王佳妮，于凱雯，徐方旭，王升厚，王 澤*

(1.沈陽師范大學生命科學學院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽師范大學實驗教學中心，遼寧沈陽 110034)

氧化應激(oxidative stress，OS)這一概念最早由衰老研究權威Sohal教授在1985年提出。正常情況下，生物體處于氧化與抗氧化的動態(tài)平衡狀態(tài)，受到有害刺激時，體內的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)或活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)會大量產生和蓄積，進而對生物大分子活性、細胞結構產生嚴重的破壞[1]，引起復雜的生理或病理損傷過程，如糖尿病、高血壓、肝病、癌癥等[2-4]。近年來，人工合成的抗氧化劑因其安全隱患備受爭議，如過量使用會引起致畸、癌變以及一些慢性疾病等危害，從天然生物資源中尋找有效的抗氧化物質用于維持人體及動物健康成為新的研究焦點[5]。

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr.) Link.]分類學上屬麥角菌科、蟲草屬，是我國傳統(tǒng)的食藥兩用真菌。研究顯示，蛹蟲草具有豐富的、非營養(yǎng)素類的抗氧化活性成分，其體外抗氧化活性得到了較為廣泛的解讀[6-8]。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是抗氧化酶系的重要組成成員，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用，蛹蟲草含有真核生物超氧化物歧化酶全部種類的同工酶Cu-SOD、Zn-SOD、Mn-SOD和 Fe-SOD[9]，且具有熱穩(wěn)定性高、酶活不受pH影響等優(yōu)勢[10]。此外，蛹蟲草黃色素對1,2-二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)具有很好的清除效果，其黃色素YP1、YP2和YP3的抗氧化效果與抗氧化劑VC相當。蟲草烯是一種分子量大小為263.115 8m/z的新型蛹蟲草黃色素，2 mg/mL蟲草烯的DPPH自由基清除活性與VC接近，可以提高老化HSF細胞的SOD、過氧化氫酶(CAT)活性，并降低丙二醛(MDA)水平[11]。此外，蛹蟲草多糖對DPPH自由基和羥自由基亦具有顯著的清除能力[12]。因此，該試驗利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導小鼠急性氧化損傷，評價日常服用蛹蟲草對機體氧化應激損傷的保護作用，為蛹蟲草作為天然抗氧化類功能性食品的應用潛質提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。SPF級KM小鼠，雌雄各半，體重18～20 g，于室溫(24±2)℃、濕度(55±5)%，自然光照條件下飼養(yǎng)，小鼠及維持鼠糧均購自遼寧長生生物技術有限公司。蛹蟲草子實體由沈陽師范大學功能性蛹蟲草省重點實驗室栽培提供，60 ℃烘干至恒重，粉碎機粉碎，過80目篩網，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩９辔盖耙哉麴s水配制成工作液使用。

1.1.2試劑。脂多糖(Sigma)、過氧化氫測試盒(分光光度法)、總抗氧化能力測試盒(ABTS法)、丙二醛測試盒(TBA法)、過氧化氫酶測試盒(ABTS法)，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器。電子天平(上海精密儀器有限公司)；臺式低溫離心機(上海湘怡離心機儀器有限公司)；-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司)；酶標儀(北京普天新橋技術有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1LPS氧化應激損傷模型的確立。KM小鼠隨機分為模型組和空白組，模型組腹腔注射0.5 mL/只LPS水溶液誘導氧化應激損傷，分別為6 mg/kg LPS組、8 mg/kg LPS組、10 mg/kg LPS組(n=5)，空白組注射同等劑量無菌水。記錄小鼠被毛、精神、運動和糞便情況，LPS注射前和注射24 h后小鼠體重記為W1和W2， LPS注射24 h后脫頸處死解剖，稱取小鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺重量，分別計算臟器指數和失重率(QW)，計算方法如下：

臟器指數=臟器重量(mg)/體重(g)×100%

QW=[W1(g)-W2(g)]/W1(g) ×100%

式中，f spk為復合地基承載力特征值，kPa；λ為單樁承載力發(fā)揮系數；m為面積置換率；R a為單樁承載力特征值，kN；A p為樁的截面積，m2；β為樁間土承載力發(fā)揮系數；f sk為處理后樁間土承載力特征值，kPa，應按靜載荷試驗確定，無試驗資料時可取天然地基承載力特征值。

