馬永潔，李瑋琪，伍春婷，黃新惠，周昕榆，牙甫禮，2*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，云南大理 671000）

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）的發(fā)病率和病死率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類健康〔1〕。高脂血癥是心血管疾病的重要危險因素之一，可引起血栓形成等并發(fā)癥〔2〕。血小板作為一種無核血細(xì)胞，對高脂血癥中血栓形成和發(fā)展起重要作用〔3〕。凋亡作為程序性死亡，不僅發(fā)生在有核細(xì)胞中，也存在于無核的血小板中〔4〕。血小板凋亡可由各種刺激引起，包括化學(xué)因素（如凝血酶、膠原、過氧化氫、花生四烯酸、腎上腺素等）、機體高水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)（如高脂血癥、2 型糖尿病等）和物理因素（如高溫、高剪切力等）等〔3〕。研究證實，高脂血癥患者循環(huán)血液中的氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）可誘導(dǎo)血小板凋亡，進(jìn)而參與血栓形成〔5〕。血小板凋亡主要依賴Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白調(diào)控的內(nèi)源性途徑〔3，6〕。血小板受到凋亡刺激后，會發(fā)生一系列的凋亡事件，包括線粒體膜電位（mitochondrial membrane protential，Δψm）發(fā)生去極化，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔形成以及Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白發(fā)生表達(dá)活化并移位到線粒體，最后細(xì)胞色素c 從線粒體的膜間隙釋放到胞漿中，進(jìn)而激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-3 和Caspase-9，引起血小板磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的暴露，最終導(dǎo)致血小板凋亡〔7〕。其中Δψm的去極化在內(nèi)源性凋亡途徑中發(fā)揮重要作用〔8〕。研究〔5〕證實，高脂血癥中ox-LDL 誘導(dǎo)血小板發(fā)生凋亡的機制主要是激活Src/Syk/ROS 信號通路。越來越多的研究證明，血小板凋亡在心血管疾病的進(jìn)展中起著重要作用，抑制血小板凋亡已經(jīng)成為改善高脂血癥中血栓形成的重要措施之一〔9〕。

三七是五加科人參屬中的一種多年直立草本植物。三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是從三七根中提取出來的最主要的藥用成分，具有諸多藥理作用，如抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等生物學(xué)活性〔10〕。其在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，例如以PNS 作為主要成分的血栓通注射液常用來治療血栓性疾病〔11〕。研究〔12-13〕表明，PNS 在體外可抑制生理性激動劑如凝血酶等誘導(dǎo)的血小板聚集和活化，但是PNS 調(diào)控ox-LDL 誘導(dǎo)血小板凋亡的作用尚未見報道，本研究旨在探討PNS 是否可以抑制ox-LDL 誘導(dǎo)血小板凋亡及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（英國Abcam 公司）；JC-1（美國Enzo Life Sciences 公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PE-Annexin V 檢測試劑盒（美國eBioscience 公司）；PNS 粉末（純度>98%，北京索萊寶科技公司）；ox-LDL（廣州奕源生物科技有限公司）；一抗phospho-Src（Tyr416，武漢愛博泰克（Abclonal）生物科技有限公司）；一抗phospho-Syk（Tyr323，美國Affinity Bioscience 公司）；一抗cleaved Caspase-3、cleaved Casase-9、β-actin、GAPDH 以及二抗羊抗兔（美國Bioworld Technology 公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）（德國Biofroxx 公司）。

