趙天宇，楊勝男，潘 穎，王 佳

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春130033)

卵巢癌(ovarian cancer)為婦科三大惡性腫瘤之一，其病死率為女性生殖道惡性腫瘤之首，且呈逐年上升的趨勢[1]。卵巢惡性腫瘤包括多種病理類型，其中約80%為上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)。由于卵巢位于盆腔深處，其病變早期時往往沒有特異的臨床癥狀，而出現(xiàn)癥狀時70%的患者已處于晚期。據(jù)統(tǒng)計，早期卵巢癌患者治療后5年生存率可高達90%，而晚期卵巢癌5年生存率僅為30%-40%[2]。目前，人們對這種疾病的早期進展知之甚少[3]，且現(xiàn)有的技術無法達到準確診斷早期卵巢癌的要求。組織病理學檢查一直是確診卵巢癌的唯一“金標準”，但由于卵巢癌早期發(fā)病隱匿，且組織病理學為有創(chuàng)性檢查，因此不能作為早期卵巢癌篩查的常規(guī)方法[4-5]。多年來，血清生物標志物CA125一直是關注的重點，此后還評估了其他標志物的組合[6-7]。然而這些標志物的敏感性和特異性相對較差，聯(lián)合影像學手段如B超、CT及MRI等，仍沒有達到檢測出早期卵巢癌或癌前病變所需的敏感性[8-9]。因此，找到靈敏度與特異性均較高的卵巢癌早期診斷方法，對于降低患者的死亡率、改善預后有重要意義。

近年來，光學顯微成像技術越來越多地用于生物醫(yī)學研究，在癌癥的病理診斷、藥物效果、神經(jīng)疾病等方面已經(jīng)取得了一系列較好的研究成果[10]。光學顯微成像技術作為腫瘤檢測的主要方法之一，具有諸多優(yōu)勢，包括實時監(jiān)測、無損、非侵入性。通過基于成像的篩選，盡可能地實現(xiàn)癌癥早期診斷及治療來達到降低某些癌癥死亡率的目的[11]。現(xiàn)就光學顯微成像技術在卵巢癌早期診斷上的應用研究進展進行綜述，本文介紹的光學顯微成像技術主要是二次諧波(Second Harmonic Generation,SHG)、拉曼光譜(Raman Spectroscopy，RS)。

1 二次諧波

1.1 SHG的發(fā)生、發(fā)展1961年，F(xiàn)ranken[12]等人在石英晶體上首次發(fā)現(xiàn)了SHG，從而誕生了非線性光學。1971年，F(xiàn)ine和Hansen在生物組織中首次檢測到內(nèi)源性SHG信號[13]。自此，人們開始廣泛研究生物組織中的內(nèi)源性SHG信號，這一發(fā)現(xiàn)為組織結構信息的獲取提供了新的思路。1896年SHG成像通過對鼠尾肌腱成像確定了膠原纖維的方向[14-15]，從此在生物醫(yī)學領域，非線性光學技術作為一種新興技術被廣泛研究。近年來，SHG顯微鏡已成為一種用于纖維可視化的新型成像技術[16]。

1.2 SHG的成像特性SHG成像具有以下特性：①高空間分辨率和高成像深度[17]；②SHG信號較獨立，干擾性?。虎跾HG為生物組織內(nèi)原發(fā)性信號，樣品成像無需染料標記，是一種理想的非侵入生物活體成像方法；④SHG光源對樣品的穿透性強、損傷??；⑤SHG通過反映某些結構變化特性[18-20]，可以為疾病的診斷和治療提供依據(jù)。

大量研究結果表明，測量樣品中SHG信號的偏振依賴性，可獲得組織內(nèi)膠原蛋白的排列取向，掌握正常組織中結構的排列規(guī)則，進而研究異常組織中膠原蛋白結構的排列推斷其疾病狀態(tài)[21-22]。

1.3 SHG成像在卵巢癌診斷上的應用研究進展癌癥的發(fā)生、進展與腫瘤微環(huán)境中細胞外基質(ECM)的重塑有著密切相關性[23]。重塑可以表現(xiàn)為現(xiàn)有纖維的重新排列，也可表現(xiàn)為新膠原蛋白沉積增加，這些改變對幾種上皮性腫瘤的起始和進展是至關重要的[24]，所以，探究ECM成分和結構的改變可能會為檢測微小腫瘤或癌前病變提供更有價值的信息。例如，卵巢癌中幾種蛋白酶(如MMP2、MMP9和UPa)的上調與侵襲/轉移有關，它們通過降解基底膜和/或基質發(fā)揮作用[25]。腫瘤基質細胞的變化可以引起腫瘤細胞發(fā)生一連串的變化，從而產(chǎn)生更具侵襲性的腫瘤細胞[26-27]。研究者認為，腫瘤發(fā)病和進展相關的基質變化通常是疾病過渡期的驅動因素和標志物，ECM的主要成分是膠原蛋白，進一步研究膠原蛋白的特異性顯微成像模式(如SHG成像顯微鏡)是有利的，SHG成像顯微鏡技術已被用來觀察幾種癌癥(包括卵巢癌)以及其它以膠原結構改變?yōu)樘卣鞯募膊?如纖維化和結締組織疾病)的膠原結構，對ECM中膠原蛋白結構的“可視化”有著極大的敏感性和特異性[28]。

