黃 棟，楊林彤，焦緒棟，秦 松，蒲 洋

(1.魯東大學農(nóng)學院，山東煙臺 264025；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺 264003；3.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005)

據(jù)推測，海洋無脊椎動物占海洋中動物總量的90%以上[1]，大部分種類動物體內(nèi)的體腔液或血液細胞尚未明確功能。目前普遍認為體腔液細胞是海洋無脊椎動物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，具有清除感染[2]、吞噬異物[3-4]、分泌免疫因子(如C1q凝菌因子[5]、凝集素[6]、棘色素-A[7-8]等)、修復創(chuàng)傷組織[9]等功能。

海洋無脊椎動物體腔液或血細胞尚缺乏統(tǒng)一的分類標準[10]。在部分貝類[11-13]、蝦類[14]、螃蟹[15-16]血液細胞的研究中，透明細胞(hyalinocyte)和顆粒細胞(granulocyte)被認為是普遍存在的主要細胞類群。劉東武等[11]和許秀芹等[12]將中國蛤蜊、太平洋牡蠣等8種常見雙殼貝類的血淋巴細胞分為大顆粒細胞、小顆粒細胞和透明細胞；李光友等[14]和Martin等[15]將中國對蝦和2種單肢蝦的血淋巴細胞分為大顆粒細胞、小顆粒細胞及透明細胞。Bodammer[16]和胡錦麗等[17]將藍蟹和中華絨螯蟹的血淋巴細胞分為顆粒細胞、透明細胞及半顆粒細胞。

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)是環(huán)渤海及北太平洋區(qū)域特有的一種海洋低等無脊椎動物。作為一種新興的養(yǎng)殖品種，它具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值[18-19]。單環(huán)刺螠無心臟、血管等循環(huán)系統(tǒng)分化，推測其體腔液及體腔液細胞具有營養(yǎng)物質(zhì)輸送、免疫防御等功能。目前對單環(huán)刺螠的研究較少。筆者利用密度梯度離心結(jié)合流式細胞術(shù)對單環(huán)刺螠體腔液細胞進行聚類分析，并對其體腔液細胞的抗菌/殺菌活性進行測定，旨在為單環(huán)刺螠育苗養(yǎng)殖過程中的病害防控提供基礎(chǔ)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料購買市售活力較強、體表無明顯損傷的單環(huán)刺螠，平均體重(25.36±5.12)g；置于50 L海水暫養(yǎng)池暫養(yǎng)7 d，池底鋪設(shè)15～20 cm潔凈海沙，溫度18～20 ℃，適量曝氣，不飼喂。

1.2 體腔液細胞的流式分布隨機取單環(huán)刺螠3只，先用70%乙醇擦拭體表消毒，將含EDTA-2K(0.1 mg/mL)的無菌注射器沿身體縱向刺入，抽取1 mL紅色體腔液并混勻。用無菌PBS緩沖液按說明書配制Percoll工作液，在10 mL離心管中依次加入濃度40%、35%、26%、20%、16%的1 mL Percoll工作液，形成不連續(xù)密度梯度。在最上層加入1 mL體腔液，4 ℃、2 500 r/min離心30 min[20-21]。離心結(jié)束后小心將形成的細胞層分別吸出并收集備用。

取不同梯度離心層，使用流式細胞儀FACSAria(美國BD，Becton Dickinson)進行檢測，檢測前向角散射光(forwardscatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向角散射光(sidescatter，SSC)。試驗數(shù)據(jù)使用CELL Quest軟件處理。獲取細胞數(shù)為10 000個，分別以FSC和SSC為橫、縱坐標繪圖，從門水平上圈出各個細胞亞群。

1.3 樣品預處理

1.3.1細菌懸濁液的制備。從-80 ℃冰箱中取出實驗室保存的枯草芽孢桿菌(ATCC W0825)、大腸桿菌(ATCC 25922)菌種，分別接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。將菌液5 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS洗滌，上述步驟重復3次，再用PBS重懸，并調(diào)節(jié)細菌濃度至1×107CFU/mL，備用。

