魏建華，李冠斯，黃學(xué)泓，許如蘇

(汕頭海關(guān)技術(shù)中心，廣東汕頭 515031)

紅木作為一類珍貴的木材資源，它不是樹木分類學(xué)上某個(gè)樹種的名稱，而是來(lái)源于明清時(shí)代的宮廷、王府及不同地區(qū)的生產(chǎn)者和經(jīng)銷商，經(jīng)長(zhǎng)期自然形成的經(jīng)過(guò)歸類的木材商品名。由于其具有特征性顏色與良好物理力學(xué)性能而備受人們青睞，在不同時(shí)代不同地區(qū)紅木都有著不同的內(nèi)涵[1]。由于紅木類資源非常短缺，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng)，人們對(duì)木質(zhì)材料的追求不論質(zhì)還是量都越來(lái)越高，所以紅木價(jià)格很高，其中不同種類的紅木價(jià)格差別又極大。由于紅木造假利潤(rùn)空間極大，于是以次充好、以假亂真的現(xiàn)象較為普遍[2-3]。

蝶形花科黃檀屬降香紫檀(Dalbergiaodorifera)，由于分布在我國(guó)海南島，所以也稱海南黃花梨，樹種的立地條件、氣候條件等區(qū)別，造就了降香黃檀分油梨和糠梨2種，兩者顏色、紋理和密度外形有所差別。由于木材名稱一般是以屬為基礎(chǔ)，把特征相似、性質(zhì)相近、用途相同的種歸類，沒(méi)有辦法將同屬降香黃檀的兩類區(qū)分出來(lái)。傳統(tǒng)木材鑒定以木材解剖學(xué)為依據(jù)，如我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18107—2017《紅木》[4]，通過(guò)木材的一些微觀解剖結(jié)構(gòu)如生長(zhǎng)輪類型、心材材色、軸向薄壁組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)、香氣等進(jìn)行鑒別，傳統(tǒng)木材鑒定往往對(duì)紅木鑒定到“屬”，鑒定到“種”就很困難，而油梨和糠梨是降香黃檀樹種以下的分類。傳統(tǒng)木材鑒定主要是以簡(jiǎn)便實(shí)用的宏觀特征(如密度、材色、重量、結(jié)構(gòu)和紋理)為依據(jù)來(lái)確定，輔以必要的木材解剖特征與觀察記載相比較，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)木材的鑒定[5-6]。但是市場(chǎng)上由于油梨和糠梨質(zhì)地和消費(fèi)者的偏好，導(dǎo)致兩者價(jià)格差別很大。紅木專家有根據(jù)兩者產(chǎn)地、顏色、紋理和密度外形的差別進(jìn)行區(qū)別的經(jīng)驗(yàn)，但是有一定的主觀不確定性，尤其對(duì)于不易區(qū)分出的又像油梨又像糠梨，不具有客觀統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。該研究嘗試直接對(duì)降香黃梨木材提取物進(jìn)行高效液相分析，將試驗(yàn)分析與化學(xué)計(jì)量法兩者結(jié)合分析，依據(jù)油梨和糠梨所含有的化學(xué)成分的區(qū)別，采用高效液相法結(jié)合指紋圖譜分析，以期較準(zhǔn)確區(qū)分降香黃梨木中的油梨和糠梨[9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó))，DAD檢測(cè)器，四元梯度泵；Millipore Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó))；梅特勒-托利多AL204-IC電子分析天平(瑞士)；CBL photoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超聲波清洗器。乙腈、甲酸為色譜純；液相用水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)材料降香黃檀紅木樣品是原汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局多年來(lái)積累紅木標(biāo)本；通過(guò)汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局木材鑒定人員的鑒定，結(jié)合報(bào)檢的原產(chǎn)地資料，正確定名的樹種樣品，請(qǐng)木材鑒定人員根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18107—2017《紅木》的鑒定定名；隨機(jī)抽取正確定名的樹種其中一樣品送原廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心國(guó)家木制品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定，并出具鑒定證書作為定名的復(fù)核方式。降香黃檀拉丁文名為D.odoriferaT.C.Chen，屬于黃檀屬，香枝木類，產(chǎn)地為中國(guó)，該研究使用的樣品分別為糠梨9個(gè)、油梨7個(gè)。

