趙琳娜 ，成映霞 ，白敏 ，劉夢雅 ，李潤法 ，高晗 ，安耀榮 段永強

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省實驗動物行業(yè)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004； 4.石家莊傅山腫瘤醫(yī)院，河北 石家莊 050000

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床常見的功能性胃腸道疾病之一，全球總患病率約為16%[1]，我國患病率可達20%[2]，對患者生理、心理及社會產(chǎn)生嚴重影響[3]。FD臨床主要表現(xiàn)為上腹部飽脹感、早飽感、上腹痛、上腹部燒灼感等，且無明顯器質(zhì)性病變。FD病理機制復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學多認為與十二指腸低度炎癥、胃腸動力障礙等因素有關(guān)，常用促胃腸動力、抑酸劑等藥物進行治療，但復(fù)發(fā)率較高[4]。

FD屬中醫(yī)學“痞滿”范疇，其病因病機復(fù)雜，主要與脾胃虛弱、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞倦過度、先天稟賦不足等相關(guān)，其中脾胃虛弱為其主要病機。《證治匯補》有“大抵心下痞悶，必是脾胃受虧，濁氣挾痰，不能運化為患”，指出脾胃虛弱是導(dǎo)致機體運化失常、痰濕內(nèi)生、心下痞滿不舒的主要因素。香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、砂仁、木香組成，全方以健脾補氣的四君子湯加理氣化痰藥物陳皮、半夏、砂仁、木香組成，促進脾胃運化，為健脾和胃經(jīng)典方劑，治療脾胃虛弱型FD臨床效果顯著[2，5]，但其具體作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，從分子水平闡釋藥物與疾病的作用靶點與機制，能夠準確預(yù)測分析中藥復(fù)方的作用機制[6]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探究香砂六君子湯干預(yù)FD的作用靶點及機制，并通過動物實驗對核心靶點進行驗證。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測分析

1.1.1 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）對香砂六君子湯組方藥物人參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、木香、砂仁的化學成分進行查詢。以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件[7]，篩選出藥物有效成分及相應(yīng)靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲取靶點蛋白的基因名稱。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://auth.lifemapsc.com），以“functional dyspepsia”為檢索詞，檢索FD的基因靶點。將藥物靶點與FD基因靶點取交集，篩選出藥物與疾病的共同靶點，并通過Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.1.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org），類型選擇“homo sapiens”（人類）并設(shè)置最小關(guān)系值≥0.95，刪除無連接節(jié)點，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。運用Cytoscape3.7.1軟件進行拓撲分析，找出Betweenness、Closeness、Degree、Information、LAC、Network值均大于其平均值的靶點，并根據(jù)Degree值大小篩選出核心靶點。

1.1.3 GO及KEGG通路富集分析

將藥物與疾病共同靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index），物種設(shè)置為“Homo sapiens”，進行GO及KEGG通路富集分析。

1.2 實驗驗證

1.2.1 藥物

參考《方劑學》[8]，香砂六君子湯由人參（生曬參）10 g、麩炒白術(shù)9 g、茯苓9 g、陳皮9 g、法半夏12 g、砂仁6 g、木香6 g、炙甘草6 g組成。飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學楊扶德教授鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。飲片常規(guī)浸泡2 h，煎煮2次，每次40 min，所得藥液濃縮至每毫升含原藥材1 g，冷卻后置4 ℃冰箱保存。色甘酸鈉（美國APRxBIO公司，批號B330021337769），用蒸餾水配制成7.2 mg/mL溶液。

1.2.2 動物

SPF級SD孕鼠15只，通過觀察幼鼠行為活動及性別，篩選出60只健康幼年雄鼠用于實驗，甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗中心提供，動物許可證號SYXK（甘）2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，每12 h進行一次標準嚙齒動物食物、水和明暗循環(huán)，相對濕度45%～55%，室溫（23±2）℃。本實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審查批準（2021-204）。

1.2.3 主要試劑與儀器

大鼠白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒，江蘇菲亞生物科技有限公司，批號分別為2203R18、2203R30、2203R16；內(nèi)參GAPDH、二抗IgG，北京ImmunoWay公司，批號分別為YM3215、RS002；p-ERK一抗，美國GeneTex公司，批號GTX24819；p-P38MAPK一抗，武漢塞維爾生物科技有限公司，批號AC220406032；p-NF-κBp65一抗，上海ABmart公司，批號TP56372M；RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，北京索萊寶科技有限公司，批號分別為R0010、P1200。

