王元忠，沈 濤

1.云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650200

2.玉溪師范學院化學生物與環(huán)境學院，云南 玉溪 653100

滇重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.是百合科（Liliaceae）重樓屬ParisL.植物，其干燥根莖是云南特色藥材之一[1]。具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，在治療疔瘡腫痛、毒蛇咬傷等方面療效顯著[1-2]。現(xiàn)代化學成分和藥理活性研究表明，滇重樓含有豐富的甾體皂苷、黃酮類化學成分，具有抗腫瘤、抗菌、止血等藥理作用[1]。

滇重樓目前在云南地區(qū)已實現(xiàn)廣泛種植。然而，栽培技術(shù)以及生長環(huán)境的差異是影響藥材內(nèi)在品質(zhì)的主要因素[3-4]。滇重樓屬多年生草本植物，市場上不同年限的栽培重樓均有出售，有研究表明8年生滇重樓6 種甾體皂苷含量最高，適合作為滇重樓的最佳采收期。雖然多種分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于重樓藥材的質(zhì)量評價，但栽培重樓的產(chǎn)地鑒別仍是目前資源利用及藥材質(zhì)量控制中的難點[5]。

衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜（attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectra，ATR-FTIR）技術(shù)憑借其簡單、快速、樣品可回收的優(yōu)勢，在中藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域受到越來越多重視[6-8]。ATR-FTIR 技術(shù)結(jié)合化學計量學方法在種類鑒別研究方面應用較多，如成功地對五種忍冬屬植物進行了鑒別和分類[9]。利用ATR-FTIR 光譜信息結(jié)合模式識別方法對4 種巴旦木也可較好地鑒別，正確率為94.45%[10]。此外，ATR-FTIR 技術(shù)結(jié)合化學計量學對采自12 個月的石斛樣品進行鑒別，得到了令人滿意的分類效果，正確率達到97.92%[11]。以上研究表明ATR-FTIR 技術(shù)應用于中藥材鑒別研究具有可行性與有效性。

本實驗通過ATR-FTIR 光譜信息結(jié)合偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）模型，比較3～8年生13 個不同產(chǎn)地栽培滇重樓樣品的光譜信息差異，為相同年限不同產(chǎn)地樣品鑒別提供快速有效的方法。

1 材料與儀器

1.1 材料

841 株栽培滇重樓樣品分別采自云南省和四川省，共計13 個采樣點，分別為紅河（HH）、麗江（LJ）、怒江（NJ）、昆明（KM）、德宏（DH）、四川（SC）、普洱（PE）、玉溪（YX）、文山（WS）、大理（DL）、楚雄（CX）、保山（BS）和臨滄（LC）。每個采樣點每年在同一時間采收一定數(shù)量不同栽培年限樣品，詳細信息如表1所示。原植物經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為滇重樓P.polyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mzt.。樣品采集后去除泥沙，洗凈根莖部位，切成薄片于干凈白紙上陰干。將干燥樣品分別粉碎，過100 目篩，置于密閉自封袋中避光保存，備用。

表1 栽培滇重樓樣品信息Table 1 Sample information of cultivated P.polyphylla var.yunnanensis

1.2 儀器與試劑

Frontier 型傅里葉變換紅外光譜儀配備衰減全反射附件（Perkin Elmer 公司，美國）；FW-100 型高速萬能粉碎機（天津市華鑫儀器廠）；100 目不銹鋼篩（北京中西泰安技術(shù)服務有限公司）；KQ5200型超聲波清洗機（昆明市超聲儀器有限公司）；AR1140 型萬分之一分析天平（上海升隆電子科技有限公司）。蒸餾水由實驗室 Milli-Q 系統(tǒng)（Massachusetts 公司，美國）自制。