2007年Kirkpatrick[29]等人運用SHG結合雙光子激發(fā)熒光(2PEF)技術評估卵巢上皮細胞和底層基質，通過觀察膠原蛋白結構的變化和上皮細胞的氧化還原反應，從光學特征角度區(qū)分正常卵巢組織和卵巢癌組織。此外，該實驗還比較了高風險患者(基于他們的個人/家族癌癥史)的卵巢組織，表現(xiàn)出高度可變的細胞氧化還原比例和膠原蛋白結構，由此推測有向癌癥樣本發(fā)展的趨勢。2010年，Nadiarnykh[30]等人使用三維SHG成像測量和體積光學參數(shù)測量，量化了人類正常卵巢和惡性卵巢腫瘤中卵巢ECM形態(tài)學變化。結果發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤組織中有顯著差異，SHG發(fā)射屬性(方向性和相對強度)和批量光學參數(shù)與膠原蛋白組裝的變化一致。同時該實驗提出，癌癥中膠原蛋白的組裝可能是由新合成的膠原蛋白組成的，而不是對現(xiàn)有膠原蛋白的修改。2016年，Wen[31]等人運用SHG成像結合局部分析算法來探測快速變化的纖維形態(tài)，用來區(qū)分正常卵巢組織和高級別惡性卵巢組織以及其卵巢癌亞型。2019年，Rentchler[32]等人將漿液性輸卵管上皮內(nèi)癌(STICs)、卵巢高級別腫瘤和輸卵管正常區(qū)域組織的SHG成像結合起來，在卵巢高級別腫瘤和其他組織之間的分類中實現(xiàn)了接近100%的準確率，其中STICs和正常區(qū)域組織的區(qū)分準確率約為75%。他們還發(fā)現(xiàn)在STICs和卵巢高級別腫瘤中的膠原蛋白都有類似的形態(tài)，進一步證實了這些部位之間可能發(fā)生轉移。該研究提供了一種新的分類方法，同時也量化了疾病的結構變化，這可能為疾病的轉移提供了新的見解。2021年，Gant[33]等人基于SHG圖像紋理和特征區(qū)分正常卵巢輸卵管組織及高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)組織，同時他們對正常組織和HGSOC組織進行質譜分析，通過蛋白質組學分析確定了HGSOC存在單一α鏈的下調(包括膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ)，這為早期卵巢癌的ECM重塑提供了新的見解，并建議將二次諧波顯微鏡和質譜儀聯(lián)合使用作為一種新的診斷方法。此外，該項實驗還有額外擴展，觀察膠原纖維形態(tài)的早期變化是否隨p53分子表達而被檢測到，結果提示對于HGSOC的早期轉移，研究前期病變[34](p53和STICs的改變)非常有價值。

SHG成像作為一種無損的高分辨層析成像方法，其信號反映的是組織結構變化特性，當腫瘤細胞發(fā)生微觀改變時，可直接觀察到組織不同層面的變化[35]。SHG成像技術有望成為卵巢癌早期診斷的一種有效手段，以期發(fā)展為適用于人體內(nèi)成像的光學診斷方法，進行實時、無創(chuàng)、動態(tài)成像，成為真正地“光學活檢”。

2 拉曼光譜

2.1 RS的發(fā)生、發(fā)展1928年，印度科學家拉曼觀察單色光通過液態(tài)苯和四氯化碳溶液時發(fā)現(xiàn)了拉曼散射現(xiàn)象(Raman scattering)。發(fā)生拉曼散射后，光的波長或顏色會發(fā)生變化，這是由散射物質的化學結構決定的。不同分子鍵(包括單一的化學鍵和數(shù)個化學鍵組成的基團)振動產(chǎn)生的拉曼散射光波長位置和強度不同，由此組成了拉曼光譜(Raman spectroscopy)。物質中分子鍵不同的振動頻率有且只有一個獨特的拉曼光譜[36]，這就是在拉曼光譜圖中分子的“化學指紋”。

早期拉曼技術發(fā)展較緩慢，直至20世紀60年代，紅寶石激光器的問世成為拉曼光譜的理想激發(fā)光源，這快速推動了拉曼技術的研究。1974年，F(xiàn)leichmann[37]等人發(fā)現(xiàn)吡啶分子吸附于銀電極表面后拉曼光譜信號較前極大增強[38]，由此提出了表面增強拉曼散射(Surface-Enhanced Raman scattering,SERS)現(xiàn)象。此后，越來越多的拉曼信號增強技術被研發(fā)，目前常用的拉曼信號增強技術主要包括表面增強拉曼光譜技術(SERS)[39]、共振拉曼光譜技術(RRS)[40-41]、共聚焦拉曼光譜技術(CRM)[42]、受激拉曼光譜技術(SRS)[43-44]。有研究報道，拉曼技術在腫瘤疾病篩查上有巨大潛力，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌等[45-46]。利用光譜儀獲取樣本的拉曼光譜，可以是新鮮的樣本組織，也可以是儲存未加工的樣本，對光譜信息分析后可區(qū)分樣品類型與性質。

