆酶在食品、造紙、紡織、環(huán)保等領(lǐng)域逐漸引起了越來越多的關(guān)注[2-3]。目前，已發(fā)現(xiàn)的漆酶種類眾多，按照來源可以分為植物漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶[4]。其中，對真菌來源漆酶的研究數(shù)量最多，真菌漆酶主要由擔(dān)子菌和子囊菌產(chǎn)生，常用的菌株是白腐菌和變色栓菌。

變色栓菌是典型的擔(dān)子菌門真菌，分布在全國21 個省份，分泌漆酶的能力較強(qiáng)，且生長速度快，易于培養(yǎng)，并且在降解木質(zhì)素和染料脫色方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，有著極大的工業(yè)應(yīng)用價值[5]。李靈靈等篩選分離了一種高效降解木質(zhì)素的菌株BYL-7，并發(fā)現(xiàn)了在初始pH 6.7、溫度25 ℃、接種量8%（體積分?jǐn)?shù)）的條件下可明顯提高其木質(zhì)素降解率[6]。Asgher 等發(fā)現(xiàn)一種當(dāng)?shù)匕赘婢鶬BL-04，通過優(yōu)化溫度和pH 等工藝參數(shù)，這種真菌處理紡織工業(yè)廢水的脫色率在3 d 內(nèi)顯著提高到了84%[7]。法尼醇是一種低水溶性的非環(huán)狀半萜醇，被廣泛用作化妝品和抗癌藥物的原料，是目前發(fā)現(xiàn)的真菌中研究最多的群體感應(yīng)因子[8-11]。胡建華在5 L 發(fā)酵罐中加入法尼醇改變了變色栓菌的菌絲形態(tài)，提高了漆酶的產(chǎn)量，在法尼醇添加濃度為60 μmol/L 時，漆酶產(chǎn)量比對照組提高了93%[12]。在以往的研究中，尚未有關(guān)于以法尼醇作為信號分子誘導(dǎo)的變色栓菌發(fā)酵體系所產(chǎn)生的漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，并且對該體系中產(chǎn)生的漆酶在染料脫色方面的探索較少。

作者以土豆培養(yǎng)基為基質(zhì)，利用變色栓菌進(jìn)行漆酶的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵過程中采用法尼醇作為誘導(dǎo)劑[13]，測定了漆酶酶活力和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，進(jìn)一步研究了漆酶的酶學(xué)性質(zhì)和酶促反應(yīng)動力學(xué)。研究其對伊文思藍(lán)、鉻黑T、剛果紅3 種染料的脫色效果，為揭示漆酶的催化機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也為進(jìn)一步深入探索漆酶的催化機(jī)制和對漆酶分子在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行改造以獲得具有工業(yè)應(yīng)用價值的漆酶提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

變色栓菌（Trametes versicolor，編號CICC14001）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 實驗試劑

鄰苯二酚：上海阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品;酒石酸、酒石酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;法尼醇：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品;磷酸二氫 鉀、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NH4H2PO4、FeSO4·7H2O、葡萄糖、CuSO4·5H2O：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NH4Cl：天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)G250：鼠來寶（武漢）生物科技有限公司產(chǎn)品;剛果紅、鉻黑T、伊文思藍(lán)：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;以上試劑均為分析純（AR）。

1.3 主要設(shè)備

電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；立式高壓蒸汽滅菌鍋：浙江力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；SpectraMax Plus384 酶標(biāo)儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計：鉑金埃爾默儀器有限公司產(chǎn)品；微生物培養(yǎng)箱：杭州坤天科技有限公司產(chǎn)品；BILON 超聲波清洗機(jī)：上海比朗儀器制造有限公司產(chǎn)品；PHSJ-3F 型pH計：上海雷磁儀器有限公司產(chǎn)品；TDZ5-WS 臺式低速離心機(jī)：上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；熱風(fēng)循環(huán)烘箱：吳江華飛電熱設(shè)備有限公司產(chǎn)品；XYSYG-11 恒溫水浴鍋：上海昕儀恒溫水浴鍋公司產(chǎn)品；全溫型多振幅高速軌道搖床：上海智城分析儀器廠產(chǎn)品。

