崔秀文，劉 迪，黃天苗，李美玲，栗孟飛*，魏建和

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070

2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels 為傘形科多年生草本植物，干燥根是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，素有“十方九歸”之稱(chēng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸根中的有機(jī)酸類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)和多糖類(lèi)等化學(xué)成分在消炎、抗癌和治療心腦血管疾病等方面具有顯著效果[2]。目前，當(dāng)歸年需求量超3 萬(wàn)t，年種植面積達(dá)4.35 萬(wàn)hm2[3-4]。然而，當(dāng)歸在第2年肉質(zhì)根成藥過(guò)程中，出現(xiàn)高達(dá)50%植株早薹開(kāi)花的現(xiàn)象，導(dǎo)致肉質(zhì)根木質(zhì)化，藥用有效成分含量降低且大量減產(chǎn)，藥農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入減少，影響當(dāng)歸種質(zhì)資源及產(chǎn)業(yè)發(fā)展[5-8]。

MADS-box 基因家族是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，在植物花器官分化、開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)、以及果實(shí)發(fā)育等方面起到重要的調(diào)控作用[9]；其通常分為I型和II型，其中，II型有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：M-domain（MADS-domain）、I-domain （intervening domain）、 K-domain（keratin-like domain）和 C-domain（C-terminal domain）[10]。目前，在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了deficiens （DEF）、SQUAMOSA（SQUA）和TOMATO gene 3 （TM3-like）等12 個(gè)MADS-box亞家族[11]。前期在當(dāng)歸轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，MADS-box 亞家族基因，如SOC1（suppressor of overexpression of constans1）、FLC（flowering locus C）和AGL26（agamouslike 26）等，在抽薹開(kāi)花過(guò)程中差異表達(dá)[12-16]。

研究證實(shí)，SOC1基因是花器官分生組織形成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，其通過(guò)整合外界環(huán)境和內(nèi)在因素等各種成花途徑信號(hào)，激活下游花器官發(fā)育所需的基因，如LEAFY（LFY）、APETALA 1（AP1）和AGAMOUS（AG），進(jìn)而促進(jìn)植株開(kāi)花[17]。前期當(dāng)歸研究中發(fā)現(xiàn)，SOC1基因在完成春化作用的種苗根莖頂端分生組織以及早薹植株中高表達(dá)[12-13]，其上游基因［如COL16（constans-like）］和下游基因（AGL62）在抽薹開(kāi)花過(guò)程中也呈現(xiàn)高表達(dá)[14]。綜合以上研究表明，盡管前人及本課題組已通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了當(dāng)歸抽薹開(kāi)花相關(guān)的MADS-box基因家族序列，并對(duì)關(guān)鍵基因（如SOC1、AG和VRN1）的表達(dá)水平進(jìn)行了qRT-PCR 檢測(cè)與分析[12-16,18]，然而，針對(duì)當(dāng)歸MADS-box 基因家族以及關(guān)鍵基因SOC1的生物信息學(xué)分析等方面的系統(tǒng)研究尚未有報(bào)道。因此，本研究基于前期當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，開(kāi)展了MADS-box基因家族生物信息學(xué)系統(tǒng)分析、SOC1-4基因克隆及表達(dá)驗(yàn)證，旨在深入揭示MADS-box基因家族的生物學(xué)功能，為有效抑制抽薹開(kāi)花提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

當(dāng)歸MADS-box 編碼序列來(lái)源于：（1）不同品種（岷歸1 號(hào)和岷歸2 號(hào)）兩年生大田植株葉片和葉柄的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果已提交NCBI（Access：PRJNA782300），樣品采集等詳細(xì)信息見(jiàn)Zhu 等[18]；（2）岷歸1 號(hào)種苗春化作用過(guò)程中［T1（0 ℃、14 d；未通過(guò)春化）、T2（0 ℃、60 d；通過(guò)春化）和T3（－3 ℃、125 d；低溫規(guī)避春化）］根莖頂端分生組織的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果已提交NCBI（Access：PRJNA789039），樣品采集等詳細(xì)信息見(jiàn)Luo 等[12]，樣品原植物均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)栗孟飛教授鑒定為當(dāng)歸A.sinensis(Oliv.)Diels。