1.3 供試品的制備稱取降香黃檀紅木樣品(已經(jīng)通過(guò)傳統(tǒng)木材形態(tài)學(xué)鑒定，被正確定名的樣品)心材部分木屑0.2 g(精確至0.001 g)，包括典型的油梨和糠梨心材部分，置于50 mL離心管中，加入5 mL甲醇、5 mL高純水，振搖5 min，超聲提取5 min，濾紙過(guò)濾，再以0.2 μm的微孔濾膜過(guò)濾后備用[9]。

1.4 色譜條件色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒徑5 μm，柱長(zhǎng)250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm；以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按照表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.5 樣品測(cè)定吸取“1.3”所得供試品溶液，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，進(jìn)樣量為20 μL。按照“1.4”色譜條件分析測(cè)定，采集103 min色譜數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析將經(jīng)過(guò)高效液相采集的木材圖譜，導(dǎo)入色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件中進(jìn)行指紋圖譜共有峰、強(qiáng)峰、特征峰確證和相似度分析，通過(guò)多個(gè)典型的油梨和糠梨降香黃檀紅木樣品，建立對(duì)應(yīng)的油梨和糠梨的對(duì)照?qǐng)D譜，并建立譜庫(kù)。

對(duì)于每個(gè)收集到的降香黃檀樹種的高效液相采集的譜圖，將其導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，選取時(shí)間窗寬度為0.1～0.2 min，以中位數(shù)生成對(duì)照譜圖，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成其指紋圖譜對(duì)照譜圖，并計(jì)算所比對(duì)批次樣品的指紋圖譜與該對(duì)照譜圖的相似度。在多批降香黃檀的共有峰中篩選出峰面積較高的且穩(wěn)定出現(xiàn)的峰作為油梨和糠梨的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的特征峰，從而建立降香黃檀中油梨和糠梨的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜指紋圖譜的建立分別測(cè)定7批典型的油梨和9批典型的糠梨HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行分析比較，得到由其共有特征峰構(gòu)成的區(qū)別降香黃檀中油梨和糠梨的指紋圖譜，見圖1。

圖1 降香黃檀中油梨和糠梨的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.1 Standard fingerprint of oil pear and bran pear in Dalbergia odorifera

分別將7批油梨和9批糠梨樣品指紋圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，選取時(shí)間窗寬度為0.2 min，以中位數(shù)生成對(duì)照譜圖，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，分別生成油梨指紋圖譜和糠梨指紋圖譜共有模式，并分別計(jì)算與對(duì)應(yīng)共有模式的相似度。油梨共有模式含有共有特征峰17個(gè)，保留時(shí)間分別為10.194、19.575、24.208、25.627、27.305、28.141、31.900、33.785、38.336、39.618、41.636、45.414、47.237、48.495、54.045、56.92、61.009 min，以12號(hào)峰峰面積最大。其中油梨的17個(gè)共有峰和糠梨的6個(gè)共有峰，經(jīng)驗(yàn)證其信噪比S/N都大于10，說(shuō)明峰信號(hào)穩(wěn)定，分別在各批次都穩(wěn)定出現(xiàn)，故確定其為共有特征峰。油梨的12號(hào)峰和糠梨的2號(hào)峰具有非常相近的保留時(shí)間，分別為45.414和45.457 min。7批油梨與其對(duì)照?qǐng)D譜相似度分別為0.851、0.909、0.909、0.891、0.871、0.950、0.888，7批樣品的相似度均在0.800以上。糠梨共有模式含有共有特征峰6個(gè)，保留時(shí)間分別為24.269、45.457、47.308、61.786、65.923、69.918 min，以5號(hào)峰峰面積最大；9批糠梨與其對(duì)照?qǐng)D譜相似度分別為0.921、0.898、0.950、0.946、0.985、0.816、0.986、0.835、0.985，9批樣品的相似度均在0.800以上。