1.4 菌種培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面活化 配制土豆培養(yǎng)基，稱取去皮土豆200 g，加入適量去離子水，煮沸30 min，紗布過濾后定容至1 L，然后加入葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，加熱融化后分裝至試管中，經(jīng)121 ℃、20 min 高溫滅菌后制成斜面，將菌接種在斜面上26 ℃培養(yǎng)7 d。

1.4.2 種子擴(kuò)培 配制土豆培養(yǎng)基，稱取去皮土豆200 g，加入適量去離子水，煮沸30 min，紗布過濾后定容至1 L，再加入葡萄糖20 g，攪拌至溶解，分裝至250 mL 三角瓶中（100 mL/瓶）。將斜面菌絲體接種到種子培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min 培養(yǎng)7 d，即形成一級種子培養(yǎng)液；再將一級種子培養(yǎng)液接種到新鮮的種子培養(yǎng)基中，接種量為10%（體積分?jǐn)?shù)），26 ℃培養(yǎng)5 d，即形成二級種子培養(yǎng)液。

1.4.3 搖瓶發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)設(shè)置兩組，分別為常規(guī)發(fā)酵體系（即不添加法尼醇的對照組）與以法尼醇為誘導(dǎo)劑的變色栓菌發(fā)酵體系。常規(guī)發(fā)酵體系的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：1 L 培養(yǎng)基中含KH2PO40.2 g、CaCl2·2H2O 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NH4H2PO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.035 g、葡萄糖2 g、NH4Cl 0.27 g、CuSO4·5H2O 0.02 g，充分溶解后，分裝至250 mL 三角瓶中（50 mL/瓶），隨后將二級種子培養(yǎng)液（菌球狀培養(yǎng)物）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min 培養(yǎng)7 d，接種量為10%（體積分?jǐn)?shù)），發(fā)酵前期pH 控制在4.0 左右。法尼醇為誘導(dǎo)劑的變色栓菌發(fā)酵體系則是在接種前將法尼醇經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾添加到常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基中，濃度為4 mmol/L[13]，26 ℃、150 r/min 培養(yǎng)7 d，誘導(dǎo)漆酶發(fā)酵過程。

1.5 酶活力測定

向10 mL 離心管中加入3 mL 0.1 g/dL 鄰苯二酚溶液和適量漆酶發(fā)酵液，在25 ℃下反應(yīng)5 min，隨后利用紫外-可見分光光度計測定450 nm 處的吸光度，已知摩爾吸光系數(shù)為2 211 L/（mol·cm），漆酶酶活力的計算公式如下式（1）：

式中：E 為酶活力，U/L；V酶為漆酶溶液體積，mL；V總為該反應(yīng)體系總體積，mL；A測為酶液反應(yīng)后吸光度；A0為酶液未反應(yīng)前吸光度；Δt 為反應(yīng)時間，min；ε 為摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）。

酶活力定義為：1 min 氧化1 μmol 鄰苯二酚所需漆酶的量為一個酶活力單位（U）。實驗結(jié)果為3個平行實驗的平均值。

1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

1.6.1 制作BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)Bradford 的原理，配制1.0 mg/mL 牛血清白蛋白溶液，并稀釋為10、20、30、50、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)溶 液。將800 μL 考馬斯亮藍(lán)G250 溶液加入200 μL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液中，混合均勻，在室溫下反應(yīng)5 min，確定595 nm 處的吸光度，并繪制吸光度-蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 發(fā)酵液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定 將發(fā)酵液在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，加入800 μL 考馬斯亮藍(lán)G250 溶液，振蕩混合均勻，室溫下放置5 min，測定595 nm 處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.7 漆酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 最適反應(yīng)溫度與pH 向各試管中加入3 mL pH 4.0 的0.1 g/dL 鄰苯二酚溶液和適量漆酶發(fā)酵液，分別在20、30、40、50、60 ℃下反應(yīng)5 min，測定450 nm 處吸光度，每組設(shè)置3 組平行實驗，實驗結(jié)果為3 組平行實驗的平均值。

向小燒杯中加入3 mL 的0.1 g/dL 鄰苯二酚溶液和適量的漆酶發(fā)酵液，用pH 計調(diào)節(jié)pH 到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分別在25 ℃下反應(yīng)5 min，然后于450 nm 處測定吸光度，每組設(shè)置3 個平行實驗，以每組數(shù)據(jù)中的最大酶活力為100%，測定漆酶發(fā)酵液在各條件下的相對酶活力。

