李燕，劉磊，馬宇，唐芳，劉雙鳳

610500 成都，成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，生存率最高僅達(dá)9%［1］。轉(zhuǎn)移是胰腺癌高致死率，預(yù)后差的重要因素［2］。揭示胰腺癌轉(zhuǎn)移的誘因及機(jī)制對(duì)于探索胰腺癌的有效治療至關(guān)重要。大量研究證實(shí)由各種因素組成的腫瘤微環(huán)境在癌癥轉(zhuǎn)移中起著重要作 用［3-4］。胰腺癌患者常并發(fā)胰腺炎［5］而使癌細(xì)胞亦處于胰腺炎腫瘤微環(huán)境中，但胰腺炎腫瘤微環(huán)境是否會(huì)促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移尚不清楚。絲氨酸蛋白酶 2（serine protease 2，PRSS2）屬于絲氨酸蛋白酶，編碼陰離子胰蛋白酶原。PRSS2基因表達(dá)上調(diào)是胰腺炎的標(biāo)志，其表達(dá)量與胰腺損傷的程度呈正相關(guān)［6］。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PRSS2基因在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞腺癌惡病質(zhì)伴癌轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)均上調(diào)［7］。PRSS2基因過(guò)表達(dá)已被證實(shí)促進(jìn)胃癌遷移、侵襲并導(dǎo)致不良預(yù)后［8］，然而PRSS2在處于胰腺炎腫瘤微環(huán)境中的胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍不明確。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是解釋腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，意味著腫瘤轉(zhuǎn)移的開始［9-11］。EMT始于癌前病變并貫穿于腫瘤形成及侵襲轉(zhuǎn)移全過(guò)程［12］。EMT發(fā)生后細(xì)胞由多邊形變?yōu)樗笮?，上皮樣?biāo)志物上皮性鈣粘附素（E-cadherin，E-cad）表達(dá)下調(diào)及間充質(zhì)樣標(biāo)志物神經(jīng)性鈣粘附素（N-cadherin， N-cad）表達(dá)上調(diào)是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志［13］。本研究旨在探討PRSS2重組胰蛋白酶是否誘導(dǎo)胰腺癌Panc-1細(xì)胞株發(fā)生EMT，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化，探索其與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為胰腺癌的早期干預(yù)及有效治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胰腺癌細(xì)胞株（Panc-1）為本實(shí)驗(yàn)室保存；PRSS2重組胰蛋白酶購(gòu)自上海雅心生物技術(shù)有限公司；E-cad抗體、N-cad 抗體購(gòu)自Santa公司；二抗購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司；細(xì)胞蛋白抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amerso公司； BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；彩虹預(yù)染寬分子量蛋白Marker購(gòu)自中國(guó)北京新拓達(dá)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)庫(kù)分析利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn）進(jìn)入生存率分析界面，基因?qū)υ捒蜉斎隤RSS2， 顯示風(fēng)險(xiǎn)比，選擇95%置信區(qū)間，選擇月為軸單位，數(shù)據(jù)集選擇胰腺癌，選擇臨界值為4%，高于4%作為高表達(dá)隊(duì)列，低于4%作為低表達(dá)序列，最后分別選擇患者總生存期及無(wú)病生存期，輸出 結(jié)果。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)Panc-1細(xì)胞復(fù)蘇后于10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合的DMEM高糖培養(yǎng)基中37℃，5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，兩天換一次液，細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合度時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)將Panc-1細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合度后，加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h，用100 μL的槍頭在單層細(xì)胞上做“十”字形劃痕，PBS洗3次，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別加入400 ng/mL、300 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL 和10 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶，于培養(yǎng)0 h、12 h及24 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行顯微鏡下采集圖像。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)將培養(yǎng)的Panc-1細(xì)胞分為3組，對(duì)照組（加入普通培養(yǎng)基）、 胰蛋白酶組（培養(yǎng)基中加入100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶）和胰蛋白酶抑制劑組（培養(yǎng)基中加入100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶+5 μg/mL胰蛋白酶抑制劑）。每組加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后分別用PBS洗3次，加入蛋白提取液裂解30 min后收集裂解液，離心取上清。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。分別取對(duì)照組、胰蛋白酶組和胰蛋白酶抑制劑組各50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量剪膜，將膜浸入封閉液中封閉1 h，分別將PVDF膜浸入E-cad、N-cad一抗（以1∶1 000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，將PVDF膜浸入二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，洗滌后滴加ECL反應(yīng)液，凝膠呈像系統(tǒng)中曝光采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)細(xì)胞中E-cad、N-cad蛋白表達(dá)水平。

