劉莉萍，林素轉(zhuǎn)，金 剛，沈 麗*，周 靖

(1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳 518055；2.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東深圳 518073)

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻(Caulerpalentillifera)隸屬綠藻門(Chlorophyta)[1]，是一種高蛋白、高纖維、低脂肪，且富含維生素、氨基酸、礦物質(zhì)及不飽和脂肪酸等的可食用綠藻[2-5]，但因其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境及水質(zhì)的要求高，人工養(yǎng)殖難度較大，目前國(guó)內(nèi)僅分布于福建、海南及廣東等地?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的相關(guān)研究文獻(xiàn)尚不夠豐富，其食用及開(kāi)發(fā)利用的多樣性因此也比較有限[6-7]。該試驗(yàn)以長(zhǎng)莖葡萄蕨藻為研究對(duì)象，采用氨基酸比值系數(shù)法分析其氨基酸組成及蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為合理開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻來(lái)源于深圳某岸基廠房式水泥池養(yǎng)殖場(chǎng)，冷凍-80 ℃保存。 將試樣用淡水沖洗清除表面殘留物，再用去離子水洗3～5次。按長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的生長(zhǎng)階段特點(diǎn)，將藻逐一區(qū)分并對(duì)應(yīng)編號(hào)，包括匍匐莖(I)以及長(zhǎng)度分別<3 cm(Ⅱ)、3～5 cm(Ⅲ)、>5～7 cm(Ⅳ)、>7～10 cm(Ⅴ)、>10 cm(VI)的直立枝這6類樣品，分別于100 ℃烘箱中烘干至恒重后粉碎，過(guò)100目篩后，存于干燥器備用。

1.1.2試劑。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，包括天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、氯化銨(NH4Cl)18種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種氨基酸濃度為2.5 μmol/mL，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。濃鹽酸，濃度≥36%，分析純，廣州市東紅化工廠；茚三酮顯色液，購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；超純水，電阻率≥18.2 MΩ·cm(25 ℃)；硫酸銨、檸檬酸鈉、硼酸、硫酸銅、檸檬酸、乙醇、氯化鈉、硫酸鉀、95%乙醇、硫酸、氫氧化鈉，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3儀器設(shè)備。Kjeltec 8200凱氏定氮儀，福斯分析儀器(蘇州)有限公司；L-8900高速全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立(HITACHI)；AB204-S電子分析天平，梅特勒-托利多公司；RX-UPTC超純水機(jī)，上海睿析科學(xué)儀器有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SA-N2-10C氮?dú)獍l(fā)生器，英國(guó)PerMuta通用實(shí)驗(yàn)科技國(guó)際有限公司；JYL-C012多能料理機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司；HW·SY11K恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試樣制備。使用多功能料理機(jī)將已烘干至恒重的6類長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品分別磨成粉末后，裝至密封袋中。

1.2.2氨基酸的測(cè)定。

1.2.2.1試樣預(yù)處理。準(zhǔn)確稱取約0.02 g(精確至0.1 mg)的待測(cè)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末于30 mL玻璃水解管中，分別加入6 mol/L的鹽酸15 mL，充氮?dú)? min并封口，110 ℃水解22 h。將水解后的液體轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中，60 ℃水浴蒸干，用0.02 mol/L的鹽酸沖洗并倒入25 mL容量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后存于安培瓶。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制。用0.2 mol/L鹽酸將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。

1.2.2.3工作條件選擇。氨基酸分析儀參數(shù)設(shè)定：色譜柱為4.6 mm×60 mm(填料2622)，柱溫57 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm(Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg)、440 nm(Pro)，柱后衍生劑為茚三酮溶液，其梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.2.2.4水解時(shí)間的單因素試驗(yàn)。在保證長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品其他處理?xiàng)l件一致的情況下，進(jìn)行水解時(shí)間分別為8、18、22、26、38 h的單因素試驗(yàn)，測(cè)定對(duì)應(yīng)樣品中的氨基酸含量。

1.2.2.5試樣測(cè)定。將長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品處理所得的溶液于570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg,Pro在440 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，采用單點(diǎn)校正法定量分析。

