楊 慧，李玉壬，吳神群，陳春鳳，楊曉萍*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

柑橘（Citrus reticulateBlanco.）為蕓香科柑橘屬植物[1]，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國內(nèi)各地區(qū)廣泛種植。一般情況下柑橘所開的花絕大部分在開花期和果實(shí)發(fā)育過程中脫落，坐果率僅占總花量的1%～5%。由于柑橘花期花量大、時間短，開花過程會消耗樹體大量養(yǎng)分，因此多進(jìn)行疏花處理，以減少花量、節(jié)省樹體營養(yǎng)、提高坐果率。然而，目前疏花所得柑橘花多被直接遺棄，未能得到有效利用，這導(dǎo)致了柑橘花資源的大量浪費(fèi)。柑橘花含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素[2]等豐富的營養(yǎng)成分，具有健胃消食、止咳化痰和鎮(zhèn)靜安神等功效，且香氣輕淡、纖巧、清新[3]是一種優(yōu)質(zhì)的花茶資源，可用于加工柑橘花茶。

傳統(tǒng)的花茶加工多為直接對鮮花進(jìn)行干燥處理，但近年來研究表明，對鮮花進(jìn)行殺青處理能夠促進(jìn)內(nèi)含物的轉(zhuǎn)換，明顯地改善花茶感官品質(zhì)[4-5]，黃艷等[6]研究發(fā)現(xiàn)對茶樹花進(jìn)行殺青處理后，高溫環(huán)境下發(fā)生的美拉德反應(yīng)能夠使茶樹花茶產(chǎn)生特有的水煮玉米香，且殺青處理還能有效地提高化學(xué)成分含量。目前常見的花茶種類有枇杷花茶、菊花茶、桂花茶等[7]，關(guān)于柑橘花茶加工工藝的研究較少。本研究通過不同殺青工藝制作柑橘花茶，綜合比較感官品質(zhì)、化學(xué)成分、揮發(fā)性物質(zhì)及抗氧化活性確定最佳殺青方式，以期豐富花茶種類，提高柑橘花的利用度，為花茶加工工藝的優(yōu)化及新產(chǎn)品的研發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溫州蜜柑花采摘自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘園。

癸酸乙酯和C7～C40正構(gòu)烷烴（均為色譜純）購自美國Sigma公司；其他材料（均為分析純）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY120型電子天平 日本島津制作所；HH-6型恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LD5-2A型離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；UV-2450型分光光度計(jì) 美國Labconco公司；TRAce1300-ISQ7000-ODP3氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀 美國Agilent公司；手動固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 柑橘花茶制備的基本工藝流程

鮮花采摘后攤放在陰涼處，晾干表面水分，經(jīng)殺青處理后，將花干燥即得柑橘花茶。

1.3.2 殺青方式的篩選

分別采用蒸汽殺青、微波殺青、燙漂殺青3 種方式（每種殺青方式分別處理30、60、90 s）對柑橘花進(jìn)行殺青處理，主要工藝參數(shù)如下：投樣量均為250 g，蒸汽殺青時柑橘花溫度為85～95 ℃；微波殺青功率為490 W；燙漂殺青沸水量為7～8 L。經(jīng)80 ℃熱風(fēng)干燥后制得柑橘花茶，通過感官審評篩選各方式最佳殺青時間，再將柑橘花按各自最佳殺青時間處理后制備花茶，經(jīng)感官審評以及化學(xué)成分、抗氧化活性和揮發(fā)性組分分析，確定最佳殺青方式。

1.3.3 感官審評

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[8]進(jìn)行感官審評。稱取柑橘花茶5 g，加150 mL沸水加蓋浸泡5 min，倒出茶湯，由8 名專業(yè)人士進(jìn)行審評?？偡謪⒄詹枞~審評加權(quán)法，按照外形20%、湯色5%、香氣35%、滋味30%以及葉底10%進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