1.7.2 漆酶的熱穩(wěn)定性 將培養(yǎng)好的漆酶發(fā)酵液在25、35、45、55、65、75 ℃下保藏1 h，而后加入底物，在25 ℃下反應(yīng)5 min，在450 nm 處測定吸光度，每組設(shè)置3 個平行實驗。

1.7.3 酶促反應(yīng)動力學(xué) 分光光度法由于其反應(yīng)靈敏且步驟簡單，因此被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)的分析，朗伯-比爾定律是分光光度法的理論基礎(chǔ)，該定律描述了當(dāng)一束平行單色光垂直穿過裝有均勻非散射體系溶液的器皿時，在液層厚度保持不變的情況下，溶液吸光度與濃度成正比[14-15]。將漆酶與鄰苯二酚混合后在25 ℃的條件下反應(yīng)，分別在反應(yīng)時間為2、5、8、10、15、20、25、30、35 min 時，取樣并測定吸光度，利用以下公式對酶促反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行擬合。

朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

式中：A 為溶液吸光度；T 為溶液透射比，即為出射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度之比；ε 為摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）；b 為液層厚度，cm；c 為吸光物質(zhì)濃度，mol/L。

根據(jù)朗伯-比爾定律，可以分析吸光度與產(chǎn)物濃度的關(guān)系，通過時間與吸光度的關(guān)系可以建立產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時間的動力學(xué)方程。一階動力學(xué)方程為：

式中：Ca為底物濃度，mol/L；Cb為產(chǎn)物濃度，mol/L；k1為反應(yīng)速率常數(shù)，min-1；t 為反應(yīng)時間，min。

二階動力學(xué)方程為：

式中：Ca為底物濃度，mol/L；Cb為產(chǎn)物濃度，mol/L；k2為反應(yīng) 速率常 數(shù)，L/（mol·min）；t 為反應(yīng)時間，min。

將不同濃度的鄰苯二酚溶液溶解于pH 為4.0的酒石酸緩沖液中，隨后加入適量漆酶發(fā)酵液，在25 ℃下反應(yīng)5 min，建立吸光度-鄰苯二酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后將一定濃度鄰苯二酚溶液與漆酶發(fā)酵液混合，反應(yīng)過程中定時從反應(yīng)體系中吸取溶液測定450 nm 處的吸光度。米氏方程的表達(dá)式如下式（5）所示，進(jìn)一步計算酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。

式中：V0為產(chǎn)物生成速率，mmol/（L·min）；Vmax為漆酶與底物反應(yīng)達(dá)到飽和時的反應(yīng)速率，mmol/（L·min）；[S]為鄰苯二酚濃度，mmol/L；Km為米氏常數(shù)，mmol/L。

1.8 漆酶對染料脫色性能的研究

為考察漆酶對剛果紅、鉻黑T、伊文思藍(lán)3 種染料的脫色性能，分別將3 種染料溶解于50 mmol/L pH 為4.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，并對伊文思藍(lán)、鉻黑T、剛果紅3 種染料在400～800 nm 進(jìn)行了光譜掃描，確定特征吸收波長[16]。隨后取10 mL 發(fā)酵液上清液，向溶液中加入30 mL 的染料，其中染料質(zhì)量濃度均為20 mg/L，在反應(yīng)過程中，保持反應(yīng)溫度為25 ℃，分別在3 種染料的特征吸收波長下，于0、2、5、7、12、24、28 h 用紫外-可見分光光度計測定吸光度，并計算染料脫色率，同時以脫色率為縱坐標(biāo)，處理時間為橫坐標(biāo)繪制曲線。脫色率計算公式如式（6）所示：

式中：D 為脫色率，%；A0為染料脫色前吸光度；A 為染料脫色后吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶酶活力與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