1.2.2蛹蟲草的氧化應激保護作用。

1.2.2.1試驗分組及處理。KM小鼠隨機分為空白組、對照組和試驗組(n=30)，基于蛹蟲草推薦使用劑量標準0.03 g/kg，根據Meeh-Rubner公式得出小鼠基礎使用劑量為0.61 mg/g，試驗組以0.5 mL/只蛹蟲草水溶液連續(xù)灌胃28 d；空白組和對照組灌胃同等劑量蒸餾水；對照組及試驗組于最后一次灌胃1 h后，腹腔注射10 mg/kg LPS誘導氧化應激損傷。

1.2.2.2小鼠基礎生理狀態(tài)的觀察。每日觀察記錄各組小鼠精神狀態(tài)、飲水量及進食量。于LPS注射0、2、4、6、8 h，分別處死各組小鼠(n=6)，稱取肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、全腦重量，PBS緩沖液清洗后，裝入EP管，-80 ℃冰箱凍存待用，并計算臟器指數。

1.2.2.3氧化應激指標的定量檢測。稱取肝臟、腎臟、腦組織0.5 g，加入9 倍體積0.9%的生理鹽水，冰上勻漿，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min，收集組織液。按照各試劑盒說明書要求進行相關指標的檢測，其中，采用考馬斯亮藍蛋白法測定各組織的總蛋白含量，比色法檢測各組織總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫(H2O2)含量，檢測波長為405 nm。硫代巴比妥酸法測定各組織的MDA含量，檢測波長為532 nm。紫外法測定各組織的CAT活性，檢測波長為405 nm。各檢測組均為3復孔。

2 結果與分析

2.1 LPS誘導的小鼠氧化應激損傷LPS注射2 h后，各濃度組小鼠均出現不同程度的腹瀉情況，同時伴有扎堆、精神萎靡、嗜睡、呆臥懶動及豎毛現象，其中10 mg/kg LPS組異常狀況最為嚴重，至LPS注射后7 h恢復正常(圖1)。與對照組相比，10 mg/kg LPS引起小鼠肝臟指數明顯升高(P<0.05)(表1)，各試驗組之間失重率(QW)差異不明顯(P>0.05)(表2)。

注：A.小鼠被毛情況；B.小鼠糞便改變。Note:A.Mouse hair condition;B.Change of mouse feces.圖1 LPS腹腔注射對小鼠基礎生理狀態(tài)的影響Fig.1 Effect of LPS abdominal injection on basic physiological status of mice

表1 LPS腹腔注射對小鼠臟器指數的影響Table 1 Effect of LPS abdominal injection on mouse organ index 單位：%

2.2 蛹蟲草的抗氧化應激作用

2.2.1蛹蟲草對小鼠基礎生理狀態(tài)的影響。蛹蟲草灌胃28 d 未對各組小鼠精神、形態(tài)、行為、攝食飲水產生明顯影響(圖2)。LPS注射后8 h內，空白組精神、行為、活動量正常，對照組于LPS注射2 h后出現精神低迷、活動量下降等現象，試驗組相應異常現象明顯強于對照組。從表3可以看出，LPS注射后2～8 h,對照組小鼠肝臟指數出現持續(xù)性增大的趨勢，且明顯高于試驗組(P<0.05)，至8 h，試驗組肝臟指數接近空白組水平(P>0.05)；其他臟器指數各組間無明顯差異(P>0.05)。

表2 LPS腹腔注射對小鼠失重率的影響Table 2 Effect of LPS abdominal injection on the loss weight rate of mice

2.2.2蛹蟲草對小鼠抗氧化能力的影響。從表4～5可以看出，LPS注射后2～6 h，對照組和試驗組小鼠肝臟、腎臟及腦組織T-AOC指數、CAT活性均檢測到不同程度的降低情況，且對照組降低幅度更大。至試驗結束(8 h)，試驗組小鼠各組織的T-AOC指數、CAT活性均已接近空白組水平(P>0.05)，但對照組T-AOC指數、CAT活性仍處于較低水平(P<0.05)。

2.2.3蛹蟲草對小鼠各組織H2O2和MDA含量的影響。從表6～7可以看出，LPS注射后2～6 h,與空白組相比，對照組小鼠肝臟、腎臟及腦組織中的H2O2和MDA含量均明顯升高(P<0.05)，LPS注射未引起對照組和試驗組腦組織MDA含量的顯著性變化(P>0.05)。試驗組肝臟、腎臟H2O2與MDA含量升高趨勢均較為平緩，且2～6 h均顯著低于對照組(P<0.05)。至試驗結束(8 h)，對照組和試驗組各組織的MDA含量已無明顯差異(P>0.05)。

圖2 各組小鼠日攝食量(a)和飲水量(b)變化情況Fig.2 Changes of daily food intake (a) and water intake (b) of mice in each group