1.3.2體腔液細胞的制備。用0.1 mg/mL肝素鈉浸潤后的1.5 mL無菌注射器從海腸體腔中采集1 mL體腔液，將體腔液于4 ℃、1 500 r/min下離心30 min，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水(0.9 g NaCl，100 mL H2O)洗滌，上述步驟重復3次，再用L-15液體培養(yǎng)基重懸，并調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106CFU/mL，備用。

1.4 溶血試驗參照秦真東[22]的方法測定枯草桿菌和大腸桿菌對體腔細胞的溶血情況。取0.5 mL的體腔細胞溶液，分別與0.5 mL枯草芽孢桿菌和大腸桿菌懸液混勻，室溫孵育，分別于孵育后不同時間點取樣，3 800 r/min 離心5 min后取200 μL上清液加到96孔酶標板中，置于酶標儀404 nm處檢測吸光值。

1.5 抗菌活性測定

1.5.1呼吸爆發(fā)水平測定。

1.5.1.1活性氧(ROS)水平的檢測。參照單環(huán)刺螠呼吸腸ROS檢測的方法[23]，取0.5 mL單環(huán)刺螠體腔細胞懸液與0.5 mL終濃度1×105CFU/mL 的枯草芽孢桿菌和大腸桿菌懸液混勻，28 ℃孵育 30 min。按1‰比例加入DCFH-DA探針，37 ℃、80 r/min下避光孵育60 min。4 ℃、3 400 r/min下離心10 min，用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，重懸后置于96孔熒光酶標板。使用熒光酶標儀(Fluoroskan Ascent FL，Thermo)設(shè)置激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm，檢測吸光值。

取0.5 mL單環(huán)刺螠體腔細胞懸液分別與0.5 mL不同濃度(1×105～3×105CFU/mL)的大腸桿菌懸濁液混合，按照同樣方法測定吸光值。

1.5.1.2一氧化氮水平的測定。參照張夢蘭等[24]對一氧化氮的檢測方法，將單環(huán)刺螠體腔液細胞懸液與枯草芽孢桿菌、大腸桿菌(終濃度為1×107CFU/mL)按體積比1∶1加入96孔酶標板中，各50 μL。28 ℃孵育30 min；加入100 μL gress A，37 ℃孵育10 min后再加入100 μL gress B，37 ℃孵育10 min后，使用酶標儀檢測540 nm處的吸光值。

取50 μL單環(huán)刺螠體腔細胞懸液分別與50 μL不同濃度(1×107～3×107CFU/mL)的大腸桿菌懸濁液混合，按上述同樣方法測定吸光值。

1.5.2抗菌活性測定。參照Du等[25]的方法將1 mL單環(huán)刺螠體腔細胞懸液分別與枯草芽孢桿菌和大腸桿菌(1×105CFU/mL)28 ℃溫育60 min。先將處理后的混合液進行10倍稀釋，再涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，28 ℃過夜培養(yǎng)后計算平皿上細菌菌落數(shù)量。以生理鹽水作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 體腔液細胞分布前期采用顯微觀察的方法分析單環(huán)刺螠體腔液細胞分布，發(fā)現(xiàn)單環(huán)刺螠體腔液細胞主要由紅色顆粒細胞、白色透明細胞等構(gòu)成。

利用Percoll不連續(xù)密度梯度離心可將單環(huán)刺螠體腔液細胞主要分為3層(圖1)：紅色顆粒細胞主要集中在20%～26%的Percoll工作液中；20%的Percoll工作液以近圓狀、細胞內(nèi)充滿顆粒的紅色細胞為主，內(nèi)含少量無色透明細胞；26%的Percoll工作液以近圓狀、充滿顆粒的紅色細胞為主，含少量的透明細胞；白色透明細胞主要分布在16%和35%～40%的Percoll工作液。16%的Percoll工作液以小型近圓狀透明細胞為主，同時含有少量的紅色顆粒細胞；35%和40%的Percoll工作液多為近圓狀、大透明細胞及極少數(shù)紅色顆粒細胞。