2.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并設(shè)置區(qū)別油梨和糠梨的判斷指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的目的是避免了保留時(shí)間數(shù)據(jù)漂移和色譜檢測(cè)儀器造成的峰面積不一致問(wèn)題，以便于使用多元分析法進(jìn)行分類。樣品指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，首先需要確定基峰，其次樣品指紋圖譜中共有特征峰的保留時(shí)間和峰面積與基峰的保留時(shí)間和峰面積的比值為相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

以油梨和糠梨共有峰保留時(shí)間是(45.414±0.500)min作為參照峰，分別列出油梨樣品17個(gè)共有峰和糠梨樣品的6個(gè)共有峰，并分別列出所述7批油梨和9批糠梨保留的油梨樣品和糠梨樣品對(duì)應(yīng)各自參照峰的相對(duì)峰面積，通過(guò)大量試驗(yàn)，反復(fù)比對(duì)，找到區(qū)別油梨和糠梨的特征，參見表2。

油梨和糠梨都包含保留時(shí)間是45.414 min的峰，而且峰面積都很大，兩者的主要區(qū)別表現(xiàn)為最大峰和特征峰的不同：①最大峰，油梨的峰面積最大峰保留時(shí)間為45.414 min，糠梨的峰面積最大峰保留時(shí)間為65.923 min。②特征峰，3個(gè)特征峰的保留時(shí)間分別為19.575、27.305、39.618 min，油梨同時(shí)含有這3個(gè)特征峰；糠梨僅含有其中1個(gè)或者2個(gè)峰，不同時(shí)包含。

為了盡量消除各種其他的原因?qū)е赂咝б合嗌V方法獲得的指紋圖譜保留時(shí)間漂移帶來(lái)的影響，該研究設(shè)置區(qū)別油梨和糠梨的判斷指標(biāo)，設(shè)定為保留時(shí)間(45.414±0.500)min、面積最大的特征峰作為參照峰，5個(gè)特征峰采用與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間表示，分別是0.431、0.601、0.872、1.000、1.452，根據(jù)這5個(gè)特征峰的有無(wú)以及最大峰面積，區(qū)分油梨和糠梨。對(duì)于降香黃檀樣品，判斷其是油梨或者糠梨標(biāo)準(zhǔn)：①油梨，至少同時(shí)具有4個(gè)特征峰，相對(duì)保留時(shí)間分別是0.431、0.601、0.872、1.000，并且面積最大的峰是相對(duì)保留時(shí)間為1.000的特征峰梨；②糠梨，至少同時(shí)具有2個(gè)特征峰，相對(duì)保留時(shí)間分別是1.000和1.452，面積最大的峰是相對(duì)保留時(shí)間為1.452的特征峰，且不同時(shí)包含相對(duì)保留時(shí)間分別是0.431、0.601、0.872這3峰。

表2 7批油梨和9批糠梨的區(qū)別特征Table 2 Differences between 7 batches of oil pears and 9 batches of bran pears

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn)。取油梨同一供試品溶液，依據(jù)“1.4”色譜條件、“1.5”樣品測(cè)定方法，連續(xù)進(jìn)樣5次。將其指紋色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，與生成的對(duì)照指紋圖譜對(duì)比，各圖譜的相似度均大于0.984。以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算出1～17號(hào)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3.0%，且相對(duì)峰面積的RSD均小于0.5%，表明儀器穩(wěn)定、精密度良好。

2.3.2重現(xiàn)性試驗(yàn)。取同一批油梨木屑，精密稱取5份，按“1.3”供試品制備方法平行制備5份供試品溶液，分別依據(jù)“1.4”色譜條件、“1.5”樣品測(cè)定方法進(jìn)樣，同法進(jìn)行檢測(cè)。將其指紋色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，與生成的對(duì)照指紋圖譜相比，5份樣品的相似度均大于0.990。以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算出1～17號(hào)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0%，由于天然紅木樣品的不均一性，4號(hào)峰相對(duì)峰面積的RSD為0.9%，其他共有峰相對(duì)峰面積的RSD均小于0.5%，表明該方法共有峰保留時(shí)間重現(xiàn)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)。取油梨同一份供試品溶液(C3)，依據(jù)“1.4”色譜條件、“1.5”樣品測(cè)定方法，分別于0、3、6、9、15、24 h進(jìn)樣檢測(cè)。將其指紋色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，與生成的對(duì)照指紋圖譜相比，6份樣品的相似度均大于0.980。以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算出1～17號(hào)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5%，且相對(duì)峰面積的RSD均小于0.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 小結(jié)與討論

