王德麗，滕 穎，李 翠，李旭妮，肖 璐，李偉杰，王 芳，曲鴻飛

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever，ASFV)引起的豬的一種急性、高度接觸性傳染病[1]，以高熱、皮膚發(fā)紺等為主要特征，死亡率高達100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科，為雙鏈DNA病毒，病毒基因組約170～193 kb[2]，包含150～167個開放閱讀框，編碼100多個蛋白[3]。

目前ASFV已在我國定殖并形成較大污染面，應(yīng)毫不放松抓好非洲豬瘟常態(tài)化防控。利用診斷制品開展非洲豬瘟感染檢測與早期診斷是目前預防和控制本病的重要手段。2019年以來，申請非洲豬瘟類診斷制品注冊申報數(shù)量一直居高不下，但因注冊申報資料存在各種問題，不符合注冊要求比例較高。鑒于此，對我國非洲豬瘟診斷制品注冊申報情況、評審評價政策以及不符合注冊要求的原因進行了分析，并提出了相關(guān)建議，供非洲豬瘟診斷制品研發(fā)、注冊人員參考。

1 注冊申報情況

截至2021年底，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥評審中心共收到非洲豬瘟診斷制品注冊申請226份，共計89個產(chǎn)品(存在同一個產(chǎn)品因不符合注冊要求而重復提交注冊申請的情況，以下均按產(chǎn)品統(tǒng)計)，其中不符合注冊要求產(chǎn)品52個，處于注冊過程中的產(chǎn)品27個，批準發(fā)公告的產(chǎn)品10個。

1.1 已批準產(chǎn)品情況 截至2021年底，批準發(fā)公告10個產(chǎn)品，包括8個核酸檢測試劑盒、1個抗原熒光微球檢測試紙條和1個抗體檢測試劑盒，詳見表1。

表1 已批準非洲豬瘟診斷制品Tab 1 Licensed ASF diagnostic test kits

1.2 產(chǎn)品類型分析 申報的89個產(chǎn)品中，包括核酸檢測試劑盒、抗原檢測試劑盒和抗體檢測試劑盒三大類。核酸檢測試劑盒共52個產(chǎn)品，占非洲豬瘟診斷制品總數(shù)的58%。其中熒光PCR試劑盒數(shù)量最多，為38個；其次為等溫擴增試劑盒，為13個；普通PCR試劑盒僅1個?？乖瓩z測試劑盒共10個產(chǎn)品，占非洲豬瘟診斷制品總數(shù)的11%。其中大多數(shù)為免疫層析試紙條，包括5個膠體金試紙條、1個乳膠微球試紙條和1個熒光微球試紙條；其余為3個ELISA抗原檢測試劑盒。抗體檢測試劑盒共27個，占非洲豬瘟診斷制品總數(shù)的30%。其中，ELISA抗體檢測試劑盒為20個；免疫層析抗體檢測試紙條為7個(膠體金試紙條6個，乳膠微球試紙條1個)。

1.3 檢測靶標分析 根據(jù)注冊申報資料統(tǒng)計，核酸檢測的主要靶標基因為P72、CD2v和MGF；抗原檢測的主要檢測靶標為P72蛋白和P30蛋白；抗體檢測主要靶標為P72蛋白、P30蛋白、P54蛋白及CD2v蛋白等的抗體。

2 技術(shù)評審的主要政策要求

2.1 注冊資料要求 為推進獸醫(yī)診斷制品的評審改革，近幾年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局會同農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥評審中心積極修訂獸醫(yī)診斷制品的注冊資料要求，保證敏感特異的評審標準不降低的前提下，逐步減少注冊資料的項目要求。2020年9月29日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布新的《獸醫(yī)診斷制品注冊分類及注冊資料要求》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第342號)[4]。因此根據(jù)非洲豬瘟診斷制品提交注冊申請時間的不同，按照不同的注冊資料要求進行評審。2020年10月15日前已申請的，按照農(nóng)業(yè)部公告第2335號執(zhí)行[5]；2020年10月15日后申請的，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第342號執(zhí)行。

