張永康，孫成宏，王西雙，姚景春，張貴民*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300

2.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 臨沂市天然藥物免疫藥理毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種以肝實(shí)質(zhì)損害為特征的炎癥性疾病，在亞太地區(qū)的發(fā)病率約為0.005%～0.025%，且呈逐年上升趨勢(shì)[1]，如果不及時(shí)治療，則會(huì)迅速發(fā)展為肝硬化和肝衰竭，嚴(yán)重危害人類健康。AIH 的發(fā)病原因較為復(fù)雜，臨床上多以糖皮質(zhì)類激素如地塞米松磷酸鈉注射液等進(jìn)行治療，但極易引起機(jī)體諸多不良反應(yīng)[2]。因此，研究安全、有效和經(jīng)濟(jì)的治療藥物仍然是治療AIH 的臨床需要。荊防顆粒組方來(lái)源于明代張時(shí)徹《攝生眾妙方》中的荊防敗毒散，由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草11 味中藥組成，具有暢達(dá)氣機(jī)，扶助正氣，消除風(fēng)寒、濕熱、痰瘀、氣滯的作用，廣泛用于多種系統(tǒng)疾病的治療[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，荊防顆粒具有良好的抗炎作用，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，保護(hù)肝臟的免疫功能[5-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥物研究的新模式，通過(guò)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病等相互作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供新的方法[9-10]。本課題組前期研究表明，荊防顆粒對(duì)刀豆蛋白 A（concanavalin A，Con A）誘導(dǎo)的免疫性肝炎具有顯著的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度預(yù)測(cè)荊防顆粒治療AIH 的成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路，結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證深入探究荊防顆粒對(duì)AIH 的治療作用及作用機(jī)制，為臨床上應(yīng)用荊防顆粒治療AIH 提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量（28±2）g，8 周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006，使用許可證號(hào)SYXK（魯）-20180008。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫（23±2）℃、相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境中，12 h 光暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)魯南制藥集團(tuán)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)HN-IACUC-2022-097）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字 Z37020357，批號(hào)8022009004）由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司提供；地塞米松磷酸鈉注射液（批號(hào)2202160612）由山東辰欣藥業(yè)股份有限公司提供；Con A（批號(hào)C2010）購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich 公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)H052-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml063132-2）、小鼠IL-6 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml1002293-2）、小鼠IL-8/CXC 型趨化因子配體8（CXC chemokine ligand 8，CXCL8）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml58632）購(gòu)自Mlbio 公司；磷酸化核因子-κB p65（phosphorylated nuclear factorκB p65，p-NF-κB p65）抗體（批號(hào)80477）、NF-κB p65抗體（批號(hào)8242）、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗體（批號(hào)13158）、抗體分泌細(xì)胞（antibody-secreting cell，ASC）抗體（批號(hào)67824）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cysteinasparate protease-1，Caspase-1）抗體（批號(hào)89332）、IL-1β 抗體（批號(hào)27989）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)3498）、Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)5023）、Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）抗體（批號(hào)3230）、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）抗體（批號(hào)3771）、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體（批號(hào)9139）、磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）抗體（批號(hào)9145）；購(gòu)自美國(guó)CST 公司；β-actin 抗體（批號(hào)AF0003）購(gòu)自Beyotime；IL-6 抗體（批號(hào)ab233706）、TNF-α 抗體（批號(hào)ab183218）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)ab6721）、HRP 標(biāo)記的兔抗鼠二抗（批號(hào)ab6728）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 儀器

冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司）；Pannoramic SCAN 圖像掃描及分析系統(tǒng)（匈牙利3D HISTECH公司）；Tissue-Tec?VIPTM5 Jr 型全封閉組織脫水機(jī)、Tissue-Tec?TECTM5 組織包埋機(jī)（日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社）；RM2235 型輪轉(zhuǎn)式病理切片機(jī)、HI1210 型組織攤片機(jī)、ST5020 型自動(dòng)染色機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；ELX-800 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek 公司）；BS-800 型全自動(dòng)生化分析儀（深圳市邁瑞生物醫(yī)學(xué)電子有限公司）；DYY-7C 型電泳儀、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)移槽（北京六一生物科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 荊防顆粒靶點(diǎn)的收集 從《中國(guó)藥典》2020年版中查詢荊防顆粒11 味中藥的性味與歸經(jīng)，借助TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)分別以荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草為關(guān)鍵詞搜索各中藥的化學(xué)成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得荊防顆粒的活性成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將收集到的所有靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)nitProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，以獲取目標(biāo)基因名稱。同時(shí)，將目標(biāo)基因?qū)隒ytoscape 3.7.0 軟件，通過(guò)度值確定荊防顆粒的關(guān)鍵活性成分。

2.1.2 AIH 的疾病靶點(diǎn)檢索 使用Omim 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、 Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com/）和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），輸入關(guān)鍵詞“autoimmune hepatitis”篩選疾病目標(biāo)，將3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中符合疾病的基因結(jié)果匯總后去重，篩選得到最終AIH 的相關(guān)靶點(diǎn)基因。

2.1.3 荊防顆粒和AIH 交集靶點(diǎn)基因的收集以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Venn 圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將荊防顆粒成分靶點(diǎn)與AIH 相關(guān)靶點(diǎn)取交集以獲得荊防顆粒治療AIH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.string-db.org）獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 軟件并可視化，利用CytoHubba 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，默認(rèn)設(shè)置顯示前10名的蛋白節(jié)點(diǎn)，將度值和最大鄰居組件（maximum neighborhood component，MNC）前10 位的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將獲得的荊防顆粒治療AIH 的關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org），進(jìn)行KEGG 通路和GO 功能富集分析。將校正P值≤0.01 的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，根據(jù)富集基因的校正P值來(lái)排序，選取排名在前的相關(guān)信號(hào)通路，然后通過(guò)生物信息學(xué)云平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）可視化上述分析并生成氣泡圖。最后，通過(guò)Cytoscape 軟件建立活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 AIH 小鼠模型的建立 ICR 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及荊防顆粒低、中、高劑量（2、4、8 g/kg）組和地塞米松（0.8 mg/kg）組，每組10 只。除對(duì)照組外，其余各組iv 10 mg/kg Con A 建立AIH模型。模型建立后1 h，荊防顆粒各劑量組ig 相應(yīng)藥物，地塞米松組ip 地塞米松磷酸鈉注射液，對(duì)照組和模型組ig 等體積純凈水，記錄造模24 h 后各組小鼠死亡率。小鼠ip 1%戊巴比妥溶液麻醉后，隨機(jī)采集血清和肝組織樣本。

2.2.2 肝功能和血液生化分析 將各組小鼠血液于4 ℃、3500 r/min 離心10 min，立即吸取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性。

2.2.3 肝組織病理學(xué)分析 取各組小鼠肝臟組織，甲醛固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水并制作石蠟切片，用自動(dòng)染色機(jī)對(duì)組織（5 μm）進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟病理學(xué)的差異。根據(jù)肝臟Knodell 評(píng)分系統(tǒng)[11]評(píng)價(jià)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死程度：0 分，無(wú)炎性細(xì)胞滲透和壞死；1分，輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死；2 分，中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死；3 分，嚴(yán)重炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死。

2.2.4 肝組織炎性因子水平檢測(cè) 取各組小鼠肝組織，在PBS 溶液中勻漿后4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定IL-6、TNF-α、IL-1β 和CXCL8 的含量。

2.2.5 Western blotting 檢測(cè)肝組織p-NF-κB p65、NF-κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β、Bcl-2、Bax、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-6和TNF-α 蛋白表達(dá) 取各組小鼠肝臟組織，加入含有磷酸酶抑制劑和PMSF 的RIPA 裂解液，提取總蛋白，按照BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST 洗滌3 次，加入二抗，室溫孵育2 h；PBST 洗滌3 次，加入ECL 發(fā)光試劑顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，并使用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 荊防顆?；钚猿煞峙c靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索荊防顆粒中的11 味藥中所有的潛在靶點(diǎn)，以同時(shí)滿足OB≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，再通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)更正和刪除重復(fù)項(xiàng)目后，共鑒定出269 個(gè)與荊防顆粒相關(guān)的非重復(fù)性靶點(diǎn)和159 個(gè)活性成分。將信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件分析荊防顆?！爸兴?成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，度值排名前10 位的活性成分見表1。