1.2.2.6氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(WHO/FAO)共同修訂的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸模式譜(1973年版本)[8]，分析長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。主要指標(biāo)包括氨基酸總量(TAA)、必需氨基酸總量(EAA)、非必需氨基酸總量(NEAA)、必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)和比值系數(shù)分(SRC)。

1.2.3蛋白質(zhì)的測(cè)定。

1.2.3.1試樣預(yù)處理。參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[9]，準(zhǔn)確稱取約1 g(精確至0.1 mg)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品放于消化管中，加入3 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅、12 mL 硫酸，于消化爐消化，直至溫度達(dá)到420 ℃，繼續(xù)消化1 h，最終試液呈淡綠色近透明狀，冷卻后取出。

1.2.3.2分析程序。用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定預(yù)處理后的樣品中的蛋白質(zhì)含量，分析程序設(shè)定為稀釋液80 mL、堿50 mL、接受液30 mL、模式時(shí)間5 s、蒸餾時(shí)間5 min、消化管排空、安全模式、蒸汽量100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理使用Excel 2013整理測(cè)定數(shù)據(jù)、 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸測(cè)定

2.1.1氨基酸測(cè)定最佳條件。不同水解時(shí)間條件下測(cè)定Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg共17種氨基酸總含量(以干重計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，不同水解時(shí)間下各藻樣中氨基酸含量的變化趨勢(shì)接近，其中水解22 h的氨基酸總量相對(duì)較大且變化趨勢(shì)較平穩(wěn)，故確定最佳水解時(shí)間為22 h。

表2 不同水解時(shí)間條件下的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻總氨基酸含量Table 2 Total amino acid content of Caulerpa lentillifera under different hydrolysis time 單位：g/kg

2.1.2氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液測(cè)定。17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，17個(gè)氨基酸峰之間的分離度均大于1.2，柱效穩(wěn)定，分離效果良好。各氨基酸保留時(shí)間如表3所示。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液色譜圖Fig.1 Chromatogram of amino acid standard mixture

表3 氨基酸及氨保留時(shí)間Table 3 Retention time of amino acids and ammonia

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。在優(yōu)化儀器工作條件下測(cè)定相應(yīng)氨基酸的信號(hào)響應(yīng)值，以相應(yīng)氨基酸的濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0～0.50 μmol/mL，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，所繪制的各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)均不小于0.998 7，且各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.1.4方法的精密度考察。選取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻試樣進(jìn)行精密度試驗(yàn)，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表 5。由表5可知，17種氨基酸的 RSD 均不大于6.5%，具有良好的精密度。

2.1.5方法的準(zhǔn)確度考察。選取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻試樣，按優(yōu)化的工作條件，加入1.00 mL 0.4 μmol/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率驗(yàn)證，平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表6。 由表6可知，17種氨基酸的加標(biāo)回收率在90.51%～103.50%，方法準(zhǔn)確可靠。

2.1.6不同生長(zhǎng)階段各氨基酸含量測(cè)定。與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液相同條件下測(cè)定不同生長(zhǎng)階段的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品，探究其氨基酸含量與生長(zhǎng)時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻氨基酸含量呈現(xiàn)先增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。方差分析結(jié)果顯示，P值>0.05，F(xiàn)

表4 17種氨基酸線性關(guān)系Table 4 Linear relationship of 17 amino acids

表5 方法的精密度(n=6)Table 5 Precision of the method

表6 優(yōu)化方法的準(zhǔn)確度Table 6 Accuracy of optimization method

2.1.7氨基酸組分分析。采用上述測(cè)定中各氨基酸含量的平均值，對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品的氨基酸組分進(jìn)行必需氨基酸和呈味氨基酸的含量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表7)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品中17種氨基酸含量為204.7 g/kg(以干重計(jì))；長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中氨基酸含量較高的為Glu(22.4 g/kg)、Asp(21.9 g/kg)、Gly(21.3 g/kg)，三者總占比為32.05%。呈味氨基酸中鮮味氨基酸(Glu、Asp)含量最高，占總量的21.64%；其次是甜味氨基酸(Gly、Ala)，占總量的16.90%；所有呈味氨基酸總和占總量的48.80%。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻獨(dú)特的鮮味可能與其中高含量的呈味氨基酸有關(guān)。