2.2 評審工作機制 2021年1月21日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布新的《獸藥注冊評審工作程序》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第392號)，實施評審中心專家主審與獸藥注冊評審專家?guī)炱渌麑＜易稍兿嘟Y(jié)合的獸藥注冊評審工作機制[6]。該文件明確要求，原則上對每個獸藥注冊申請的評審，初次評審和復評審均不超過一次。這意味著，凡是需要再次提交初審會討論的產(chǎn)品，尤其是涉及修改質(zhì)量標準核心檢驗項目，均予以退審。這也是目前獸藥注冊退審率高的一個重要原因。

2.3 評審工作方式 2019年，為應(yīng)對非洲豬瘟疫情，滿足防控需求，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局在農(nóng)牧便函〔2019〕276號明確提出對ASFV檢測試劑盒予以優(yōu)先評審；初審對試劑盒質(zhì)量標準無修改意見的，可在補充其他材料的同時開展質(zhì)量復核檢驗工作。目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已批準的非洲豬瘟診斷制品可以滿足市場非洲豬瘟診斷檢測需求，且非洲豬瘟診斷制品申報數(shù)量大。從2022年9月19日起非洲豬瘟診斷制品不再實行優(yōu)先評審。

2.4 簡化評審要求

2.4.1 按2335號公告評審的產(chǎn)品 農(nóng)牧便函〔2019〕411號(以下簡稱“便函”)中對非洲豬瘟診斷類制品的注冊資料要求進行了相應(yīng)簡化。一是按照2335號公告要求，凡與我國已批準上市銷售、檢測方法和檢測標的物相同的同類診斷制品相比，無根本改進的診斷產(chǎn)品不作為新獸藥審批[5]；但鑒于當時非洲豬瘟檢測試劑需求量大，便函中規(guī)定對不符合新獸藥定義但經(jīng)評審和檢驗認為產(chǎn)品質(zhì)量符合要求的，不再核發(fā)新獸藥注冊證書，對具備生產(chǎn)條件的相關(guān)企業(yè)核發(fā)產(chǎn)品批準文號。二是按照2335號公告評審的制品，按照“老人老辦法、新人新辦法”要求補充比對試驗報告。2019年2月27日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第138號公布了國家非洲豬瘟參考實驗室、專業(yè)實驗室和區(qū)域?qū)嶒炇襕7]。對138號公告發(fā)布前已申請注冊的制品，不再要求補充比對試驗報告；138號公告發(fā)布后申請注冊的產(chǎn)品，可在注冊評審復審前提供比對報告；而且非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇页鼍叩谋葘υ囼瀳蟾嬉灿枰哉J可。三是，臨床試驗研究中陽性樣品數(shù)量不做硬性要求。

2.4.2 按342號公告評審的產(chǎn)品 僅申請注冊為創(chuàng)新型獸醫(yī)診斷制品的，需要提供3家獸醫(yī)實驗室的評價試驗報告；申請注冊為改良型獸醫(yī)診斷制品的，不需要提供評價試驗報告。而且臨床試驗研究中陽性樣品數(shù)量仍不做硬性要求。

3 常見不符合注冊要求原因分析

89個產(chǎn)品中，不符合注冊要求比例高達58%?，F(xiàn)根據(jù)試劑盒檢測原理將原因分類匯總?cè)缦隆?/p>

3.1 共性問題 一是申報資料不全，缺少必要的研究數(shù)據(jù)。如研究報告中檢測的樣本來源與背景不清等。二是申報資料前后邏輯錯誤，難以評價申報資料和試驗數(shù)據(jù)的真實性。如多個研究報告的試驗時間前后矛盾等。三是制品成品檢驗標準規(guī)定難以控制產(chǎn)品質(zhì)量。如敏感性檢驗標準中不同稀釋度質(zhì)控品缺少對應(yīng)檢測值范圍規(guī)定。四是質(zhì)控品問題。如敏感性質(zhì)控血清未采用經(jīng)典方法(如IFA等)進行檢驗和標定。