將鄰苯二酚溶液和適量漆酶發(fā)酵液混合，測得的漆酶酶活力為（161.37±1.58）U/L。取200 μL 離心后的發(fā)酵上清液，向溶液中加入800 μL 考馬斯亮藍(lán)G250 溶液，混合后測定595 nm 處吸光度，計算得到加入法尼醇誘導(dǎo)的漆酶發(fā)酵體系中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為（29.19±1.30）mg/L。而在對照組中，常規(guī)發(fā)酵體系中的酶活力與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度僅為（15.73±3.49）U/L 和（2.78±0.37）mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于添加法尼醇為誘導(dǎo)劑的變色栓菌發(fā)酵體系中的酶活力與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。在Hu 等的研究中，利用60 μmol/L 的法尼醇誘導(dǎo)變色栓菌生產(chǎn)漆酶，發(fā)酵酶活力可達(dá)629.3 U/L，與對照組相比，增加了92.3%[17]。Wang 等發(fā)現(xiàn)，添加法尼醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)體系在培養(yǎng)6 d 后，胞外漆酶產(chǎn)量達(dá)到最大值，酶活力達(dá)到（2 189.2±54.7）U/L，比對照組的漆酶產(chǎn)量提高了6.8 倍[18]。作者研究結(jié)果進(jìn)一步證明了法尼醇的加入可以顯著提高變色栓菌產(chǎn)漆酶的能力。

2.2 反應(yīng)溫度對漆酶酶活力的影響

將pH 為4.0 的0.1 g/dL 鄰苯二酚溶液與適量漆酶發(fā)酵液混合，在20～60 ℃反應(yīng)5 min，測得吸光度后通過酶活力計算公式得到酶活力。由圖1 所示，漆酶相對酶活力整體呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在20～40 ℃時，漆酶酶活力隨著溫度的上升而提高；當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時，漆酶酶活力達(dá)到最大值（160.32±5.34）U/L，可能是由于溫度增加，使得鄰苯二酚分子間熱運動速率加快，分子間碰撞機(jī)會增加，漆酶的T1 型Cu2+與鄰苯二酚碰撞機(jī)會也增加，進(jìn)而強(qiáng)化了催化鄰苯二酚的反應(yīng)過程。值得注意的是，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到40～60 ℃時，雖然此時反應(yīng)溫度更高，分子間熱運動速率更快，增加了鄰苯二酚與漆酶之間的接觸機(jī)會，但在高溫環(huán)境下，發(fā)酵液中漆酶本身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到了破壞。并且，漆酶作為單電子還原酶，其催化機(jī)理本質(zhì)上是單電子的傳遞和自由基的形成，漆酶分子中的T1 型Cu2+首先通過底物吸收單電子，使底物變成自由基，自由基可以進(jìn)行歧化、聚合等非酶促反應(yīng)，而被吸收的單電子通過His-Cys-His 途徑從T1 型Cu2+傳遞到由T2 型Cu2+和T3 型Cu2+組成的三核銅團(tuán)簇中，隨后氧原子作為最終電子受體經(jīng)過還原形成水[12-13]，電子傳遞的速率影響著自由基的形成，而高溫環(huán)境可能會阻礙電子的傳遞，導(dǎo)致自由基形成難度增加，漆酶催化活性減弱。這與其他漆酶產(chǎn)生菌的研究一致，張初署等研究了食用菌SJ-1 漆酶在25～45 ℃時漆酶酶活力的變化，發(fā)現(xiàn)在25～35 ℃時，漆酶酶活力與反應(yīng)溫度成正比，當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時，漆酶酶活力達(dá)到最大值，達(dá)到峰值后漆酶酶活力下降，直至40 ℃后趨于穩(wěn)定[19]。Asgher 等通過檢測變色栓菌來源漆酶酶活力，發(fā)現(xiàn)溫度為45 ℃時的酶活力最高。以上研究表明，變色栓菌來源漆酶的最適反應(yīng)溫度為35～45 ℃[20]，而作者研究在添加法尼醇的情況下，變色栓菌漆酶的最適反應(yīng)溫度未發(fā)生明顯變化。

圖1 溫度對漆酶酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on laccase activity

2.3 熱穩(wěn)定性研究

將漆酶發(fā)酵液在不同溫度下保持1 h 后，進(jìn)行酶活力測定，進(jìn)一步考察變色栓菌來源漆酶的熱穩(wěn)定性。由圖2 所示，隨著保藏溫度的升高，在25～55 ℃的條件下漆酶酶活力緩慢下降，在55 ℃時，相對酶活力為94.32%；之后隨著保藏溫度逐漸升高至65 ℃時，漆酶酶活力急劇下降，相對酶活力僅為14.29%；當(dāng)保藏溫度進(jìn)一步升高至75 ℃時，幾乎檢測不到漆酶酶活力，這一現(xiàn)象說明高溫完全破壞了漆酶的結(jié)構(gòu)，使漆酶三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞，發(fā)生變性。由實驗結(jié)果可以看出，變色栓菌來源的漆酶在25～55 ℃時具有較好的熱穩(wěn)定性。Zhang 等的研究發(fā)現(xiàn)，變色栓菌來源漆酶在20～60 ℃時的熱穩(wěn)定性良好[21]。Wen 等利用變色栓菌來源漆酶在300～330 K 條件下具有較好的熱穩(wěn)定性[22]。本研究與文獻(xiàn)中的實驗規(guī)律一致，表明法尼醇誘導(dǎo)的變色栓菌來源漆酶也具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖2 變色栓菌來源漆酶的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of laccase from Trametes versicolor