1.2.5Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Panc-1細(xì)胞15 h，PBS洗3次，胰蛋白酶消化細(xì)胞后用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)照組用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×105個(gè)/mL，接種于Transwell小室上室。胰蛋白酶組用含100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×105個(gè)/mL接種于Transwell小室上室。對(duì)照組和胰蛋白酶組下室均加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛室溫固定膜15 min，0.1%的結(jié)晶紫避光染色15 min，隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，ImageJ 軟件計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用細(xì)胞數(shù)代表Panc-1細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)將Matrigel膠、無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按1∶5稀釋，每孔50 μL均勻鋪于Transwell小室上室底部，重建基底膜，37℃培養(yǎng)箱靜置4 ～ 6 h，后續(xù)操作同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PRSS2表達(dá)與胰腺癌患者總生存期呈負(fù)相關(guān)

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PRSS2表達(dá)情況與178例胰腺癌患者生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示高表達(dá)PRSS2的胰腺癌患者總生存期顯著低于PRSS2低表達(dá)患者，Logrank P = 0.018，P（HR） = 0.046（圖1A）； PRSS2高表達(dá)的胰腺癌患者無(wú)病生存期與PRSS2低表達(dá)患者無(wú)顯著差異，Logrank P = 0.056，P（HR） = 0.074（圖1B）。

圖1 PRSS2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Figure 1．Relation of PRSS2 Expression to the Prognosis of Patients

2.2 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶使Panc-1細(xì)胞遷移能力加強(qiáng)

通過(guò)傷口愈合實(shí)驗(yàn)初步分析不同濃度PRSS2重組胰蛋白酶對(duì)Panc-1細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果（圖2）顯示PRSS2重組胰蛋白酶濃度≥300 ng/mL 作用24 h后，貼壁生長(zhǎng)的Panc-1細(xì)胞部分脫落；100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用24 h后，細(xì)胞遷移距離明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；濃 度 在50 ng/mL以 下 的PRSS2重 組胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

圖2 不同濃度PRSS2重組胰蛋白酶對(duì)Panc-1細(xì)胞遷移能力的影響Figure 2．Effects of Trypsin at Different Concentrations on Panc-1 Cell Migration

2.3 PRSS2重組胰蛋白酶誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞發(fā)生EMT

如圖3所示，對(duì)照組Panc-1細(xì)胞呈多邊形，在100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用24 h后，多數(shù)細(xì)胞變?yōu)榍昂髽O性的梭形，而胰蛋白酶抑制劑組細(xì)胞形態(tài)仍為多邊形。

圖3 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對(duì)Panc-1細(xì)胞形態(tài)的影響（×400）Figure 3. Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Morphology of Panc-1 Cells (×400)

100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用Panc-1細(xì)胞24 h后，對(duì)照組、胰蛋白酶組及胰蛋白酶抑制劑組的E-cad相對(duì)表達(dá)量分別為1.08±0.01、0.587±0.029、1.333±0.047，胰 蛋 白 酶 組 明 顯低 于 對(duì) 照 組（t = 27.969，P ＜ 0.001），胰 蛋 白 酶 抑制 劑 組 高 于 胰 蛋 白 酶 組（t = 23.354，P ＜ 0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N-cad相對(duì)表達(dá)量分別 為0.742±0.018、1.843±0.055、0.913±0.031，胰蛋白酶組明顯高于對(duì)照組（t = 33.163，P ＜ 0.001），胰蛋白酶抑制劑組低于胰蛋白酶組（t = -25.598，P ＜ 0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對(duì)Panc-1細(xì)胞E-cad及N-cad蛋白表達(dá)的影響Figure 4．Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Expressions of E-cad and N-cad Proteins

2.4 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶增強(qiáng)Panc-1細(xì)胞遷移能力

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用Panc-1細(xì)胞24 h后，對(duì)照組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)為（107.2±11.009）個(gè)，胰蛋白酶組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)為（806.6±20.924）個(gè)，胰蛋白酶組遷移細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 21.774 ，P ＜ 0.001，圖5）。

圖5 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對(duì)Panc-1細(xì)胞遷移能力的影響Figure 5. Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Migration Ability of Panc-1 Cells

2.5 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶增強(qiáng)Panc-1細(xì)胞侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用Panc-1細(xì)胞24 h后，對(duì)照組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)為（103.2±10.709）個(gè)，胰蛋白酶組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)為（484.8±11.734）個(gè)，細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 21.547，P ＜ 0.001，圖6）。

圖6 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對(duì)Panc-1細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 6. Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Invasion Ability of Panc-1 Cells