5910R型冷凍型高速離心機，德國Eppendorf公司；美谷SpectraMax i3X酶標儀、VE-180型垂直板電泳裝置，美國BIO-RAD公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物有限公司；GeLView 6000puls凝膠成像系統(tǒng)，廣東博鷺騰生物科技有限公司。

1.2.4 造模、分組、給藥及取材

將60只SPF級SD大鼠隨機抽出10只為空白組，10日齡起灌胃2%蔗糖溶液0.2 mL，每日1次，連續(xù)1周，正常飼養(yǎng)至6周齡。其余大鼠采用綜合法建立脾胃虛弱型FD大鼠模型[9]：10日齡起灌胃含有0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液0.2 mL，每日1次，連續(xù)6 d。將大鼠正常飼養(yǎng)到6周齡后，造模大鼠每日游泳至力竭，連續(xù)2周，同時隔日禁食。以體質(zhì)量、進食量下降及胃排空時間長、推進率下降為造模成功標準。

將成模大鼠隨機分為模型組、色甘酸鈉組及香砂六君子湯高、中、低劑量組（高、中、低劑量組），每組10只。按人與動物體型系數(shù)折算[10]，色甘酸鈉組大鼠予72 mg/（kg·d）色甘酸鈉溶液灌胃，高、中、低劑量組大鼠分別予12、6、3 g/（kg·d）香砂六君子湯藥液灌胃，給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)2周?？瞻捉M與模型組予等體積生理鹽水灌胃。飼養(yǎng)過程中記錄大鼠體質(zhì)量及3 h進食量變化。給藥結(jié)束后，禁食24 h，測算大鼠胃排空率及腸推進率，剪取胃、十二指腸組織，生理鹽水沖洗，一部分以多聚甲醛固定，另一部分于-80 ℃凍存。

1.2.5 胃排空率及腸推進率測定

大鼠禁食24 h后灌服含炭粉的半固體營養(yǎng)糊2 mL，30 min后以3%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔注射麻醉，取出全胃，稱重，沿胃大彎剪開，生理鹽水充分沖洗清潔后稱量胃凈重，計算胃排空率。胃排空率（%）=[1-（胃總重-胃凈重）÷所給糊重]×100%。以幽門為起點測量黑色糊狀物推進距離（L）及小腸全長（S），計算腸推進率。腸推進率（%）=L÷S×100%。

1.2.6 胃腸組織HE染色

取多聚甲醛固定的胃、十二指腸組織，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色，鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.7 ELISA檢測十二指腸炎癥因子含量

將十二指腸組織制備為10%組織勻漿，按ELISA試劑盒說明書操作，計算各組大鼠十二指腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β含量。

1.2.8 蛋白印跡法檢測十二指腸關(guān)鍵通路蛋白表達水平

取大鼠十二指腸組織，提取蛋白，蛋白定量后上樣，電泳轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗p-ERK（1∶1 000）、p-P38MAPK（1∶500）、p-NF-κBp65（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，再加入二抗，室溫搖勻2 h，暗室曝光，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白相對表達量。

1.2.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索并篩選后得到香砂六君子湯有效成分159個，對應(yīng)2 472個靶點，去重后得到230個靶點；FD疾病靶點1 857個。將藥物靶點與疾病靶點取交集后得到共同靶點151個。藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)見圖1。

圖1 香砂六君子湯治療FD藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將藥物與疾病共同靶點基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫生成PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖2），并通過Cytoscape3.7.1軟件進行拓撲分析。其中Degree值較高的基因有MAPK1、MAPK14、JUN、IL-6等，見圖3。

圖2 香砂六君子湯治療FD靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 香砂六君子湯治療FD靶點PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點

2.3 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

對151個共同靶點進行GO富集分析，得到2 198個條目，其中生物過程（BP）1 689條，細胞組成（CC）97條，分子功能（MF）145條，各前10個條目見圖4。KEGG通路富集分析得到203條相關(guān)通路，前30條通路見圖5。BP主要富集在對UV-A的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、細胞對鎘離子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、細胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、對細菌源性分子的反應(yīng)等；CC主要富集在蛋白酶抑制劑復(fù)合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑復(fù)合物、肽酶抑制劑復(fù)合物等；MF主要富集在氧化還原酶活性、離子通道調(diào)節(jié)活性、裂解酶活性、外源性蛋白結(jié)合DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制活性等。KEGG通路主要富集在癌癥相關(guān)通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。