2.4 pH 對酶活力影響

漆酶的活性中心是催化眾多底物的關(guān)鍵部位，而不同的pH 會通過使漆酶的活性部分或底物處于不同的解離狀態(tài)，或通過改變漆酶的空間結(jié)構(gòu)從而阻礙漆酶與底物的結(jié)合，從而影響漆酶的活性[23]。如圖3 所示，在酸性條件下，當(dāng)pH 由3.0增加至4.0 時，漆酶酶活力上升且達(dá)到最大值；當(dāng)pH 再增加至5.0 時，漆酶酶活力緩慢下降；而當(dāng)pH為7.0 時，漆酶相對酶活力迅速下降至40.69%。由此可知，在偏酸性條件下，更有利于漆酶活性中心與底物結(jié)合，漆酶的活性更高，而在pH 較高的條件下，漆酶與底物的結(jié)合受到阻礙，這可能是因為變色栓菌的最適生長pH 通常為弱酸性[24]，其產(chǎn)生的漆酶同樣對偏酸性的條件有一定的適應(yīng)性。Aydemir等的研究結(jié)果表明，變色栓菌來源漆酶在pH 為4.0時酶活力最高[25]。Wen 等發(fā)現(xiàn)變色栓菌來源漆酶在pH 為4.0 的條件下表現(xiàn)出最大活性[22]。這與本研究中添加法尼醇誘導(dǎo)的變色栓菌來源漆酶的最適pH一致。

圖3 pH 對漆酶酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on laccase activity

2.5 酶促反應(yīng)動力學(xué)

由圖4 可以看出，隨著漆酶與鄰苯二酚反應(yīng)的進(jìn)行，在0～8 min 時，產(chǎn)物濃度隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行而逐漸增大，幾乎成正比關(guān)系，在此之后，隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，產(chǎn)物濃度的增長趨勢逐漸減小，直到反應(yīng)30 min 后，漆酶與底物反應(yīng)達(dá)到飽和，產(chǎn)物濃度趨于穩(wěn)定。這證實了在初始0～8 min 內(nèi)測定酶活力，能夠更好地反映出變色栓菌漆酶酶活力的大小。

圖4 漆酶反應(yīng)溶液產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時間的變化關(guān)系Fig.4 Relationship between product concentration of laccase reaction concentration and reaction time

由圖5 可見，經(jīng)一階動力學(xué)方程與二階動力學(xué)方程擬合后，得到R2分別為0.969 4（見圖5（a））和0.970 9（見圖5（b）），證明所擬合的曲線能夠反映產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時間的關(guān)系，同時，Y1（見圖5（a））和Y2（見圖5（b））與反應(yīng)時間呈較好的線性關(guān)系。

圖5 一階動力學(xué)分析和二階動力學(xué)分析Fig.5 First-order kinetic analysis and second -order kinetic analysis

另一方面，Km即米氏常數(shù)，是酶促反應(yīng)的一個重要參數(shù)，反映了酶與底物之間親和力的強(qiáng)度，Km越大，表明漆酶與底物之間親和力越弱，Km越小，表明漆酶與底物之間親和力越強(qiáng)。由圖6 所示，根據(jù)米氏方程（見公式（5）），利用雙倒數(shù)法，將得到的坐標(biāo)擬合得到米氏常數(shù)Km為4.69 mmol/L，Vmax為0.059 mmol/（L·min），經(jīng)擬合，漆酶對底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)方程為：

圖6 變色栓菌來源漆酶的Km 測定Fig.6 Determination of Km value of laccase from Trametes versicolor