2.2 RS成像特點拉曼光譜技術成像有以下特點[47-48]：①樣品無需預處理，是一種無損傷的成像方法。②成像簡便，對樣品有更高的靈敏度和特異性，可反映生物組織病變前后核酸、脂質、蛋白質等諸多生物代謝產(chǎn)物含量及精細結構的動態(tài)變化。③與其他醫(yī)學成像技術(如超聲、CT、MRI等)相比，拉曼成像技術相對分辨率更高、時效更快，在細胞代謝的動態(tài)監(jiān)測、細胞成分分析和分類以及疾病的診斷和治療等方面有巨大應用潛力。

2.3 RS技術在卵巢癌診斷的應用進展癌癥的演變，最早是細胞內(nèi)代謝水平和分子結構的變化，而腫瘤標志物、影像學方法等都無法早期對癌變組織診斷，組織病理學為有創(chuàng)性診斷，不適合作為疾病早期篩查的常規(guī)方法。拉曼光譜可以靈敏地檢測到癌變細胞與正常細胞在分子水平上的組成差異，具有區(qū)分癌組織的能力，為疾病的發(fā)病機制和進展提供重要信息。

2005年Krishna[49]等人對來自相同卵巢的正常組織、福爾馬林固定的惡性組織及石蠟包埋和脫蠟切片處理后的惡性組織進行拉曼光譜成像。結果表明，正常卵巢組織和處理后的惡性卵巢組織在拉曼光譜的輪廓上仍表現(xiàn)出顯著差異，原則上可以利用拉曼光譜來區(qū)分組織類型。2018年鹿紹宇[50]等人運用共聚焦顯微拉曼光譜技術結合PLS-DA模型，實現(xiàn)85.2%的卵巢癌診斷準確率，對比CA125和超聲診拉曼光譜技術結合數(shù)據(jù)模型的檢測方法對卵巢癌的診斷更為理想。2022年David Sandryne[51]等人開發(fā)了一種選擇算法模型，該模型僅使用8個拉曼光譜波段即可檢測出卵巢癌。另外，當癌細胞或代謝物進入血液循環(huán)時可引起血液成分及其微環(huán)境發(fā)生改變。對癌癥患者及正常人的血清成分進行拉曼光譜檢測，分析兩者成分上的差異也可做為早期癌癥診斷的一種方法[52-53]。2012年葉慧帆[54]等人采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀對卵巢癌患者和健康人的血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)在約1010、1158、1283、1520、1646、2307和2661 cm-17個拉曼頻移附近，健康人血清的拉曼光譜峰值明顯高于卵巢癌患者，這為從血清的拉曼光譜強度上初步區(qū)分卵巢癌提供了更多證據(jù)。

據(jù)報道，超過160個蛋白質在卵巢癌中有差異表達，被上調的蛋白質如CA-125、CA19-9、HE4等；被下調的如表皮生長因子受體(EGFR)和載脂蛋白A1等[55]。2018年Paraskevaidi[56]等人對卵巢癌患者和良性婦科病患者的血漿樣本進行自發(fā)拉曼光譜和SERS成像，兩種技術都能檢測到五種光譜生物標志物，并可作為指示癌變的標志物使用。2019年談芳君[40]等人運用激光拉曼光譜儀檢測健康成人、卵巢癌患者術前及術后3天的血清，研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的血清在幾個特定波長處的拉曼光譜峰值較正常人顯著增高，且卵巢癌患者術后3天的幾個特定血清拉曼光譜的峰值較術前明顯下降，這一特征對于卵巢癌的早期診斷具有重要價值。

RS成像技術無需對組織標記或染色即可獲得與組織特定分子結構相關的光譜信息，對細胞內(nèi)的DNA、脂質和蛋白質等生化成分定量分析，可將細胞的表型、基因型和細胞所處的生理狀態(tài)完整反映出來，使豐富的細胞分子信息“可視化”。拉曼光譜技術作為一種無損、快捷、簡便的分析技術，已證實可在血清標志物、蛋白質、核酸等方面區(qū)分卵巢癌，有望成為一種卵巢癌早期篩查的有效手段。

3 小結

迄今為止，人們?nèi)匀粵]有掌握準確的卵巢癌早期診斷技術，尋找特異度與靈敏度較好的卵巢癌早期診斷方法，對于提高患者的生存率、改善預后有重要意義。光學顯微成像技術作為腫瘤檢測的方法有實時監(jiān)測、非侵入性、快速等優(yōu)勢。目前光學顯微技術應用于臨床疾病診斷仍有許多限制，比如：①原發(fā)性SHG信號的產(chǎn)生要求樣本為非中心對稱結構，樣本的廣泛成像難以獲得。②拉曼光譜診斷在腫瘤良惡性鑒別上有較大潛力，但對于腫瘤疾病的精準診斷仍遠遠不夠，運用拉曼光譜成像技術實現(xiàn)腫瘤疾病的分類及分型診斷是未來研究的重點。