參照文獻(xiàn)[9]的方法，采用福林-酚法測定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，茚三酮比色法測定游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，蒽酮比色法測定可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，三氯化鋁比色法測定黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 抗氧化活性測定

總抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）按照Benzie等[10]的方法測定；2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力按照Thaipong等[11]的方法測定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力按照Blois等[12]的方法測定。

1.3.6 揮發(fā)性組分測定

頂空（head space，HS）-SPME處理：將50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取頭于GC-MS的進(jìn)樣口250 ℃老化1 h。稱取一定量粉碎后的樣品于30 mL的頂空瓶中，加入5 mL沸水與2.5 μL內(nèi)標(biāo)癸酸乙酯（0.1 μL/mL），密閉瓶口。頂空瓶于60 ℃水浴中平衡10 min。再將萃取頭通過SPME手持器插入到頂空瓶中，推出纖維頭吸附50 min。收回纖維頭，取出SPME手持器，插入GC儀進(jìn)樣口中，解吸附5 min。

GC條件：進(jìn)樣口溫度240 ℃，傳輸線溫度230 ℃，載氣為高純度氦氣，流速1.0 mL/min。升溫程序：初始柱溫40 ℃，保持2 min；以3 ℃/min升至85 ℃，保持2 min；以2 ℃/min升至110 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至160 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min升至220 ℃，保持5 min；不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍設(shè)置為m/z50～650。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺青方式時間的篩選

由圖1可知，同一種殺青方式處理不同時間使柑橘花茶的感官品質(zhì)產(chǎn)生明顯差異。蒸汽殺青與微波殺青處理的柑橘花茶感官審評得分隨時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在處理60 s時達(dá)到最大值，燙漂殺青處理的柑橘花茶感官審評得分隨時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，處理30 s時達(dá)到最大值。造成上述現(xiàn)象的原因是蒸汽殺青與燙漂殺青時間過短，形成茶葉必要品質(zhì)特征的濕熱作用沒有得到充分進(jìn)行，并且低沸點(diǎn)的香氣物質(zhì)揮發(fā)程度不夠，沒有達(dá)到通過殺青形成茶葉滋味、香氣等基本品質(zhì)特征的目的[13]，但時間過長則造成內(nèi)含物流失過多，滋味寡淡；微波殺青時間過短會造成內(nèi)部溫度低，無法破壞鮮花中的酶活性，導(dǎo)致湯色欠明亮、青草氣重、滋味較苦澀，殺青時間過長則導(dǎo)致部分鮮花內(nèi)部色素被破壞，同時花瓣皺縮，造成茶湯與葉底色澤暗黃，香氣、滋味均呈現(xiàn)高火味與焦糊味[14]。綜上，柑橘花分別經(jīng)過蒸汽殺青60 s、微波殺青60 s或燙漂殺青30 s處理后所制花茶質(zhì)量品質(zhì)較佳。

圖1 柑橘花茶不同殺青處理時間的篩選Fig.1 Selection of optimal fixation time for citrus flower tea made using different fixation methods