各密度層細胞群體的流式細胞分析結(jié)果如圖2所示。通過與完整體腔液細胞對比，根據(jù)其FSC和SSC特性，將體腔液細胞分為3個亞群(圖3)：R1 亞群的SSC值最小，表明細胞的顆粒程度最低，主要為白色透明細胞；R3亞群的FSC 和 SSC 值均較大，表明細胞體積較大且含顆粒較多，主要為紅色顆粒細胞；R2 亞群細胞的體積和顆粒程度處于 R1 和 R3 亞群之間，主要為半顆粒細胞。

注：A.16%的Percoll工作液；B.20%的Percoll工作液；C.26%的Percoll工作液；D.35%的Percoll工作液；E.40%的Percoll工作液。Note：A.16% Percoll solution；B.20% Percoll solution；C.26% Percoll solution；D.35% Percoll solution；E.40% Percoll solution.圖1 體腔液細胞Percoll不連續(xù)密度梯度離心圖Fig.1 Percoll discontinuous density gradient centrifugation results of coelomocytes

2.2 溶血試驗試驗結(jié)果表明，測試菌對體腔液細胞有一定的溶血效果。其中大腸桿菌引起的溶血現(xiàn)象較為迅速，混合后10 min即可形成明顯的溶血現(xiàn)象，隨時間的延長，溶血現(xiàn)象受到抑制(圖4A)；枯草芽孢桿菌引起的體腔液細胞溶血現(xiàn)象較為遲緩，但隨時間的延長，溶血現(xiàn)象持續(xù)發(fā)生(圖4B)。由此推測，單環(huán)刺螠體腔液細胞對大腸桿菌有一定的耐受能力。

注：A1和A2分別為EDTA-2K溶液FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖； B1和B2分別為Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖； C1和C2分別為體腔液細胞FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖； D1和D2為16%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖； E1和E2分別為20%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖； F1和F2分別為26%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖； G1和G2為35%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖； H1和H2分別為40%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點圖和等高線圖。Note:A1 and A2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of EDTA-2K respectively；B1 and B2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of Percoll origninal solution respectively；C1 and C2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of coelomic fluid cells respectively；D1 and D2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 16% Percoll solution respectively；E1 and E2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 20% Percoll solution respectively；F1 and F2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 26% Percoll solution respectively； G1 and G2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 35% Percoll solution respectively； H1 and H2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 40% Percoll solution respectively.圖2 不同Percoll工作液的流式細胞FSC 和 SSC 雙參數(shù)散點圖和等高線圖Fig.2 FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of flow cytometry in different Percoll solution

2.3 抗菌活性

2.3.1呼吸爆發(fā)水平測定。分別測定了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌刺激后單環(huán)刺螠體腔液細胞呼吸爆發(fā)水平的變化，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，在與2種細菌共培養(yǎng)后，單環(huán)刺螠體腔液細胞產(chǎn)生的活性氧(ROS)水平均高于對照(圖5A)，一氧化氮(NO)水平亦有所提高(圖5B)。隨著大腸桿菌濃度的升高，體腔液細胞產(chǎn)生的ROS變化不明顯(圖5A)，但 NO 水平隨著大腸桿菌濃度的增加而明顯增加(圖5B)。

2.3.2抗菌活性分析。將待測菌與單環(huán)刺螠體腔液細胞共培養(yǎng)1 h后，利用平板計數(shù)法測定了2種細菌的菌落數(shù)量，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，體腔液細胞對大腸桿菌有一定的殺傷效果，抑菌率為22.36%；體腔液細胞對枯草芽孢桿菌沒有殺傷效果，反而促進了其生長。體腔液細胞組大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的存活率分別為77.64%和179.35%。