2 方法

2.1 紅外光譜采集及預處理

稱取定量根莖粉末（2.0±0.2）mg 于金屬圈中央（ZnSe 晶體表面），調(diào)節(jié)壓力計旋鈕，統(tǒng)一進度條為（131±1），使其形成厚度一致的樣品粉末片。設(shè)定紅外光譜掃描范圍4 000～550 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，累加掃描16 次，每個樣品平行測定3次，取平均光譜。樣品粉末片掃描之前，采集空白晶體表面紅外光譜，扣除空氣和晶體部分散射光譜干擾。切換樣品時，使用含蒸餾水的無塵布擦拭晶體表面和壓力計頂端，排除不同個體之間的樣品殘留干擾。光譜測定過程中，保持實驗室溫度25 ℃，空氣相對濕度30%。原始紅外光譜經(jīng)過高級ATR校正（晶體：ZnSe；入射角：45.0°；反射次數(shù)：1次；樣品折射率：1.50%）；校正后的光譜經(jīng)自動基線校正、自動平滑、導數(shù)、多元散射矯正，以減小光散射對光譜的影響，降低信號噪音，消除光譜峰重疊，提高分辨率。

2.2 數(shù)據(jù)處理

為了減少無關(guān)變量信息的干擾，使相應判別模型盡可能代表樣品的內(nèi)在化學變量信息，同時增強模型的計算精度和減少模型運行時間，剔除光譜波段4000～3700 cm-1、2799～1800 cm-1和682～653 cm-1，上述波段分別代表光譜基線區(qū)、晶體光譜區(qū)和二氧化碳光譜區(qū)[12]。3 個光譜區(qū)均和樣品化學信息無關(guān)且影響峰形和后續(xù)化學計量學分析。剔除該3 個光譜區(qū)之后的其它波段用于判別模型的建立。

PLS-DA 通過降維將原始光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為沒有相關(guān)性的潛在變量（latent variables，LVs）。本節(jié)通過最大累計預測值（Q2），選擇最佳LVs 數(shù)目建立判別模型。此外，通過Kernnard-Stone 算法將相同栽培年限不同栽培產(chǎn)地樣品分為訓練集（2/3 樣品）和預測集（1/3 樣品）[13]。訓練集用于判別模型的建立，預測集用于對建立模型的外部驗證，分析該模型對未知樣品的預測能力。累積貢獻率（R2）、Q2、交叉驗證均方根誤差（root measure square error cross of validation，RMSECV）、預測均方根誤差（root measure square error of prediction，RMSEP）、訓練集和預測集判別正確率作為不同模型性能評價參數(shù)。以最佳判別模型為前提，通過置換檢驗（permutation test，n＝30）分析模型的擬合能力。R2X、Q2Y、R2-intercept、Q2-intercept作為置換檢驗的評價參數(shù)。其中，R2-intercept＜R2X；Q2-intercept＜Q2Y；Q2-intercept≤0 時，表明模型擬合程度較好。Matlab 6.5 軟件（MathWorks，美國）用于訓練集和預測集的劃分，SIMCA-P+14.1 用于PLS-DA 建模。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳導數(shù)預處理

所有光譜數(shù)據(jù)首先經(jīng)過多元散射校正（Multiplicative scattering correction，MSC）去除無關(guān)信息波段，然后分別通過一階導數(shù)（first derivative，F(xiàn)D）、二階導數(shù)（second derivative，SD）和三階導數(shù)（third derivative，TD）預處理并建立不同判別模型。分析結(jié)果見表2。以訓練集和預測集正確率為主，結(jié)合其他評價參數(shù)篩選不同模型的最佳導數(shù)處理方式。FD 和TD 分別處理后，3年生滇重樓產(chǎn)地鑒別模型訓練集和預測集正確率均為100%；TD 處理之后模型RMSECV（0.188 8）和RMSEP（0.122 5）均低于FD 處理之后的判別模型（RMSECV＝0.188 8；RMSEP＝0.122 5），表明前者訓練集和預測集判別誤差較小。此外，TD 處理之后，R2（0.890 5）和Q2（0.598 3）均高于FD 處理之后模型，表明該模型可以解釋89.05%變量信息，對未知樣品的預測能力較高（大于0.5）。4年生滇重樓產(chǎn)地判別結(jié)果顯示，SD 為最佳光譜預處理方式（PLS-DA 訓練集和預測集判別正確率均為100%）。SD 處理之后模型對未知樣品預測能力（Q2＝0.649 7）弱于TD 處理之后光譜建立的判別模型（Q2＝0.665 2），但該模型可以解釋更多的光譜信息（R2＝0.873 6），且對未知樣品的預測誤差較低（RMSEP＝0.138 6）。5～8年不同產(chǎn)地判別模型顯示，無論采用何種導數(shù)處理方式，模型訓練集和預測集判別正確率均為100%。然而，TD 處理之后模型訓練集判別誤差和預測集判別誤差均為同栽培年限最低，且對相同年限不同產(chǎn)地未知樣品預測能力最強（Q2最大）。除7年生樣品外，TD光譜預處理能夠使相同年限產(chǎn)地判別模型解釋較多的光譜變量信息。5～8年不同產(chǎn)地判別模型相比3～4年模型，可以解釋90%以上光譜信息。綜上所述，TD 為5～8年不同產(chǎn)地判別模型最佳光譜預處理方式。