1.2 主要儀器CytoFlex 流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；低溫高速離心機（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；低溫冰箱（中國青島海爾有限公司）；多功能熒光酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；多色熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）；漩渦混合器（上海馳康電子有限公司）；小型垂直電泳槽（美國Bio-Rad 公司）；電泳儀電源（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 研究對象的招募 招募20 名研究對象，年齡25～40 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①目前或曾經(jīng)患有CVDs 或由免疫功能缺陷引起的疾病者；②有超過半年以上的吸煙史和飲酒史者；③曾經(jīng)于2 周內(nèi)服用過的藥物能夠顯著影響血小板功能者。所有志愿者均遵循自愿原則，并簽署書面知情同意書。本研究完全按照《赫爾辛基宣言》相關(guān)準(zhǔn)則進(jìn)行，并已通過大理大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3.2 健康人血液的采集及純化血小板的制備抽取肘靜脈全血20 mL 注入含有枸櫞酸鈉的真空抗凝管中，然后在離心力150 g 和22 ℃的條件下離心20 min，小心吸取上清液中上層3/4 的液體即可得到富血小板血漿。富血小板血漿在離心力800 g和22 ℃的條件下離心10 min，吸棄上清液后用緩沖液（12 mmol/L 碳酸氫鈉、137 mmol/L 氯化鈉、0.34 mmol/L 磷酸氫二鈉、1 mmol/L 氯化鎂、2 mmol/L 氯化鉀、5.5 mmol/L 葡萄糖、5 mmol/L 乙磺酸，pH 7.4）重懸血小板，可得到純化血小板（血小板純度>98%），置于37 ℃恒溫箱中保存?zhèn)溆谩?4-15〕。

1.3.3 檢測PNS 對血小板細(xì)胞毒性的影響 將健康人純化血小板分別與10%SDS（陽性對照組）、0.05%DMSO（溶劑對照組）以及1、10、50、100、150、200、250、300 μg/mL 的PNS（PNS 組）共同孵育40 min 后，離心（12 000 g，22 ℃，5 min）。當(dāng)血小板發(fā)生凋亡或由各種刺激造成的血小板膜結(jié)構(gòu)破壞會引起胞漿內(nèi)LDH 釋放到上清液里，通過檢測胞漿釋放到上清液中的LDH 含量（即血小板LDH 漏出量），評價細(xì)胞毒性。使用酶標(biāo)儀在波長490 nm 處測定其吸光度值，作為評價血小板釋放的LDH 含量。用10%SDS 刺激血小板釋放全部LDH（即血小板釋放的LDH 總量）。血小板LDH 漏出率（%）=（血小板LDH 漏出量/血小板釋放的LDH 總量）×100%〔16〕。

1.3.4 后續(xù)實驗分組 后續(xù)實驗分組包括靜息組：對血小板不作任何干預(yù)處理；對照組：加入溶劑對照（0.05%DMSO）；PNS 低劑量組：含1 μg/mL PNS；PNS 中劑量組：含10 μg/mL PNS；PNS 高劑量組：含100 μg/mL PNS。其中對照組、PNS 各劑量組的血小板均經(jīng)ox-LDL 處理。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板Δψm將純化血小板分別與不同濃度的PNS（1、10、100 μg/mL）共同孵育40 min 后，用50 μg/mL ox-LDL 刺激血小板60 min，同時加入1 mmol/L 的CaCl2溶液，然后向每管血小板懸濁液中加入終濃度為1 μg/mL 的JC-1 染色工作液，并在37 ℃避光孵育20 min 后，加入500 μL的JC-1 染色緩沖液，立即上機檢測。根據(jù)JC-1 單體及復(fù)合物濃度變化，使用常規(guī)的觀察紅色熒光（FL-3）和綠色熒光（FL-1）的通道分別檢測血小板線粒體JC-1 聚合物和JC-1 單體的百分比，從而確定血小板Δψm的變化〔14-15，17〕。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板表面PS 暴露水平用PNS（1、10、100 μg/mL）、ox-LDL（50 μg/mL）處理純化血小板后，避光加入終濃度為1 mmol/L 的CaCl2溶液以及Annexin V 抗體，迅速彈勻后在室溫下避光孵育15 min，加入200 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），立即使用CytoFlex 流式細(xì)胞儀檢測血小板表面PS 的暴露水平〔14-15，17〕。