圖4 香砂六君子湯治療FD靶點GO富集分析

圖5 香砂六君子湯治療FD靶點KEGG富集分析

2.4 香砂六君子湯對模型大鼠體質(zhì)量、進食量的影響

與空白比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，進食量明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，高、中劑量組及色甘酸鈉組大鼠體質(zhì)量和進食量均有所上升（P<0.05，P<0.01）。見圖6、圖7。

圖6 各組大鼠不同時點體質(zhì)量比較（±s，每組10只）

圖7 各組大鼠3 h進食量比較（±s，每組10只）

2.5 香砂六君子湯對模型大鼠胃排空率及腸推進率的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃排空率及腸推進率顯著下降（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃排空率顯著升高（P<0.05，P<0.01），除低劑量組外，各給藥組大鼠腸推進率顯著升高（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠胃排空率及腸推進率比較（±s，%）

表1 各組大鼠胃排空率及腸推進率比較（±s，%）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組模型組色甘酸鈉組高劑量組中劑量組低劑量組只數(shù)10 10 10 10 10 10胃排空率56.75±5.05 29.50±5.02**43.20±5.54##47.30±9.00##46.40±6.83##36.60±4.32#腸推進率86.66±12.56 35.38±11.53**66.07±17.41##75.09±10.10##60.29±13.26##45.64±10.98

2.6 香砂六君子湯對模型大鼠胃、腸組織病理形態(tài)的影響

空白組及模型組大鼠胃黏膜完整，黏膜上皮細胞及腺體排列規(guī)整，黏膜固有層未見炎細胞，黏膜無水腫、充血病理改變?？瞻捉M大鼠十二指腸黏膜完整，絨毛排列緊密，黏膜層無炎性浸潤；模型組大鼠十二指腸絨毛排列散亂，部分出現(xiàn)倒伏、脫落現(xiàn)象，且黏膜層出現(xiàn)腫脹，有炎性細胞浸潤；與模型組比較，各給藥組大鼠十二指腸絨毛排列緊密，倒伏、脫落現(xiàn)象減少，黏膜層炎性細胞浸潤出現(xiàn)不同程度改善，色甘酸鈉組及高劑量組最為明顯。見圖8、圖9。

圖8 各組大鼠胃黏膜病理形態(tài)（HE染色）

圖9 各組大鼠十二指腸黏膜病理形態(tài)（HE染色）

2.7 香砂六君子湯對模型大鼠十二指腸組織炎癥因子含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠十二指腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠十二指腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β含量不同程度降低，色甘酸鈉組及高劑量組最為明顯（P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠十二指腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β含量比較（±s）

表2 各組大鼠十二指腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組模型組色甘酸鈉組高劑量組中劑量組低劑量組只數(shù)10 10 10 10 10 10 IL-6/（pg/mL）17.90±2.17 66.15±9.47**34.66±2.41##25.12±1.55##42.91±0.89#53.75±8.18 TNF-α/（ng/mL）135.68±29.47 343.13±37.00**217.50±11.65##174.95±21.13##239.59±27.82##270.94±13.00 IL-1β/（pg/mL）7.47±1.49 22.73±2.14**11.00±1.32##8.77±1.65##16.20±1.99##18.95±1.95

2.8 香砂六君子湯對模型大鼠十二指腸關(guān)鍵通路蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠十二指腸組織p-ERK、p-P38MAPK、p-NF-κBp65蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠十二指腸組織p-ERK、p-P38MAPK、p-NF-κBp65蛋白表達水平不同程度降低，色甘酸鈉組及高劑量組最為顯著（P<0.05，P<0.01）。見圖10、表3。

圖10 各組大鼠十二指腸組織p-ERK、p-P38MAPK、p-NF-κBp65蛋白表達免疫印跡

表3 各組大鼠十二指腸組織p-ERK、p-P38MAPK、p-NF-κBp65蛋白表達比較（±s，/GAPDH）

表3 各組大鼠十二指腸組織p-ERK、p-P38MAPK、p-NF-κBp65蛋白表達比較（±s，/GAPDH）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組模型組色甘酸鈉組高劑量組中劑量組低劑量組只數(shù)10 10 10 10 10 10 p-ERK 0.74±0.06 1.08±0.09**0.89±0.07#0.91±0.06#0.96±0.08 0.94±0.08 p-P38MAPK 0.21±0.04 0.44±0.08**0.25±0.05##0.28±0.06##0.33±0.08#0.30±0.07#p-NF-κBp65 0.33±0.01 0.87±0.00**0.34±0.01##0.36±0.01##0.54±0.04 0.57±0.04