對(duì)紅木的鑒定不能照搬中藥材質(zhì)量控制、道地性和真?zhèn)舞b別的指紋圖譜方法，紅木樹種鑒定的相似度判斷指標(biāo)和相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差判斷指標(biāo)比一般的中藥材等一年生的植物的范圍要寬一些才有實(shí)用意義。其保留時(shí)間的含義是對(duì)應(yīng)樣品所含的化學(xué)成分，峰面積含義是該化學(xué)成分的量，為了盡可能地減少各種條件造成的高效液相保留時(shí)間的漂移對(duì)指紋圖譜的影響，所以在此研究相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

該研究提供一種應(yīng)用指紋圖譜區(qū)別降香黃檀中油梨和糠梨的方法。具體如下：將降香黃檀的供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，獲得指紋圖譜；其中將保留時(shí)間(45.414±0.500)min且面積最大的特征峰作為參照峰；若指紋圖譜至少包含相對(duì)保留時(shí)間分別是0.431、0.601、0.872、1.000的4個(gè)峰，并且其中相對(duì)保留時(shí)間為1.000的特征峰是指紋圖譜中峰面積最大的特征峰，那么降香黃檀為油梨；若指紋圖譜至少包含相對(duì)保留時(shí)間為1.000和1.452這2個(gè)峰，且相對(duì)保留時(shí)間為1.452的特征峰是指紋圖譜中峰面積最大的特征峰，相對(duì)保留時(shí)間分別是0.431、0.601、0.872的這3個(gè)特征峰并不同時(shí)在該指紋圖譜中出現(xiàn)，那么降香黃檀為糠梨。對(duì)于已知降香黃檀的紅木，可以利用指紋圖譜相似度軟件分析相似度，結(jié)合共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行油梨和糠梨的進(jìn)一步分類判斷。

作為指紋圖譜研究的重要參數(shù)色譜條件中波長(zhǎng)的選擇，主要是考慮2個(gè)方面：一方面，能較多地檢測(cè)出木材浸提物中的化學(xué)物質(zhì)，以便于呈現(xiàn)其整體特征，又不能太多，否則色譜峰數(shù)量太多對(duì)后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析帶來(lái)的工作量太大；另一方面，對(duì)于降香黃檀的指紋圖譜研究，其目的在于油梨和糠梨的區(qū)分，而不是研究其所含化學(xué)成分，所以需要采用一致的紫外波長(zhǎng)，即選擇一個(gè)能兼顧多種紅木樹種或者摻偽樹種指紋圖譜的研究，以便于比較。沈明月等[10]采用波長(zhǎng)為290 nm研究了4種紅木的HPLC指紋圖譜，該研究參照文獻(xiàn)，采用同樣的波長(zhǎng)。從該研究的結(jié)果來(lái)看，采用該波長(zhǎng)能夠滿足降香黃檀中油梨和糠梨的區(qū)分。

對(duì)于木材識(shí)別，由最早的樹木分類科、屬系統(tǒng)根據(jù)宏觀的顏色、氣味、氣干密度等特征，發(fā)展到根據(jù)微觀的木材解剖學(xué)角度的顯微結(jié)構(gòu)識(shí)別。降香黃檀中由于稀缺程度，木質(zhì)特點(diǎn)，油梨和糠梨的價(jià)格相差懸殊。HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜技術(shù)具有人為因素較小、分辨率高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，作為一種輔助傳統(tǒng)方法的木材識(shí)別方法，可以鑒定到降香黃檀這個(gè)樹種內(nèi)部的分類，對(duì)于木材交易市場(chǎng)、木材經(jīng)銷商、消費(fèi)者、公安機(jī)關(guān)、海關(guān)和科研機(jī)構(gòu)等具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。