1.2 儀器

臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)SORVAL 公司）；ABIQuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI公司）；超微量分光光度計(jì)（上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 MADS-box 家族鑒定、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)序列（包括氨基酸長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)）分析利用 ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）；亞細(xì)胞定位利用Cell-PLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用 PRABI-Gerland（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pa ge=/NPSA/npsa_sopma.html）；蛋白質(zhì)3D 建模利用Phyre 2 （http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi）。

2.2 MADS-box 家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlNm.nih.gov）選擇模式植物擬南芥Arabidopsis thalianaL.和傘形科植物黃胡蘿卜Daucus carotasubsp.sativus(Hoffm.)中與當(dāng)歸29 個(gè)MADS-box基因家族置信度較高的116 個(gè)蛋白質(zhì)，利用MEGA7.0 軟件最大似然法（maximum likelihood estimate，MLE）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（重復(fù)次數(shù)1000 次，其他參數(shù)為默認(rèn)值）。蛋白質(zhì)保守基序分析利用 MEM E（https://memesuite.org/meme/tools/meme），并利用TBtools 進(jìn)行可視化。利用DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)（深藍(lán)色表示相似度100%、粉色＞75%、淺藍(lán)色＞50%）。

2.3 當(dāng)歸SOC1-4 基因克隆

以岷歸1 號(hào)溫室栽培植株功能葉片為材料（“1.1”項(xiàng)中T2：0 ℃、60 d 通過(guò)春化，種苗移栽生長(zhǎng)40 d），種苗種植及生長(zhǎng)環(huán)境等詳細(xì)信息見(jiàn)Liu等[19]?？俁NA 提取使用Plant RNA Kit R6827（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，United States），其純度和濃度檢測(cè)使用超微量分光光度計(jì)（Micro Drop，上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）；反轉(zhuǎn)錄使用First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）得到cDNA；利用NCBIPrimer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)SOC1-4基因引物序列，forward：5’-TGAGGGGAAAGACTCAGA-3’ 和 reverse ：5’-CTGTTTCGACATCGGAAT-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%TAE 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；膠回收使用瓊脂糖凝膠純化試劑盒TIANgel Midi Purification Kit（天根生化科技有限公司），具體反應(yīng)體系及條件見(jiàn)說(shuō)明書(shū)?；蚩寺∈褂闷侥┒丝寺≡噭┖衟HANDY?-Blunt Cloning Kit（哈爾濱曄健生物科技有限公司）；引物合成及陽(yáng)性克隆測(cè)序由蘭州天啟基因生物科技有限公司完成。

2.4 當(dāng)歸SOC1-4 基因表達(dá)分析

基因表達(dá)材料：（1）岷歸1 號(hào)兩年生大田種植早薹（early bolting，EB）和非早薹（un-early bolting，Un-EB）植株葉和側(cè)根（混合1∶1），植株生長(zhǎng)環(huán)境和樣品采集等詳細(xì)信息見(jiàn)Li 等[13]；（2）岷歸1號(hào)三年生不同生長(zhǎng)發(fā)育期（S1：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、S2：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)過(guò)渡期、S3：抽薹初期、S4：抽薹伸長(zhǎng)期）植株葉和側(cè)根（混合1∶1），植株生長(zhǎng)環(huán)境和樣品采集等詳細(xì)信息見(jiàn)Li 等[14]的實(shí)驗(yàn)；（3）岷歸1 號(hào)不同春化期（T1、T2 和T3）種苗根莖頂端分生組織；（4）岷歸1 號(hào)溫室栽培植株（“1.1”項(xiàng)中T2：0 ℃，60 d 通過(guò)春化，種苗移栽生長(zhǎng)60 d）不同器官（根、莖、葉）。

利用NCBI Primer-BLAST 設(shè)計(jì)SOC1-4基因qRT-PCR 表達(dá)引物，forward：5’-CGAAACGGCGAAATGGACTG-3’和reverse：5’-CTGAATGTCTTGCCCAGCAG-3’，引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。以Actin作為內(nèi)參基因[20]，設(shè)計(jì)引物序列，forward：5’-TGGTATTGTGCTGGATTCTGGT-3’和 reverse：5’-TGAGATCACCACCAGCAAGG-3’ ，利用 FastKing cDNA Kit（KR116，天根生化科技有限公司）合成cDNA；利用 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，具體反應(yīng)體系及條件見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。利用2－△△Ct法計(jì)算SOC1-4基因的相對(duì)表達(dá)水平[21]。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

在qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)中，所采集材料進(jìn)行了3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。運(yùn)用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算及制圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 當(dāng)歸MADS-box 基因家族鑒定及理化性質(zhì)分析