1.3.7 血小板總ROS 水平和超氧化物水平的測定將純化血小板分別與不同濃度的PNS（1、10、100 μg/mL）共同孵育40 min 后，離心（12 000 g，5 min，4 ℃），棄除上清液，重懸血小板，與50 μg/mL ox-LDL 共同孵育60 min，然后加入20 μmol/L 的氧化應(yīng)激檢測液和20 μmol/L 的超氧化物檢測試劑液，避光孵育，離心（12 000 g，5 min，4 ℃），棄除上清液后再次重懸血小板，用PBS（pH 7.0）對血小板進(jìn)行洗滌。最后在Ex/Em=490 nm/525 nm 和Ex/Em=550 nm/620 nm 條件下測定熒光強度，檢測細(xì)胞內(nèi)總ROS 水平和超氧化物水平〔16〕。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá) 將純化血小板分別與不同濃度的PNS（1、10、100 μg/mL）共同孵育40 min 后，用50 μg/mL ox-LDL 刺激血小板60 min，然后離心（12 000 g，5 min，4 ℃），棄除上清液，在冰上將血小板裂解30 min 后，離心（12 000 g，10 min，4 ℃），上清液即所需的血小板蛋白，將蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后曝光檢測血小板Syk、Src 蛋白磷酸化表達(dá)水平以及Caspase-3 和Caspase-9 活化水平〔13〕。

1.3.9 統(tǒng)計分析 使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PNS 對血小板細(xì)胞毒性的影響如圖1 所示，溶劑對照組和PNS 組中血小板LDH 漏出率均顯著低于陽性對照組（P＜0.01）。1～250 μg/m LPNS 組中血小板LDH 漏出率與溶劑對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此可以認(rèn)為，PNS 在1～250 μg/mL 濃度范圍內(nèi)對健康人純化血小板無明顯的細(xì)胞毒性作用。但是與溶劑對照組相比，300 μg/mL PNS 能增加血小板LDH 漏出率（P＜0.05），表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用。此外，結(jié)合其他文獻(xiàn)報道中所用PNS 濃度〔17-18〕，最終選擇1、10、100 μg/mL 進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 PNS 對血小板細(xì)胞毒性的影響

2.2 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Δψm 的影響與靜息組相比，對照組血小板中JC-1 單體的含量顯著升高（P＜0.01），說明ox-LDL 可以促進(jìn)血小板發(fā)生Δψm去極化，引起血小板凋亡。與對照組相比，PNS 各劑量組可顯著抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Δψm去極化（P＜0.01）；PNS 各劑量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Δψm 的影響

2.3 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板表面PS 暴露水平的影響ox-LDL 刺激血小板后，與靜息組相比，對照組、PNS 低劑量組血小板表面PS 暴露率顯著升高（P＜0.01）。與對照組相比，PNS 中、高劑量組均可抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板表面PS 的暴露水平（P＜0.05）。與PNS 低劑量組相比，PNS 高劑量組血小板表面PS 暴露率下降（P＜0.05）。見圖3。

圖3 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板表面PS 暴露水平的影響

2.4 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板氧化應(yīng)激水平的影響ox-LDL 刺激血小板后，與靜息組相比，對照組和PNS 低劑量組血小板總ROS 水平和超氧化物水平顯著升高（P＜0.01），PNS 中、高劑量組血小板總ROS 水平升高（P＜0.05）。與對照組相比，PNS 中、高劑量組血小板總ROS 水平和超氧化物水平下降（P＜0.05）。與PNS 低劑量組相比，PNS 中、高劑量組血小板總ROS 水平和超氧化物水平下降（P＜0.05）。見圖4。以上結(jié)果表明，PNS 可顯著抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板氧化應(yīng)激水平。

圖4 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板總ROS 水平和超氧化物水平的影響

2.5 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Caspase-3 和Caspase-9 活化水平的影響ox-LDL 刺激血小板后，與靜息組相比，對照組血小板Caspase-3 和Caspase-9 的活化水平顯著升高（P＜0.01），PNS 低劑量組血小板Caspase-3 活化水平升高（P＜0.05）。與對照組相比，PNS 中、高劑量組均可抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Caspase-3 和Caspase-9 的活化水平（P＜0.05）。與PNS 低劑量組相比，PNS 中、高劑量組血小板Caspase-3 活化水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Caspase-3 和Caspase-9 活化水平的影響