3 討論與結(jié)論

該試驗采用Percoll不連續(xù)密度梯度可將單環(huán)刺螠體腔液細胞初步可分為3層，但分離效果不明顯，推測各層體腔液細胞間比重差異較小，后期有必要選擇更好的分離方法或條件。流式細胞術(shù)用FSC反映細胞體積大小，SSC反映細胞的顆粒度[26-27]。該研究通過將不同濃度的Percoll細胞層與完整體腔液細胞流式分布圖對比，將單環(huán)刺螠體腔液細胞聚為紅色顆粒細胞、半顆粒細胞和白色透明細胞3個亞群，與貝類、蝦類、蟹類等物種分類結(jié)果類似[11-12，14-17]；海洋無脊椎動物血細胞的種類及其細胞亞群隨季節(jié)和地點的不同而不同[28-29]，單環(huán)刺螠是否也存在此現(xiàn)象值得進一步研究。

注：A.FSC 和 SSC 雙參數(shù)散點圖；B.FSC 和 SSC 雙參數(shù)等高線圖。Note：A.FSC and SSC dual parameter scatter plot；B.FSC and SSC dual parameter contour map.圖3 單環(huán)刺螠體腔液細胞 FSC 和 SSC 雙參數(shù)散點圖及等高線圖Fig.3 FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of U.unicinctus coelomocytes

注：A.大腸桿菌對單環(huán)刺螠體腔液細胞的溶血效果；B.枯草芽孢桿菌對單環(huán)刺螠體腔液細胞的溶血效果。Note：A.Hemolytic effect of E. coli on U.unicinctus coelomocytes；B.Hemolytic effect of B.subtilis on U.unicinctus coelomocytes.圖4 細菌對單環(huán)刺螠體腔液細胞的溶血試驗結(jié)果Fig.4 Hemolysis experiment results of bacteria on U.unicinctus coelomocytes

注：A.ROS水平；B.NO水平。Note：A.ROS level；B.NO level.圖5 2種細菌對單環(huán)刺螠體腔液細胞呼吸爆發(fā)水平的影響Fig.5 The effects of two kinds of bacteria on the respiratory burst level of U.unicinctus coelomocytes

表1 2種細菌菌落數(shù)量的測定Table 1 Determination of the colonies of two kinds of bacteria 單位：CFU/mL

單環(huán)刺螠的體腔液存在一定的抑菌效果[30]。溶血試驗結(jié)果表明，大腸桿菌可快速導致體腔液細胞呈現(xiàn)溶血現(xiàn)象，但溶血現(xiàn)象隨時間的延長趨于平穩(wěn)，推測單環(huán)刺螠體腔液細胞對大腸桿菌具有一定的耐受性；單環(huán)刺螠體腔液細胞對枯草芽孢桿菌的耐受性較差，其溶血現(xiàn)象隨時間的延長而持續(xù)增加。作為細胞非特異性免疫防御的機制之一，呼吸爆發(fā)的過程可產(chǎn)生ROS、NO等對細菌、病毒或其他外來物的刺激，產(chǎn)生應答反應[31-32]。該試驗結(jié)果顯示，體腔液細胞可通過呼吸爆發(fā)對細菌進行殺滅，但殺菌效果隨細菌濃度的增加而增大有限，而平板計數(shù)結(jié)果表明單環(huán)刺螠體腔液細胞對大腸桿菌具有明顯的抑制作用，而對枯草芽孢桿菌的抑制效果不明顯。

該研究結(jié)合不連續(xù)密度梯度離心和流式細胞術(shù)對單環(huán)刺螠體腔液細胞進行了聚類分析，并初步測試了其體腔液細胞對不同類型細菌的抑菌/殺菌效果。后續(xù)仍要對單環(huán)刺螠生活周期、時空變化下的體腔液細胞差異進行深入研究，并逐步明確不同類型體腔液細胞的生理功能，以期為單環(huán)刺螠的育苗、養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)理論支撐。