通過(guò)對(duì)當(dāng)歸不同品種葉片和葉柄、種苗春化作用過(guò)程中根莖頂端分生組織的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有29 個(gè)MADS-box 基因，基于所編碼蛋白質(zhì)序列和亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度為49（AP1-1）～422（At5g65490-1）、相對(duì)分子質(zhì)量為5 697.56～49 624.90、等電點(diǎn)為5.06（J）～11.00（AGL14-1），亞細(xì)胞定位分析預(yù)測(cè) 29 個(gè) MADS-box 蛋白分別位于葉綠體（AGL14-1、At3g28050-2和At5g65490-1）、細(xì)胞核（AGL14-2、AGL16和AGL19-1等22 個(gè)）、細(xì)胞質(zhì)（AP1-1、AP1-2和At3g28050-1等7 個(gè)）和線粒體（SVP）（表1）。

表1 當(dāng)歸MADS-box 基因家族蛋白質(zhì)特征及亞細(xì)胞定位Table 1 Protein characteristic and subcellular location of MADS-box gene family in A.sinensis

3.2 當(dāng)歸MADS-box 基因家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)29 個(gè)MADS-box基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及3D 建模，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由α 螺旋、延伸鏈、β 轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成（表2）；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1）與二級(jí)結(jié)構(gòu)（表2）相符合，主要由α 螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈進(jìn)一步折疊組裝為三級(jí)結(jié)構(gòu)，各亞家族內(nèi)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似，如AGL14-2、SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3 和SOC1-4均以α 螺旋為主，無(wú)規(guī)則卷曲次之，β 轉(zhuǎn)角最少。但各亞家族之間空間結(jié)構(gòu)差異較大，如AGL65、SOK2 及AP1-2 等以無(wú)規(guī)則卷曲為主、而AP1-1無(wú)延伸鏈（圖1）。

圖1 當(dāng)歸MADS-box 基因家族蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Tertiary structure of MADS-box gene family in A.sinensis

表2 當(dāng)歸MADS-box 基因家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 2 Secondary structure of MADS-box gene family in A.sinensis

3.3 當(dāng)歸MADS-box 基因家族發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)對(duì)29 個(gè)當(dāng)歸MADS-box基因家族蛋白質(zhì)、61 個(gè)擬南芥和55 個(gè)黃胡蘿卜MADS-box 蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，基于蛋白質(zhì)序列相似性，145個(gè)MADS-box 蛋白質(zhì)分為10 個(gè)亞家族，可分為I型和II型，其中，I型包括suppressor-like，II型包括SOC1、TM3、DEF、MADS8、SQUA、FLC、STMADS11、MIKC 和SOK；另外，SOC1 亞家族包括5 個(gè)當(dāng)歸MADS-box 成員（SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4 和AGL14-2）（圖2）。

圖2 當(dāng)歸、擬南芥和黃胡蘿卜MADS-box 蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of MADS-box family proteins in A.sinensis, A.thaliana and D.carota subsp.sativus

3.4 當(dāng)歸MADS-box 基因家族基序分析

通過(guò)對(duì)以上29 個(gè)當(dāng)歸MADS-box 基因家族蛋白質(zhì)、61 個(gè)擬南芥和55 個(gè)黃胡蘿卜MADS-box 蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和基序分析，結(jié)果顯示，MADS-box蛋白質(zhì)分為10 個(gè)亞家族，與圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)關(guān)系一致，序列含有6 個(gè)保守基序（表3）；當(dāng)歸MADS-box同一亞家族蛋白質(zhì)基序具有高度相似性，其中，SOC1 亞家族均含有Motif 1～Motif 5；不同亞家族蛋白質(zhì)基序存在較大差異，比如，Motif 6 只存在于suppressor-like 亞家族（圖3）。

圖3 當(dāng)歸、擬南芥和黃胡蘿卜MADS-box 蛋白質(zhì)保守基序Fig.3 Conserved sequences of MADS-box proteins in A.sinensis, A.thaliana and D.carota subsp.sativus

表3 MADS-box 蛋白質(zhì)6 個(gè)保守基序及其序列Table 3 Six motifs and their conserved sequences of MADS-box proteins

3.5 當(dāng)歸SOC1 亞家族蛋白質(zhì)多序列比對(duì)