表1 荊防顆粒活性成分(前10)Table 1 Active ingredients of Jingfang Granules(top 10)

3.2 荊防顆粒治療AIH 的關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Genecard、OMIM 和Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得761 個(gè)AIH 疾病相關(guān)靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ睾?，共獲得343 個(gè)非重復(fù)性靶點(diǎn)。將269 個(gè)荊防顆粒靶基因與343 個(gè)潛在AIH 相關(guān)靶基因取交集，共獲得25個(gè)交集靶點(diǎn)（圖1-A），為荊防顆粒治療AIH 的潛在靶點(diǎn)。應(yīng)用Cytoscape 軟件對(duì)荊防顆粒治療AIH的25 個(gè)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1-B。將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)得到PPI網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析獲得其核心網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape 軟件可視化，見圖1-C。拓?fù)浞治銮?0 名的核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)包括IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3、CXCL8、IL-10、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、Caspase-8（CASP8）和C 反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）。

圖1 荊防顆粒治療AIH 的核心靶點(diǎn)和PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Core target and PPI network of Jingfang Granules in treating AIH

3.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析主要包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。將25個(gè)潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)后，得到GO條目689 個(gè)（P＜0.01），生成了BP、MF、CC 和KEGG 富集分析結(jié)果。其中BP 條目共646 個(gè)，主要涉及細(xì)胞因子的產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路和免疫過(guò)程；MF 條目34 個(gè)，主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合，包括腫瘤壞死因子受體結(jié)合；CC 條目9 個(gè)，主要涉及質(zhì)膜和囊泡（圖2）。KEGG 通路富集分析篩選得到93 條通路（P＜0.01），結(jié)果表明，荊防顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子、肝細(xì)胞壞死等信號(hào)通路治療AIH（圖3）。

圖2 荊防顆粒治療AIH 靶點(diǎn)的GO 功能富集分析Fig.2 GO function enrichment analysis of targets of Jingfang Granules in treating AIH

圖3 荊防顆粒治療AIH 靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of targets of Jingfang Granules in treating AIH

3.4 荊防顆粒對(duì)AIH 模型小鼠的保護(hù)作用

通過(guò)建立Con A 誘導(dǎo)的AIH 小鼠模型，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果。如圖4-A所示，模型組小鼠死亡率遠(yuǎn)高于對(duì)照組，而各給藥組小鼠死亡率均低于模型組，且荊防顆粒中、高劑量組小鼠死亡率低于地塞米松組。如圖4-B、C所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中ALT 和AST 活性均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，荊防顆粒中、高劑量組和地塞米松組血清中ALT 和AST 活性均顯著降低（P＜0.05、0.01）。如圖4-D所示，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的門脈炎癥，中央靜脈周圍出現(xiàn)嚴(yán)重的竇性充血以及點(diǎn)狀或斑片狀壞死；給予荊防顆粒或地塞米松磷酸鈉注射液治療后，小鼠肝臟中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死受到顯著抑制（P＜0.05、0.01）。以上結(jié)果表明，荊防顆?？梢詼p輕Con A 誘導(dǎo)的AIH 小鼠的肝損傷，且藥效優(yōu)于地塞米松磷酸鈉注射液。

圖4 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠的保護(hù)作用(±s,n = 10)Fig.4 Protective effect of Jingfang Granules on AIH mice(±s,n = 10)

3.5 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠肝組織炎癥因子水平的影響

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果和KEGG 通路富集分析表明，大多數(shù)確定的關(guān)鍵靶點(diǎn)在炎癥細(xì)胞因子的相互作用中富集。通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)肝組織中相關(guān)炎癥因子水平，如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和CXCL8 水平均顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒中、高劑量組和地塞米松組IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒高劑量組和地塞米松組IL-6水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒中、高劑量組CXCL8 水平顯著降低（P＜0.05），表明荊防顆粒對(duì)Con A 誘導(dǎo)的AIH 小鼠具有顯著的抗炎作用?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇荊防顆粒高劑量（8 g/kg）組作為代表組，探討荊防顆粒治療AIH 的作用機(jī)制。