2.6 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Src、Syk 蛋白的磷酸化水平的影響ox-LDL 刺激血小板后，與靜息組相比，對照組、PNS 低劑量組血小板Src、Syk 蛋白的磷酸化水平升高（P＜0.05）。與對照組相比，PNS中、高劑量組可抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板Src、Syk蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。與PNS 低劑量組相比，PNS 高劑量組血小板Src 蛋白的磷酸化水平降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 PNS 對ox-LDL 誘導(dǎo)的Src、Syk 蛋白的磷酸化水平的影響

3 討論

血小板凋亡在CVDs 的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在冠心病、高脂血癥等CVDs 中，血小板的凋亡率顯著增加〔9，18-19〕。以往的研究〔12〕已經(jīng)證實，PNS 可通過抑制血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和聚集來發(fā)揮防治CVDs 作用。本研究證明PNS 可抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板凋亡，提示PNS 在抗血小板凋亡方面具有重要的研究價值，為PNS 防治高脂血癥等慢性CVDs 提供重要的實驗依據(jù)。

動脈粥樣硬化血栓形成是導(dǎo)致CVDs 患者死亡的主要原因，高脂血癥是誘發(fā)CVDs 的重要危險因素之一，循環(huán)血液中ox-LDL 通過激活白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板參與高脂血癥中動脈粥樣硬化血栓形成〔2〕。高脂血癥患者循環(huán)血液中ox-LDL 可識別并與血小板表面CD36 清道夫受體結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)胞內(nèi)多種信號通路發(fā)揮提高血小板高反應(yīng)性的作用，其中Src 家族蛋白激酶、PLCγ2、PKC 以及ERK5在其中起著關(guān)鍵作用〔20〕。研究證實，ox-LDL 與CD36 結(jié)合后可激活血小板內(nèi)Src、Syk、PLCγ2、PKC蛋白，使其發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步使NOX2 激活。NOX2 是血小板內(nèi)介導(dǎo)ROS 生成的關(guān)鍵蛋白，其活化可促進(jìn)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)而使下游的ERK5 發(fā)生磷酸化，促使血小板發(fā)生凋亡〔5，21〕。本研究證明，PNS 可以抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血小板凋亡以及抑制Src、Syk 蛋白的磷酸化和氧化應(yīng)激水平，但是PNS 通過Src/Syk/ROS 信號通路抑制血小板凋亡的具體機制以及CD36 在其中的作用尚不明確，仍需進(jìn)一步深入研究。此外，PNS 調(diào)控血小板凋亡是否參與其防治高脂血癥中血栓形成也有待在動物模型中進(jìn)一步驗證。

三七中的成分包括皂苷類、黃酮類、固醇類、多炔類、氨基酸類等，其中研究最多的是皂苷類〔10〕。PNS 作為三七的主要藥用成分，口服生物利用度低，療效差，臨床上常采用靜脈滴注的方式進(jìn)行給藥〔22〕。目前研究證實，PNS 可通過納米粒子或者與脂質(zhì)結(jié)合提高其在體內(nèi)的生物利用度〔23〕，在今后的研究中應(yīng)加強對提高PNS 生物利用度的研究。有研究表明，PNS（1 500 mg/kg）口服后，僅有0.71%的藥物進(jìn)入體循環(huán)，藥物在體內(nèi)的峰濃度為19.09 μg/mL。對大鼠進(jìn)行尾靜脈注射50 mg/kg PNS（在體內(nèi)相當(dāng)于100 μg/mL），其生物利用度為100%〔22〕。在臨床上，采用每天靜脈滴注血栓通注射液（主要成分是PNS）500 mg 治療血栓性疾病，注射后血液中PNS 的最高濃度可達(dá)130 μg/mL〔24〕。本體外實驗使用的PNS 濃度范圍在1～100 μg/mL 之間，而且對ox-LDL 誘導(dǎo)血小板凋亡產(chǎn)生抑制作用的劑量主要是10 μg/mL 和100 μg/mL，該濃度在生理劑量范圍之內(nèi)?？傊?，本研究為PNS 防治血栓形成，改善高脂血癥及其相關(guān)慢性代謝性疾病的生理活性提供新的思路，也將進(jìn)一步牢固確定傳統(tǒng)中藥在防治CVDs 治療中的作用和優(yōu)勢。