表2 不同導數(shù)處理PLS-DA 模型判別結(jié)果及其模型參數(shù)Table 2 Discrimination results and parameters of PLS-DA models with different derivatives

3.2 相同年限不同產(chǎn)地樣品可視化分析

由栽培3年12個栽培產(chǎn)地訓練集樣品的聚類結(jié)果可知，怒江和四川產(chǎn)滇重樓樣品聚為一類，玉溪、紅河、臨滄和普洱聚為一類，其他5 個產(chǎn)地樣品聚為一類。由栽培4年11 個栽培產(chǎn)地訓練集樣品聚類趨勢結(jié)果可知，4年生樣品受產(chǎn)地影響較小，產(chǎn)自四川和云南10 個產(chǎn)地樣品，沒有明顯的聚類趨勢。3年生和4年生不同產(chǎn)地樣品聚類結(jié)果表明，栽培滇重樓生長過程中內(nèi)部化學成分種類和含量存在一定變化，栽培年限為4年時，同產(chǎn)地不同個體之間和不同產(chǎn)地樣品之間化學成分差異減小，品質(zhì)的一致性較好。文山栽培5年滇重樓樣品在得分圖上顯示單獨的聚類趨勢，同3年生樣品顯示出相似的聚類趨勢；楚雄栽培5年樣品也顯示出特殊的聚類趨勢。由6年生7 個栽培產(chǎn)地樣品顯示出3 種聚類趨勢可知，麗江和四川聚為一類，文山和紅河聚為一類，大理、玉溪和楚雄呈現(xiàn)一定的聚類趨勢。7年生樣品之間產(chǎn)地差異性逐漸增大，楚雄、玉溪、麗江和保山樣品單獨聚類趨勢明顯；紅河、大理和文山樣品聚為一類，表明紅河和文山樣品栽培6～7年之后化學成分變化的一致性。8年生滇重樓以甾體皂苷含量為評價指標，被推薦為滇重樓最佳的采收時間。8年生7 個產(chǎn)地不同滇重樓樣品顯示，玉溪產(chǎn)滇重樓被單獨聚為一類；紅河和文山樣品仍然聚為一類；楚雄、麗江和德宏樣品聚為一類。上述聚類結(jié)果表明，5～8年栽培時間內(nèi)，紅河和文山栽培樣品顯示出同步的變化趨勢。進一步通過置換檢驗，判定模型的魯棒性和擬合效果?；谧罴压庾V預處理方式建模之后，每個模型的每一類均可以產(chǎn)生R2X、Q2Y、R2-intercept 和Q2-intercept 4 個參數(shù)。通過比較4 組參數(shù)，判斷模型的魯棒性和擬合效果。表3 為最佳預處理光譜數(shù)據(jù)建模之后不同類別的4個參數(shù)匯總結(jié)果。結(jié)果顯示，不同模型均滿足模型魯棒性較高和擬合效果較好的條件。