2.1.8必需氨基酸含量。根據(jù)FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式譜，當(dāng)EAA/TAA為40%左右、EAA/NEAA在60%以上時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)量較好。由表7可知，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中EAA/TAA為37.47%，EAA/NEAA為66.41%，可見(jiàn)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的氨基酸組成完全符合理想蛋白質(zhì)模式譜。

2.1.9氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)。氨基酸比值系數(shù)法是以氨基酸平衡理論為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)比目標(biāo)物質(zhì)中必需氨基酸比例與 FAO/WHO 氨基酸模式譜之間的差距大小來(lái)評(píng)價(jià)氨基酸營(yíng)養(yǎng)，通常比例與模式譜越接近，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高[10]。將表7中長(zhǎng)莖葡萄蕨藻必需氨基酸EAA值與FAO/WHO模式譜中相應(yīng)氨基酸的EAA值進(jìn)行比較，并計(jì)算長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的RAA、RC和SRC，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的必需氨基酸總量高于 FAO/WHO 氨基酸模式譜，其中有Thr、Val、 Ile、Leu、Phe+Tyr 這5項(xiàng)符合且高于模式譜要求，Met+Cys、Lys也很接近模式譜要求。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻SRC值為70.3，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與利用率較高，很適合作為食用性人體蛋白源。

表7 不同生長(zhǎng)階段的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻各氨基酸測(cè)定結(jié)果Table 7 Determination results of amino acids in Caulerpa lentillifera at different growth stages 單位：g/kg

表8 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與模式譜比較Table 8 Comparison between the mass fraction of essential amino acids of Caulerpa lentillifera in the total amino acids and the model spectrum

2.2 蛋白質(zhì)測(cè)定

2.2.1方法的精密度考察。對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品進(jìn)行6個(gè)平行處理，使用自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定(以干重計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可知，蛋白質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于1.39%，表明該儀器性能穩(wěn)定。

2.2.2方法的準(zhǔn)確度考察。對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品進(jìn)行兩平行兩加標(biāo)處理，計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表10。由表10可知，其平均回收率為100.79%，說(shuō)明該儀器測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高。

表9 方法的精密度(n=6)Table 9 Precision of the method

表10 方法的準(zhǔn)確度Table 10 Accuracy of the method

2.2.3樣品蛋白質(zhì)的測(cè)定。對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品進(jìn)行2個(gè)平行處理，測(cè)定蛋白質(zhì)含量(以干重計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表11。由表11可知，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻蛋白質(zhì)含量與氨基酸含量(表7)變化相似，均呈現(xiàn)先增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品蛋白質(zhì)平均含量為235.8 g/kg(以干重計(jì))，高于一般海藻(海帶87 g/kg干重[2]，羊棲菜123 g/kg干重[2]，石莼154.0 g/kg干重[2])，是一種良好的藻類蛋白源。

表11 樣品蛋白質(zhì)含量Table 11 Protein content of samples 單位：g/kg

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。衡量其質(zhì)量的優(yōu)劣，一看其氨基酸是否齊全，二看氨基酸含量組成是否符合理想蛋白質(zhì)模式譜。該研究發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)期的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品中各氨基酸含量及總量無(wú)明顯差異；長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品中蛋白質(zhì)含量為235.8 g/kg(以干重計(jì))，17種氨基酸含量為204.7 g/kg(以干重計(jì))。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中氨基酸種類豐富，含量較高的為Glu、Asp、Gly，三者總占比為32.05%，而3種氨基酸均為呈味氨基酸，具有良好鮮味感和誘食作用，有利于將長(zhǎng)莖葡萄蕨藻制作成即食食品和海鮮調(diào)味品。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中EAA/TAA為37.47%，EAA/NEAA為66.41%，氨基酸組成完全符合世界衛(wèi)生組織推薦的理想蛋白質(zhì)模式譜，且長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的必需氨基酸總量高于 FAO/WHO 氨基酸模式譜，大部分指標(biāo)項(xiàng)符合且高于模式譜。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻SRC值為70.3，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與利用率較高，易于人類吸收，具有較高的食用開(kāi)發(fā)價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。