式中：y 為漆酶與底物反應(yīng)速率的倒數(shù)，（L·min）/mmol；x 為鄰苯二酚濃度的倒數(shù)，L/mmol。

其中R2為0.991 3，表明該方程擬合度較好，能夠反映變色栓菌來源漆酶催化過程中速率的變化。

2.6 漆酶對染料脫色性能的研究

作者以偶氮類染料伊文思藍(lán)、鉻黑T 以及酸性染料剛果紅為研究對象，探究了變色栓菌漆酶對不同染料的脫色性能。漆酶對3 種染料的光譜掃描結(jié)果如圖7 所示，可以在各染料最大吸收波長附近觀察到特征吸收峰，伊文思藍(lán)、剛果紅、鉻黑T 的特征吸收波長分別為600、555、506 nm。

圖7 伊文思藍(lán)、剛果紅和鉻黑T 的可見吸收光譜圖Fig.7 Spectrogram of evans blue，congo red and eriochrome black T

如圖8 所示，隨著處理時間的增長，脫色率逐漸上升。伊文思藍(lán)和鉻黑T 在前2 h 脫色率提高較快，2～28 h 脫色率變化較為緩慢，其中伊文思藍(lán)的脫色效果最佳，處理時間2 h 時，脫色率為78.01%，當(dāng)時間增加到28 h 時，脫色率為86.30%。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，漆酶能夠氧化伊文思藍(lán)中的偶氮基團(tuán)進(jìn)而降解伊文思藍(lán)，從而實現(xiàn)染料脫色[26]。Zhang 等利用變色栓菌來源的漆酶進(jìn)行伊文思藍(lán)脫色實驗，發(fā)現(xiàn)在pH 為4.6、溫度為40 ℃的條件下，反應(yīng)12 h后，脫色率為82.8%[27]。本研究中采用法尼醇誘導(dǎo)變色栓菌發(fā)酵生產(chǎn)的漆酶，對伊文思藍(lán)也表現(xiàn)出了良好的脫色性能，在pH 為4.0、溫度為25 ℃的條件下反應(yīng)12 h，脫色率為83.34%，略高于文獻(xiàn)報道的相關(guān)數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果還表明，漆酶對剛果紅的脫色效果較差，處理28 h 后，脫色率僅為35.67%。漆酶的氧化還原電位在染料脫色中起著至關(guān)重要的作用，由于染料結(jié)構(gòu)的不均一性會在一定程度上影響染料的分子密度從而改變氧化還原電位，因此這可能是導(dǎo)致漆酶對酸性染料（如剛果紅）降解速率不理想的原因[28]。因此，變色栓菌來源漆酶對偶氮類染料（如伊文思藍(lán)、鉻黑T）降解效率較高，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。

圖8 漆酶對伊文思藍(lán)、鉻黑T、剛果紅3 種染料的脫色率Fig.8 Decolorization rates of evans blue，congo red and eriochrome black T by laccase

在其他相關(guān)研究中，有研究者發(fā)現(xiàn)將漆酶固定在載體上，可以有效提高漆酶對蒽醌類染料的脫色能力[27，29]，這將為下一階段探索提高漆酶脫色性能的方法和拓寬漆酶在食品、化工和紡織等行業(yè)中的應(yīng)用提供技術(shù)準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié)語

通過添加法尼醇作為誘導(dǎo)劑提高了變色栓菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的酶活力和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，分別達(dá)到（161.37±1.58）U/L 和（29.19±1.30）mg/L。進(jìn)一步通過單因素實驗探究了用法尼醇誘導(dǎo)變色栓菌產(chǎn)漆酶的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，添加法尼醇誘導(dǎo)的變色栓菌發(fā)酵生產(chǎn)的漆酶，其酶學(xué)性質(zhì)并未發(fā)生改變，在反應(yīng)溫度為40 ℃、pH 為4.0 時，漆酶活性最高，且在25～55 ℃時熱穩(wěn)定性較好。在酶促反應(yīng)動力學(xué)研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了變色栓菌來源漆酶在染料脫色方面具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛力，對伊文思藍(lán)、鉻黑T、剛果紅3 種染料都表現(xiàn)出了一定的脫色效果，其中對伊文思藍(lán)的脫色效果最好，脫色率2 h內(nèi)可以達(dá)到78.01%。本研究對深入探索法尼醇刺激變色栓菌所產(chǎn)漆酶脫色性能的機(jī)制有著重要的研究意義，并為進(jìn)一步拓寬漆酶在食品、化工和紡織等行業(yè)中的應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。