表3 LPS注射對各組小鼠臟器指數的影響Table 3 Effect of LPS injection on the visceral index of mice in each group 單位：%

3 討論

氧化應激是由自由基在體內產生的一種損傷，衰老和心臟病、阿爾茲海默癥等疾病的發(fā)生均與體內過激的氧化應激有關[13]。LPS是革蘭氏陰性細菌重要的內毒素，高劑量LPS會引起機體短暫的氧化應激反應，以胃腸應激癥狀較為明顯，經常被作為動物氧化應激反應的外部評價指標[14]。該試驗采用6、8、10 mg/kg 3個濃度的LPS腹腔注射，以確定LPS誘導小鼠氧化應激損傷的最佳劑量。研究結果顯示，6～10 mg/kg的LPS注射劑量均能成功誘導小鼠出現腹瀉、精神萎靡、活動量減少以及豎毛等癥狀，與穆盛田等[15]的研究結果相一致，但10 mg/kg LPS組小鼠腹瀉最為嚴重，活動量減少及豎毛現象直至7 h后逐漸恢復正常，同時，該組小鼠肝臟指數升高明顯(P<0.05)。因此，該試驗采用10 mg/kg的LPS注射劑量構建小鼠氧化應激損傷。

表4 LPS注射對各組小鼠T-AOC指數的影響Table 4 Effect of LPS injection on T-AOC index of each group of mice 單位：U/mg

表5 LPS注射對各組小鼠CAT活性的影響Table 5 Effect of LPS injection on CAT activity of each group of mice 單位：U/mg

表6 LPS注射對各組小鼠H2O2含量的影響Table 6 Effect of LPS injection on H2O2 content of each group of mice 單位：mmol/g

表7 LPS注射對各組小鼠MDA含量的影響Table 7 Effect of LPS injection on MDA content of each group of mice 單位：nmol/mg

蛹蟲草作為一種藥用真菌，含有豐富的抗氧化生物活性成分，由此該試驗通過檢測小鼠主要器官組織中氧化應激因子的含量和活力，探究蛹蟲草的體內抗氧化應激保護作用。在注射LPS后2～8 h，對照組小鼠肝臟指數增大明顯(P<0.05)，這與楊毅等[16]的研究結果一致，同時，試驗組肝臟指數顯著低于對照組(P<0.05)。CAT是機體典型的抗氧化酶，可拮抗機體產生過量的H2O2，T-AOC指數顯示了機體的總抗氧化酶活力，抗氧化物系統(tǒng)功能狀態(tài)，其含量與細胞抗氧化能力呈正相關。由試驗結果可以看出，LPS注射后4～6 h，試驗組各組織的T-AOC指數、CAT活性均高于對照組(P<0.05)，至試驗結束(8 h)，試驗組T-AOC指數、CAT活性已恢復至空白組水平，但對照組T-AOC指數、CAT活性仍顯著低于其他兩組(P<0.05)。說明日常服用蛹蟲草能夠強化機體應對急性氧化應激刺激的能力，有助于機體抗氧化系統(tǒng)功能狀態(tài)的恢復，對肝臟的保護作用最為明顯。

MDA是膜脂過氧化的終產物之一，MDA含量能間接考察細胞受到脅迫嚴重程度，是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數[17]。H2O2由ROS轉化而來，組織中H2O2含量升高可直接對各器官組織造成傷害[18]。LPS注射引起對照組肝臟、腎臟、腦組織中的MDA和H2O2含量明顯增加，說明小鼠肝臟和腎臟是應對LPS氧化應激較為敏感的器官。阮佼[19]的研究結果證實，LPS可導致小鼠肝臟、腎臟、腦、肺、空腸等組織中MDA含量增高，CAT、SOD等抗氧化酶活性降低。張明亮等[20]研究表明，蛹蟲草的黃色素成分具有很好地清除自由基活性的作用。該研究發(fā)現，LPS注射后2～6 h，試驗組各組織中的MDA和H2O2含量上升趨勢較為平緩，說明日常服用蛹蟲草可以增強機體對MDA和H2O2的清除能力，縮短機體自由基系統(tǒng)恢復平衡的時間，避免機體遭受更為嚴重的氧化應激攻擊。

氧化應激反應是生物體內遭遇外部不良物質刺激最常見的應答方式，過激的氧化應激反應則會造成機體意想不到的氧化損傷。該試驗以小鼠LPS氧化應激模型評價了蛹蟲草的體內抗氧化損傷能力，研究結果顯示，短時間服用蛹蟲草可以增強機體的抗氧化平衡狀態(tài)，該試驗為蛹蟲草抗氧化活性的研究和應用提供了新的科學依據。