通過(guò)對(duì)當(dāng)歸SOC1 亞家族5 個(gè)成員（SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4 和AGL14-2）及來(lái)自擬南 芥 （AtNP_182090.1） 和 黃 胡 蘿 卜（DcXP_017232221.1）2 個(gè)物種的SOC1 同源蛋白質(zhì)等7 個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，SOC1亞家族5 個(gè)蛋白質(zhì)均含MADS-domain、I-domain、K-domain 和C-domain 結(jié)構(gòu)域，其中，MADS-domain結(jié)構(gòu)域高度保守，C-domain 結(jié)構(gòu)域保守性較低（圖4）；通過(guò)對(duì)SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4進(jìn)行進(jìn)一步比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SOC1-1、SOC1-3 和SOC1-4蛋白質(zhì)的4 個(gè)結(jié)構(gòu)域較為完整、且保守性較高，而SOC1-2 在C-domain 不完整；其中，SOC1-1、SOC1-3和SOC1-4 的相似性為73.27%。

圖4 當(dāng)歸SOC1 亞家族蛋白質(zhì)多序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of SOC1 subfamily proteins in A.sinensis

3.6 當(dāng)歸SOC1-4 基因克隆

為了保證全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中當(dāng)歸SOC1-4基因堿基序列的準(zhǔn)確性，基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中SOC1-4基因堿基序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以岷歸1 號(hào)功能葉片中RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板，進(jìn)行SOC1-4基因克隆。瓊脂糖凝膠電泳顯示，SOC1-4基因擴(kuò)增片段大小在500～750 bp（圖5）；產(chǎn)物回收與堿基測(cè)序顯示，SOC1-4基因克隆長(zhǎng)度為585 bp；通過(guò)與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的SOC1-4進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)所得克隆結(jié)果與測(cè)序序列5-590 bp 相似度為100%（圖6）。

圖5 當(dāng)歸SOC1-4 基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of amplification products of SOC1-4 gene in Angelica sinensis

圖6 當(dāng)歸SOC1-4 基因克隆與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的序列比對(duì)Fig.6 Sequence alignment of SOC1-4 gene obtained from gene clone and full-length sequencing in A.sinensis

3.7 當(dāng)歸SOC1-4 基因表達(dá)分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SOC1-4基因的生物學(xué)功能，本研究對(duì)當(dāng)歸不同材料中SOC1-4基因的表達(dá)水平進(jìn)行了qRT-PCR 檢測(cè)與分析。結(jié)果顯示，早薹植株相對(duì)非早薹植株，SOC1-4基因表達(dá)量上調(diào)6.42 倍；不同生長(zhǎng)期植株中，SOC1-4基因表達(dá)水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加，S2、S3 和S4 時(shí)期相對(duì)于S1時(shí)期分別增加2.16、2.31 和5.79 倍；不同春化期種苗根莖頂端分生組織中，通過(guò)春化作用（T2）處理相對(duì)于未春化作用（T1）SOC1-4基因表達(dá)水平呈現(xiàn)3.39 倍高表達(dá)，而規(guī)避春化作用（T3）處理相對(duì)于T1 處理SOC1-4基因表達(dá)水平呈現(xiàn)0.48 倍降低；不同器官中，莖和葉相對(duì)于根SOC1-4基因表達(dá)水平分別上調(diào)9.23 和4.90 倍（圖7）。

圖7 當(dāng)歸SOC1-4 基因在不同材料中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression level of SOC1-4 gene in different materials of A.sinensis

4 討論

目前，早薹開(kāi)花導(dǎo)致根木質(zhì)化不能入藥仍是困擾當(dāng)歸生產(chǎn)、質(zhì)量和效益提升的重大難題[4]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸抽薹開(kāi)花受到內(nèi)在（如種質(zhì)、苗齡和種苗大小等）和外在（如溫度、光照和干旱等）多種因素的影響[4,22]。此外，當(dāng)歸為“低溫長(zhǎng)日照型”植物，即植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)必須同時(shí)滿足低溫春化作用和長(zhǎng)日照[22-24]。大量研究表明，MADS-box基因家族，尤其是開(kāi)花抑制因子FLC和整合因子SOC1，在植物花器官分化和開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)等方面起到核心調(diào)節(jié)作用[17]。盡管MADS-box基因家族在模式植物擬南芥及其他植物中調(diào)節(jié)開(kāi)花的作用已進(jìn)行了深入研究，然而在藥用植物當(dāng)歸中的生物學(xué)功能還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究基于前期當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有29 個(gè)MADS-box基因分布于10 個(gè)亞家族，所編碼蛋白質(zhì)序列含有6 個(gè)保守基序，其中，亞家族有5 個(gè)成員；另外，還對(duì)SOC1-4基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析，為后續(xù)探究SOC1 在當(dāng)歸抽薹開(kāi)花的分子調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