圖5 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠的抗炎作用(±s,n = 6)Fig.5 Anti-inflammatory effect of Jingfang Granules on AIH mice(±s,n = 6)

3.6 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠肝組織IL-6/STAT3 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 和Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組小鼠肝組織中 IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 和Bax 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。

圖6 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠肝組織IL-6/STAT3 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(±s,n = 3)Fig.6 Effect of Jingfang Granules on IL-6/STAT3 signal pathway related protein expressions in liver of AIH mice(±s,n = 3)

3.7 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠肝組織NLRP3/IL-1β 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1 和下游IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），表明模型組小鼠具有明顯的炎癥反應(yīng)；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和下游IL-1β 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖7 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠肝組織NLRP3/IL-1β 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(±s,n = 3)Fig.7 Effect of Jingfang Granules on NLRP3/IL-1β signal pathway related protein expressions in liver of AIH mice(±s,n = 3)

3.8 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠肝組織TNF-α/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組TNF-α 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能夠抑制TNF-α/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平。

圖8 荊防顆粒對(duì)AIH 小鼠肝組織TNF-α/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(±s,n = 3)Fig.8 Effect of Jingfang Granules on TNF-α/NF-κB signal pathway related protein expressions in liver of AIH mice(±s,n = 3)

4 討論

AIH 是一種典型的自身免疫性疾病，發(fā)生于任何年齡和種族[12-13]。幾十年來(lái)對(duì)治療AIH 藥物的研究表明，單一靶點(diǎn)藥物難以解決所有問(wèn)題[14]。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療AIH 因其藥理作用明顯、不良反應(yīng)少而受到越來(lái)越多的關(guān)注[15]。荊防顆粒具有改善能量代謝循環(huán)、解表驅(qū)汗、抗炎等作用[3-5,8,16]。研究表明，荊防顆粒通過(guò)降低促炎因子表達(dá)、抗氧化、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad4 信號(hào)通路對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化有明顯的治療作用[17]。此外，荊防顆粒還可以通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路發(fā)揮解酒保肝作用[18]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合了中藥有效成分、相應(yīng)靶點(diǎn)和相應(yīng)疾病3 個(gè)方面，并將其作為3 種不同類型的節(jié)點(diǎn)，形成“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，揭示了中藥治療相關(guān)疾病的有效成分和作用機(jī)制[9]。李志杰等[19]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了苦黃顆粒治療AIH 的活性成分和作用機(jī)制。郝建亨等[20]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究了丹參酮IIA治療AIH 的潛在靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究荊防顆粒治療AIH 的作用機(jī)制，確定了槲皮素是荊防顆粒最重要的活性成分，其次是木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚和漢黃芩素等。通過(guò)Venn 圖確定荊防顆粒與AIH 疾病相關(guān)的25 個(gè)中心靶點(diǎn)。成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)表明，荊防顆粒在AIH 治療中作用于多個(gè)靶點(diǎn)并產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。GO 功能和KEGG 通路分析表明，大多數(shù)靶點(diǎn)在炎癥和凋亡過(guò)程中富集。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析未提供特定的信號(hào)通路靶點(diǎn)，但本研究從荊防顆粒治療AIH 相關(guān)的交叉靶點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)了炎癥和凋亡通路。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3 和CXCL8 是5 個(gè)度值最大的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)都表明了荊防顆粒對(duì)AIH 的抗炎和抗凋亡特性，實(shí)際可能存在涉及更有效成分和作用機(jī)制的暗示。

Con A 誘導(dǎo)的AIH 模型是一種具有代表性的、易于構(gòu)建的AIH 模擬模型，也是一種急性肝損傷模型，可導(dǎo)致高死亡率[21]。此外，Con A 誘導(dǎo)的AIH模型的典型特征為炎癥細(xì)胞因子的分泌，ALT 和AST 活性升高，肝細(xì)胞凋亡和壞死異常[22]。本研究結(jié)果表明，荊防顆粒能顯著降低Con A 誘導(dǎo)的AIH模型小鼠的死亡率、肝組織炎癥和細(xì)胞凋亡，并能抑制AIH 小鼠血清ALT 和AST 的活性。