2.2 不同殺青方式對柑橘花茶感官品質(zhì)的影響

由表1可知，殺青處理后的花茶感官品質(zhì)明顯優(yōu)于未殺青處理的品質(zhì)，這是因?yàn)樵跓犸L(fēng)烘干過程中升溫速度較慢，酶的活性破壞時間較長[15]，鮮花表面的色素發(fā)生氧化反應(yīng)，使得其外表呈現(xiàn)黃棕色，茶湯欠明亮，且柑橘花香不夠明顯，由此可知，殺青處理更適用于柑橘花茶的加工。感官審評結(jié)果顯示殺青方式對柑橘花茶的感官品質(zhì)影響較大，柑橘花經(jīng)微波殺青處理所制花茶的外形維持較好，花香鮮濃持久，茶湯柑橘味濃醇，感官審評得分最高，這可能是因?yàn)槲⒉⑶噙^程中鮮花本身并未與外界環(huán)境接觸，且微波升溫迅速，水分快速蒸發(fā)，鮮花中所含低沸點(diǎn)芳香物質(zhì)也隨之揮發(fā)消失，能夠較好地改善柑橘花茶的香氣[16]。蒸汽殺青也能夠較好地維持花型，同時當(dāng)鮮花處于濕熱的環(huán)境下，香氣物質(zhì)中水溶性成分得到較多保留，但青草氣略重[17]。燙漂殺青時，由于鮮花置于沸水中，會導(dǎo)致部分可溶性成分溶出，且鮮花在沸水中受外力作用，使花瓣易脫離，外形被破壞；此外，柑橘花含有的香氣物質(zhì)在沸水中被過早地固定，造成香氣的前體物質(zhì)不能充分地轉(zhuǎn)換，對柑橘花茶香氣影響較大[18]。

表1 不同殺青處理的柑橘花茶感官審評結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of citrus flower tea made using different fixation methods

2.3 不同殺青方式對柑橘花茶化學(xué)成分的影響

由表2可知，殺青方式能夠顯著影響柑橘花茶化學(xué)成分含量。微波殺青后，柑橘花茶中黃酮、可溶性糖以及多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)較其他組都有不同程度的上升，游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)則較蒸汽殺青組略有減少，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是微波殺青從鮮花內(nèi)部迅速升溫，使酶類瞬間失活，終止了酚類物質(zhì)的氧化[6]，有利于保存柑橘花茶中的酚類物質(zhì)?？扇苄蕴鞘腔ú杩诟懈侍鸬闹匾蛩豙19]，在3 種殺青處理過程中，微波殺青處理柑橘花茶中所含的可溶性糖含量也最高；蒸汽殺青后，柑橘花茶中除游離氨基酸含量較多，其余化學(xué)成分含量均較低，其原因可能是部分化學(xué)成分隨蒸汽散去，造成含量下降；燙漂殺青后，柑橘花茶所含的游離氨基酸以及可溶性糖的含量較其他組均呈現(xiàn)下降趨勢，這是部分化學(xué)成分在柑橘花與水接觸的過程中溶解在水中所致。

表2 不同殺青處理的柑橘花茶化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Contents of chemical components in citrus flower tea made using different fixation methods

2.4 不同殺青方式對柑橘花茶抗氧化活性的影響

如圖2所示，不同殺青的柑橘花茶均具有較強(qiáng)的FRAP以及ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力，微波殺青處理柑橘花茶的抗氧化活性明顯高于蒸汽殺青與燙漂殺青，對DPPH自由基的清除率達(dá)65.4%，F(xiàn)RAP為1.13 mmol/L。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是蒸汽殺青與燙漂殺青以水汽作為傳熱介質(zhì)，而微波殺青則是通過超高頻電磁波快速振蕩柑橘花內(nèi)各成分分子，使水分子之間相互碰撞、擠壓、摩擦、重新排列以達(dá)到快速升溫、鈍化酶活性的目的[14]，可保留柑橘花內(nèi)的有效抗氧化成分。由此可見，微波殺青制成的柑橘花茶抗氧化活性明顯優(yōu)于蒸汽殺青與燙漂殺青。

圖2 不同殺青處理的柑橘花茶抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of citrus flower tea made using different fixation methods

2.5 不同殺青方式對柑橘花茶揮發(fā)性組分的影響

2.5.1 柑橘花茶揮發(fā)性組分的種類

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS對3 種柑橘花茶中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定與分析，如表3所示，經(jīng)3 種殺青處理的柑橘花茶共鑒定出94 種揮發(fā)性化合物，根據(jù)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，柑橘花茶中所含揮發(fā)性物質(zhì)主要由萜烯類（48.82%）、醇類（26.47%）、醛類（11.96%）及醚類（5.88%）構(gòu)成。相關(guān)研究表明，柑橘屬的橙子、檸檬、柚子等的揮發(fā)性組分以萜烯類為主[20-22]，醛類是柑橘屬成熟過程中形成的一種次級代謝物，提供了柑橘的果香氣[23]，這些主要揮發(fā)性化合物構(gòu)成了柑橘花茶香氣的主要組分，這與Wang Jiatong等[23]研究結(jié)果一致。