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測表明，香砂六君子湯治療FD相關(guān)靶點共151個，PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示關(guān)鍵靶點為MAPK1、MAPK14、JUN、IL-6等。KEGG通路富集分析得到203條相關(guān)通路，主要富集在癌癥相關(guān)通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化相關(guān)通路、AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等，其中MAPK1、MAPK14、IL-6等 靶 點 及AGE-RAGE、MAPK、TNF、IL-17等通路均與炎癥密切相關(guān)。動物實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)D模型大鼠胃組織無明顯炎性浸潤，而十二指腸組織炎性浸潤明顯，表明十二指腸低度炎癥是FD的重要因素。研究表明，十二指腸低度炎癥為FD的始動因素，可以影響十二指腸-胃反饋，從而導(dǎo)致早飽感、腹脹等癥狀的出現(xiàn)[11]。

十二指腸黏膜內(nèi)低度炎癥主要表現(xiàn)為T細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)量增加[12]，其中肥大細胞是重要的免疫細胞之一，廣泛分布于機體各個部位，與多種慢性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病有關(guān)[13]。在十二指腸黏膜中，肥大細胞釋放的介質(zhì)可以影響上皮的完整性，刺激先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[14-15]，產(chǎn)生局部甚至全身炎癥，進而促進胃腸道FD臨床癥狀的產(chǎn)生。因此，本實驗使用肥大細胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉作為阻斷劑抑制肥大細胞脫顆粒。

動物實驗結(jié)果顯示，香砂六君子湯可以改善FD大鼠十二指腸絨毛散亂及炎性浸潤，下調(diào)十二指腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β含量及p-ERK、p-NF-κBp65、p-P38MAPK表達水平，提示香砂六君子湯能減輕十二指腸低度炎癥，其機制可能與下調(diào)p-ERK、p-P38MAPK及下游p-NF-κBp65水平有關(guān)。IL-6、TNF-α、IL-1β為促炎細胞因子，由單核細胞、肥大細胞及巨噬細胞分泌，可以參與細胞免疫且與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，IL-6可介導(dǎo)NF-κB、MAPK等多種炎性通路，引起自身免疫疾病[16]。TNF-α、IL-1β屬于早期反應(yīng)細胞因子，在細胞受到刺激后立即分泌從而破壞促炎-抗炎平衡，進一步刺激IL-6、IL-2等炎性因子活化，從而形成炎性反應(yīng)[17]。TNF-α、IL-1β可通過調(diào)節(jié)胃酸分泌從而調(diào)節(jié)FD[18-20]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化及炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程，其與炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)關(guān)系密切。MAPK主要亞族由ERK、P38、JUK組成。其中MAPK1屬于ERK亞族，MAPK14屬于P38亞族。P38可以調(diào)節(jié)多種細胞因子、炎性介質(zhì)的表達，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮主要作用。研究顯示，在多數(shù)炎癥性腸病中，P38及其磷酸化表達均有所升高，且抑制P38過度激活可改善腸道炎癥及上皮黏膜功能[21-22]。ERK同樣為免疫調(diào)節(jié)中的重要因子，Monick等[23]研究表明，抑制ERK活性可以負調(diào)節(jié)吞噬細胞，從而調(diào)節(jié)機體免疫。MAPK可激活下游NF-κB。NF-κB是一種誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)激活多種免疫調(diào)節(jié)蛋白、炎性細胞因子，從而導(dǎo)致炎癥[24-25]。有研究表明，調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄可以調(diào)控FD大鼠十二指腸低度炎癥的發(fā)生[26-27]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法從分子水平預(yù)測分析香砂六君子湯干預(yù)FD的作用機制，發(fā)現(xiàn)其多與免疫相關(guān)。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D大鼠胃組織無明顯炎性浸潤而十二指腸炎性浸潤明顯，提示香砂六君子湯干預(yù)FD的作用機制與十二指腸低度炎癥密切相關(guān)。核心靶點驗證結(jié)果表明，香砂六君子湯可能通過下調(diào)p-ERK、p-P38MAPK及下游p-NF-κBp65的水平調(diào)控十二指腸低度炎癥，改善FD癥狀。