異常的IL-6/STAT3 信號(hào)通路在AIH 的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，抑制IL-6/SATA3 信號(hào)通路可以減輕Con A 誘導(dǎo)的肝損傷[23]。在自身免疫炎癥性疾病模型中，分泌的IL-6 通過(guò)gp130 與受體結(jié)合，激活JAK2 并觸發(fā)STAT3 通路，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡[24]。Bcl-2 表達(dá)提高有利于增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡功能，而Bax 的增加則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax/Bcl-2 值通常用來(lái)表示細(xì)胞凋亡水平[25-26]。李翔子等[27]研究結(jié)果證實(shí)，荊防顆粒可以通過(guò)抑制JAK2/STAT3 通路調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群的平衡，在蕁麻疹動(dòng)物模型中發(fā)揮抗炎作用，從而保護(hù)小鼠免受自身免疫性疾病。曹天佑等[28]研究證實(shí)，荊防顆?？娠@著抑制由炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。IL-1β 在多種自身炎癥性疾病中發(fā)揮重要的作用，IL-1β 能夠通過(guò)支持T 細(xì)胞存活、上調(diào)淋巴細(xì)胞上的IL-2 受體、促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和Th17 細(xì)胞分化來(lái)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[29]。NLRP3 是先天免疫的重要組成部分，由NLRP3、ASC 和Caspase-1組成，用于誘導(dǎo)IL-1β 的釋放，在AIH 肝臟炎癥中起關(guān)鍵作用[30]。此外，IL-1β 能與IL-6 和TNF-α 產(chǎn)生協(xié)同作用，參與炎癥細(xì)胞的釋放和炎癥通路的激活。TNF-α 是一種炎癥細(xì)胞因子，可以激活固有免疫途徑并觸發(fā)炎癥反應(yīng)[31]。TNF-α 通過(guò)介導(dǎo)NF-κB的激活來(lái)刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并增強(qiáng)AIH 的炎癥反應(yīng)[32]。NF-κB 是一種主要轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)Con A誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，并參與TNF-α 誘導(dǎo)的不同類型細(xì)胞中炎癥蛋白的表達(dá)[33]。El-Agamy 等[34]闡明了NF-κB 在Con A 誘導(dǎo)的AIH 發(fā)病機(jī)制中的作用，Con A 刺激NF-κB 的磷酸化并啟動(dòng)和調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β 和IFN-γ 的產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明，荊防顆粒顯著抑制了AIH模型小鼠肝組織中STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。荊防顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號(hào)通路的激活，在細(xì)胞凋亡和炎癥水平上對(duì)AIH 產(chǎn)生抑制作用。因此，STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號(hào)通路是荊防顆粒治療AIH 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

AIH 早期發(fā)病原因主要為CD4+細(xì)胞活化和釋放IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF-α 等多種細(xì)胞因子[35-37]。這些細(xì)胞因子在AIH 中被誘導(dǎo)，并導(dǎo)致相關(guān)的有害免疫反應(yīng)[38]。而Con A 誘導(dǎo)的AIH 炎癥反應(yīng)主要由TNF-α、IL-1β、IL-6 和CXCL8 的增加介導(dǎo)[36-37,39-40]。ELISA 和Western blotting 結(jié)果表明，荊防顆粒顯著抑制STAT3、NLRP3 和NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白（IL-6、p-JAK2、p-STAT3、NLRP3、ASC、Caspase-1、

IL-1β、TNF-α、p-NF-κB p65）的表達(dá)，以上蛋白被激活后反過(guò)來(lái)刺激并調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 和CXCL8 的分泌。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和AIH 小鼠模型，探究了荊防顆?？寡鬃饔脵C(jī)制。荊防顆粒通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用治療AIH，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果，為荊防顆粒治療AIH 提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突