模式植物擬南芥中有DEF、STMADS11 和TM3-like 等12 個(gè)MADS-box 亞家族[11]；山茶中有83 個(gè)MADS-box基因，可分為I型（Mα、Mβ 和Mγ亞家族）和II型（MIKCC和MIKC*亞家族）[25]；荔枝中有101 個(gè)MADS-box基因，可分為I型和II型，其中，50 個(gè)I型分為Mα、Mβ 和Mγ 3 個(gè)亞家族，51 個(gè)II型進(jìn)一步分為MIKC*、SOC1 和FLC等13 個(gè)亞家族[26]。本研究基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組鑒定出29 個(gè)MADS-box基因家族成員，基于蛋白質(zhì)序列分為10 個(gè)亞家族，可分為I型（Suppressor-like）和II型（SOC1、TM3、DEF、MADS8、SQUA、FLC、STMADS11、MIKC 和SOK）；其中，SOC1 亞家族包括 SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4 和AGL14-2。另外，前人預(yù)測(cè)22 種植物（擬南芥、水稻、煙草等）的SOC1 二級(jí)結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位[27]，與本研究MADS-box 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析，尤其是SOC1 亞家族等的結(jié)果基本一致，表明表明SOC1基因在進(jìn)化上較為保守，在植物的生殖發(fā)育過(guò)程起著重要作用。

植物中MADS-box 的I型和II型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域各具有高度相似性，其中I型只含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，而II型均具有M-domain、I-domain、K-domain和C-domain 結(jié)構(gòu)域，推測(cè)當(dāng)歸MADS-box 基因功能存在多樣性[7,11,28-30]。蛋白質(zhì)保守基序比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同亞家族保守基序存在數(shù)目及位置差異，預(yù)測(cè)不同亞家族功能有所差異。本研究中，SOC1 亞家族均含有II型的4個(gè)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)對(duì)5個(gè)成員SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3、SOC1-4 和AGL14-2 進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)MADS-domain 結(jié)構(gòu)域高度保守，而C-domain 結(jié)構(gòu)域保守性較低。這表明，5 個(gè)SOC1亞家族成員在當(dāng)歸抽薹開(kāi)花過(guò)程中可能發(fā)揮相似或協(xié)同的功能。另外，SOC1-1、SOC1-3 和SOC1-4蛋白質(zhì)的4 個(gè)結(jié)構(gòu)域較為完整，而SOC1-2 在C-domain 不完整，而樊世婷等[31]克隆的當(dāng)歸SOC1基因（XM_017379845.1）與本研究中4 個(gè)SOC1基因比對(duì)存在差異，可能由于當(dāng)歸無(wú)參考基因組序列，轉(zhuǎn)錄組序列拼接參考不同物種而產(chǎn)生的差異；或全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組樣本來(lái)自不同品種及材料所致。

盡管前期研究已獲得了當(dāng)歸全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，為了保證SOC1基因堿基序列的準(zhǔn)確性、以及更深入探究SOC1基因的生物學(xué)特性，本研究通過(guò)克隆當(dāng)歸SOC1-4基因，獲得了585 bp 片段，與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中SOC1-4基因序列 5-590 bp 結(jié)果完全一致，大量研究證實(shí)，作為開(kāi)花整合因子SOC1，在植物花器官分化和開(kāi)花時(shí)間調(diào)控過(guò)程中高表達(dá)[17,32]。本研究發(fā)現(xiàn)，SOC1基因表達(dá)量隨著種苗春化作用和植株生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期延長(zhǎng)隨之增加、在抽薹植株中高于非抽薹植株、而在冷凍規(guī)避春化作用種苗中顯著降低。

綜合以上研究表明，本課題組首次對(duì)當(dāng)歸MADS-box基因家族進(jìn)行了挖掘和生物信息學(xué)分析，并對(duì)開(kāi)花整合因子SOC1基因進(jìn)行了基因克隆與表達(dá)驗(yàn)證。但對(duì)于SOC1基因片段的完整性、以及其它調(diào)控當(dāng)歸抽薹開(kāi)花的關(guān)鍵基因（如FLC、AG和AP1等）還需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突