3 討 論

胰腺癌是一種惡性程度極高的惡性腫瘤，90%的患者診斷時(shí)腫瘤已擴(kuò)散至胰腺以外器官，其中發(fā)生全身轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者 ＞ 50%［14］。找到誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的因素對(duì)于腫瘤的早期干預(yù)至關(guān)重要。胰腺癌常處于胰腺炎腫瘤微環(huán)境中，流行病學(xué)證實(shí)胰腺炎與胰腺癌關(guān)系密切。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)769例胰腺癌患者中就有536例有急性胰腺炎病史［15］。胰腺導(dǎo)管細(xì)胞腺癌伴急慢性胰腺炎患者與不伴胰腺炎患者比較，胰腺癌復(fù)發(fā)較早，且急性胰腺炎的嚴(yán)重程度與胰腺癌患者的無(wú)病生存期密切相關(guān)［16］。然而胰腺炎腫瘤微環(huán)境中什么物質(zhì)促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。

PRSS2表達(dá)上調(diào)是胰腺炎的發(fā)生標(biāo)志，Narasimhan等［7］發(fā)現(xiàn)PRSS2在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移及惡病質(zhì)的患者體內(nèi)均上調(diào)。本課題組利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PRSS2基因與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)所收集的病例中，將患者PRSS2表達(dá)量4%作為判斷閾值，高于4%為高表達(dá)，低于4%為低表達(dá)，隨著患病時(shí)間的延長(zhǎng)，PRSS2高表達(dá)患者總生存期顯著低于PRSS2低表達(dá)患者，PRSS2基因與胰腺癌患者預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)。本課題組認(rèn)為PRSS2基因可能是導(dǎo)致處于胰腺炎腫瘤微環(huán)境中的胰腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，然而該基因與胰腺癌的關(guān)系目前未見國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道。EMT是一個(gè)轉(zhuǎn)錄及表觀遺傳程序，上皮樣細(xì)胞通過(guò)該程序獲得間充質(zhì)樣細(xì)胞特性，從而打開細(xì)胞連接，獲得更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)侵襲能力，離開癌癥原發(fā)灶，進(jìn)而形成新的腫瘤團(tuán)塊［17］。E-cad蛋白表達(dá)缺失被證實(shí)與胰腺癌疾病進(jìn)展密切相關(guān)。有研究在106例胰腺導(dǎo)管腺癌組織中發(fā)現(xiàn)E-cad的表達(dá)部分缺失率為53.8%（57/106），完全缺失率為11.3%（12/106），正常組織中的缺失率為0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）， E-cad表達(dá)完全缺失、部分缺失和完全表達(dá)的患者的中位總生存期分別為7個(gè)月、19個(gè)月和25個(gè)月，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)E-cad表達(dá)的缺失與腫瘤的分化程度及早期轉(zhuǎn)移相關(guān)［18］。本課題組通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用于胰腺癌細(xì)胞24 h后，多數(shù)細(xì)胞由多邊形變?yōu)榍昂髽O性的梭形；E-cad蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（t = 27.969，P ＜ 0.001），間充質(zhì)樣標(biāo)志物N-cad蛋白的表達(dá)上調(diào)（t = 33.163，P ＜ 0.001）；細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng)（t = 21.774 ， P ＜ 0.001；t = 21.547，P ＜ 0.001）。綜合以上結(jié)果，本課題組認(rèn)為源于PRSS2的重組胰蛋白酶濃度達(dá)100 ng/mL時(shí)能誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞發(fā)生EMT且促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲。本課題組進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶中加入胰蛋白酶抑制劑后，細(xì)胞形態(tài)維持多邊形，E-cad表達(dá)明顯高于胰蛋白酶組（t = 23.354，P ＜ 0.001），N-cad表達(dá)明顯低于胰蛋白酶組（t = -25.598，P ＜ 0.001），提示胰蛋白酶抑制劑能逆轉(zhuǎn)PRSS2重組胰蛋白酶的EMT誘導(dǎo)現(xiàn)象，表明PRSS2基因所產(chǎn)生的胰蛋白酶是導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素。然而，目前文獻(xiàn)中PRSS2基因與胰腺癌的關(guān)系僅限于揭示胰腺癌患者血清及組織中PRSS2基因表達(dá)增 加［19］，沒有更進(jìn)一步的研究揭示PRSS2基因與胰腺癌的直接關(guān)系，本研究為處于胰腺炎微環(huán)境中的胰腺癌患者的早期干預(yù)提供了一定的理論依據(jù)。

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