表3 不同殺青處理的柑橘花茶揮發(fā)性組分種類Table 3 Types of volatile components in citrus flower tea made using different fixation methods

由圖3可知，不同殺青處理的花茶中揮發(fā)性物質(zhì)有明顯差異。3 種處理柑橘花茶共同含有35 種揮發(fā)性物質(zhì)；蒸汽殺青柑橘花茶共含有65 種，其特有化合物16 種；微波殺青柑橘花茶共含有82 種，其特有化合物25 種；燙漂殺青柑橘花茶共含有71 種，其特有化合物14 種。其中，微波殺青柑橘花茶含有最多揮發(fā)性物質(zhì)種類，其醇類（26.74%）、烴類（51.05%）及酮類（3.36%）相對含量高于其他兩種處理組；蒸汽殺青柑橘花茶的醚類（11.20%）相對含量最高，醛類（7.60%）、烴類（49.44%）及酮類（1.38%）相對含量最少；燙漂殺青柑橘花茶所含醛類（14.69%）高于其他兩種處理組，醇類（24.06%）與酚類（2.12%）相對含量最少。

圖3 不同殺青處理的柑橘花茶揮發(fā)性組分種類維恩圖Fig.3 Venn diagram of volatile components in citrus flower tea made using different fixation methods

2.5.2 柑橘花茶主要揮發(fā)性化合物分析結(jié)果

基于花茶中共測出的94 種揮發(fā)性組分，使用無監(jiān)督主成分分析方法對原始峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如圖4A所示，3 種殺青處理的柑橘花茶具有較為明顯的區(qū)域分布特征，能夠在主成分分析散點(diǎn)圖中各成一簇，可知不同殺青處理能夠明顯影響柑橘花茶揮發(fā)性物質(zhì)的組成。

圖4 柑橘花茶主要揮發(fā)性化合物分析Fig.4 Analysis of major volatile compounds in citrus flower tea

對94 種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行篩選，選擇相對含量大于1%的物質(zhì)進(jìn)行聚類熱圖分析，如圖4B所示，蒸汽殺青柑橘花茶中相對含量最多的化合物是β-欖香烯（6.97%），其次是松香芹醇（5.96%），微波殺青柑橘花茶中相對含量最多的是β-欖香烯（5.54%），其次是γ-松油烯（5.61%），燙漂殺青柑橘花茶中相對含量最多的是γ-松油烯（7.57%），其次是β-欖香烯（6.89%）。由此可見，β-欖香烯和γ-松油烯是3 種柑橘花茶中含量較高的化合物，均為萜烯類物質(zhì)，與Qi Heting等[24]研究結(jié)果一致。相關(guān)研究表明，萜烯類物質(zhì)是組成綠茶與柑橘花香氣的主要揮發(fā)性物質(zhì)[25-26]。張冬桃等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在相關(guān)酶的作用下，萜烯類物質(zhì)通過前體物質(zhì)（異戊二烯基焦磷酸和3,3-二甲基烯丙基焦磷酸）經(jīng)過兩條主要的生物合成代謝途徑形成，大多數(shù)具有花香、甜香及果香[27]。此外，醇類也是3 種柑橘花茶中含量較多的化合物，其中重要化合物為芳樟醇、橙花醇、松油醇及α-二氫萜品醇，芳樟醇在代謝過程中可以轉(zhuǎn)化為香葉醇進(jìn)行酶促異構(gòu)化[26]，具有較為溫和的甜花香，這些特征化合物是形成花茶中柑橘香的重要基礎(chǔ)。