表3 PLS-DA 判別模型魯棒性參數(shù)Table 3 Validation parameters of PLS-DA model robust

3.3 相同年限不同產(chǎn)地樣品重要變量分析

去除光譜基線區(qū)、晶體光譜區(qū)和二氧化碳光譜區(qū)之后的紅外光譜可以有效反映栽培滇重樓根莖中的大部分化學結(jié)構(gòu)信息。通過變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）分析篩選對產(chǎn)地區(qū)分貢獻較大的光譜變量，VIP 值大于1 為對產(chǎn)地鑒別貢獻較大的重要變量。將VIP 大于1 的重要變量和原始紅外光譜對比，分析相應重要變量對應光譜的化學信息。圖2 為不同栽培年限VIP 及其對應的平均光譜圖?？梢灾庇^發(fā)現(xiàn)3700～1800 cm-1在不同PLS-DA判別模型中均為貢獻較大的變量波段；1800～550 cm-1不同生長年限貢獻變量存在一定差異。重要變量數(shù)量分析顯示，448、455、452 個VIP 大于1 的重要變量分別對5、6、8年栽培滇重樓產(chǎn)地鑒別貢獻較大；相比3年生滇重樓，5年需要較少的重要變量。3、4、7年生滇重樓需要較多的重要變量（472、481、486個重要變量）。其中，42 個變量（表4）為6 個栽培年限不同產(chǎn)地判別模型的共有重要變量。

表4 不同栽培年限共有重要變量及其VIP 值Table 4 Common important variables and VIP values of different cultivated years

圖1 不同栽培年限下不同栽培產(chǎn)地樣品PLS-DA 得分圖Fig.1 Score plots of PLS-DA of samples from different cultivated regions with different growing years

圖2 不同栽培年限下不同栽培產(chǎn)地模型VIP 圖Fig.2 VIP plot of discrimination models of different cultivated regions growing different years

4 討論

生長年限是影響重樓品質(zhì)的關(guān)鍵因素。研究表明，滇重樓繁殖率低，藥用部位主根的自然生長速度十分緩慢，通常需生長4年達到開花期，且不同生長年限的重樓品質(zhì)存在較大差異[14-16]。相較于前人研究，本實驗進一步關(guān)注了生長年限這一關(guān)鍵因素，綜合分析年限、產(chǎn)地對滇重樓整體化學成分的影響，為后續(xù)開發(fā)復雜重樓樣品光譜鑒別技術(shù)提供研究思路。

利用莖痕判定重樓藥材生長年限，是藥材傳統(tǒng)鑒別方法，也有學者利用該特征對重樓藥材質(zhì)量進行評價[17]。然而該方法需要較多經(jīng)驗積累，受人為因素影響大，在實際操作及藥材批量生產(chǎn)、質(zhì)檢過程中仍難以廣泛應用。本實驗紅外光譜指紋圖譜分析表明，隨著栽培年限的增長，滇重樓根莖中化學成分含量和種類可能發(fā)生變化；紅外光譜指紋圖譜一定程度上能客觀反映上述變化。共有重要光譜變量分析顯示，不同生長年限滇重樓光譜指紋圖譜均有差異。文獻報道重樓皂苷I為不同栽培年限滇重樓的共有成分[18]；本實驗篩選所得重要變量：1641 cm-1和1022 cm-1光譜信號變化均與甾體皂苷含量變化緊密相關(guān)[18]。而3045～3664 cm-1的譜帶為O-H 的主要吸收峰，與之相關(guān)的光譜信號也可用于表征滇重樓甾體皂苷、黃酮、脂肪酸等成分的變化情況[1]。以上研究為后續(xù)不同生長年限滇重樓藥材光譜快速鑒別技術(shù)的開發(fā)、完善及生產(chǎn)應用奠定理論基礎(chǔ)。

除生長年限，不同栽培產(chǎn)地重樓飲片皂苷含量差異也可能直接影響重樓的臨床療效[2-3]前期市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)市售不同產(chǎn)地3～8年生的栽培滇重樓多數(shù)未標明栽培產(chǎn)地。然而產(chǎn)地氣候條件和人工栽培技術(shù)差異是影響其品質(zhì)的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)PLS-DA 不僅可以作為判別模型，預測同一年限未知樣品的產(chǎn)地，其得分圖也可顯示出訓練集中不同產(chǎn)地樣品的聚類趨勢。通過得分圖發(fā)現(xiàn)，紅河、文山樣品有明顯的聚類趨勢與兩者均屬于滇東南地區(qū)獨特的氣候條件相吻合[19]。滇重樓生長的滇東南地區(qū)降水量與滇西南相比略低，但與滇中、滇東北、滇西北和滇西等地相比，其降水量又相對充盈[19-20]；結(jié)合文獻推測適宜的降水量加之濕潤的季風性氣候可能是紅河、文山栽培滇重樓特殊聚類的可能原因；相關(guān)結(jié)論還有待進一步栽培實驗的觀察與驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突