2.5.3 柑橘花茶關(guān)鍵差異化合物分析結(jié)果

偏最小二乘-判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）是一種具有監(jiān)督的判別分析方法，被廣泛應(yīng)用于茶葉品質(zhì)的客觀評價(jià)[28]?？衫肞LS-DA的變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）圖量化變量對分類的貢獻(xiàn)度，找出影響分類的關(guān)鍵性差異化合物，一般認(rèn)為VIP＞1的物質(zhì)為分類貢獻(xiàn)度較大的變量。如表4所示，所獲得的正己醛、β-蒎烯、檜烯、甲基庚烯酮、檸檬烯、芳樟醇等28 種香氣差異化合物主要由醇類與烯類組成。在蒸汽殺青柑橘花茶中檢測出的差異揮發(fā)性物質(zhì)有鄰傘花烴（4.32%）與β-蒎烯（1.91%），β-蒎烯具有明顯的樹脂味及青味，由感官審定結(jié)果可知，蒸汽殺青的柑橘花茶相較于其他兩種的青味更為突出，因此β-蒎烯與鄰傘花烴可能是蒸汽殺青過程中青味形成的特征化合物；微波殺青柑橘花茶中檢測出的差異揮發(fā)性物質(zhì)有壬醛（1.53%）、甲基庚烯酮（1.00%）及(＋)-新二氫香芹醇（0.77%），壬醛、香芹醇已知具有新鮮的花香味[29]，可作為微波殺青過程中柑橘香形成的特征化合物；燙漂殺青柑橘花茶中未檢測出差異揮發(fā)性物質(zhì)，其特有揮發(fā)性物質(zhì)為蓽澄茄油烯醇（0.37%）、庚醛（0.26%）等，但未造成關(guān)鍵性差異，原因可能是相對含量較低。庚醛已知具有堅(jiān)果味以及青味[30]，可作為燙漂殺青過程中栗香形成的特征化合物。

表4 不同殺青處理柑橘花茶關(guān)鍵差異揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量Table 4 Relative contents of key differential volatile substances in citrus flower tea made using different fixation methods

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以溫州蜜柑花為原料，采用3 種殺青方式對柑橘花進(jìn)行加工，對得到的花茶進(jìn)行感官審評及化學(xué)指標(biāo)、抗氧化能力、揮發(fā)性組分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，微波殺青60 s的柑橘花茶綜合品質(zhì)最佳，該方式處理所得花茶口感豐富、橘香明顯、有回甘，且能較好地保留花茶中所含理化成分；同時，相比于蒸汽和燙漂殺青，微波殺青處理組的揮發(fā)性組分種類多、含量高，其中，具有花果香的壬醛、甲基庚烯酮及(＋)-新二氫香芹醇是關(guān)鍵差異揮發(fā)性物質(zhì)，微波殺青的特征性香氣物質(zhì)為吲哚、佛手柑醇以及壬醛，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是微波處理導(dǎo)致?lián)]發(fā)性組分分子結(jié)構(gòu)變化[31]，使得微波處理所制柑橘花茶香氣最佳。目前市場上柑橘花產(chǎn)品開發(fā)較單一，消費(fèi)市場疲軟，導(dǎo)致原料嚴(yán)重浪費(fèi)，花茶作為當(dāng)今食品飲料行業(yè)的熱門產(chǎn)品，是提高柑橘花利用率的最佳選擇之一。本研究對柑橘花茶的殺青工藝進(jìn)行探究，所得產(chǎn)品在口感上能夠滿足如今消費(fèi)者多樣化、個性化的需求，且改善了傳統(tǒng)茶葉的功能性成分，同時，微波殺青處理的柑橘花香氣特殊、濃郁宜人，所制花茶風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，可為柑橘花和茶葉的綜合開發(fā)提供參考。