3.2 分子生物學試劑盒存在的其他問題 引物、探針選擇依據(jù)方面，缺少對引物及探針適用性分析報告。針對多重PCR試劑盒，缺少雙重熒光與單熒光敏感性比較研究報告。針對有凍干組分的試劑盒，缺少凍干工藝系統(tǒng)研究報告。

3.3 免疫學試劑盒存在的其他問題 包被抗原的選擇依據(jù)方面，缺少采用混合蛋白與單個蛋白分別作為包被抗原進行敏感性比對的研究報告。表達蛋白鑒定方面，表達蛋白的western-blot分析缺少用非洲豬瘟病毒陽性血清進行測定的試驗數(shù)據(jù)。生產(chǎn)工藝方面，缺少抗原包被工藝和酶結(jié)合物制備、標準等系統(tǒng)性研究數(shù)據(jù)等。質(zhì)量研究報告方面，ELISA抗體檢測方法建立研究報告中未采用已知非洲豬瘟病毒陽性血清進行相關(guān)研究。

4 建 議

4.1 一般建議 一是關(guān)于ASFV陽性樣品。如用到ASFV陽性樣品，應(yīng)說明是否為滅活樣品。如未滅活，應(yīng)說明是否符合生物安全相關(guān)要求。購自中監(jiān)所、非洲豬瘟參考/專業(yè)/區(qū)域?qū)嶒炇乙约败娛驴茖W院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所的樣品予以認可，可不提供制備研究報告，但需提供標準及購買證明。如為饋贈，也需提供標準及饋贈單位證明。二是質(zhì)量標準敏感性檢驗標準應(yīng)明確檢測范圍。敏感性質(zhì)控品含量如為定值，敏感性檢驗暫不要求必須檢到陰性；敏感性質(zhì)控品含量如非定值，敏感性檢驗應(yīng)檢到陰性。三是作用與用途中涉及的樣品類型均需有研究數(shù)據(jù)支持。四是申報資料應(yīng)提供具體試驗數(shù)據(jù)，包括電泳圖、ELISA檢測OD值等。五是敏感性質(zhì)控品和特異性質(zhì)控品應(yīng)采用本試劑盒之外的方法檢驗。六是敏感性研究報告中應(yīng)包括臨床陽性樣品的研究數(shù)據(jù)。七是特異性研究報告中應(yīng)包括臨床樣品的研究數(shù)據(jù)。八是保存期研究報告應(yīng)提供制品達到規(guī)定保存期并延長3個月的研究數(shù)據(jù)。九是臨床試驗研究報告所用臨床樣品中應(yīng)包括陰性樣品、陽性樣品；針對非洲豬瘟診斷制品，暫不要求陽性樣品比例達到10%。

4.2 分子生物學檢測試劑盒建議 一般情況下，可以使用質(zhì)粒作為質(zhì)控品。多重熒光PCR檢測試劑盒應(yīng)提供多重熒光與單熒光檢測敏感性比較研究報告。如有凍干組分，應(yīng)提供凍干工藝研究報告。

4.3 免疫學檢測試劑盒建議 一是抗體檢測類的制品，一般應(yīng)使用全病毒陽性血清作為質(zhì)控品。二是重組抗原應(yīng)采用非洲豬瘟病毒陽性血清進行特異性鑒定。三是抗體檢測試劑盒特異性質(zhì)控品除陰性樣品外，一般應(yīng)包括出現(xiàn)交叉/干擾反應(yīng)的其它血清及生產(chǎn)包被抗原時所用細胞、表達載體、標簽蛋白等的陽性血清。四是應(yīng)提供單抗特異性鑒定、酶標抗體活性、酶標抗原質(zhì)量控制等研究資料。五是抗體檢測試劑盒ELISA方法建立研究報告中應(yīng)采用已知非洲豬瘟病毒陽性血清進行相關(guān)研究，臨界值確定所用血清應(yīng)采用經(jīng)典方法進行確認。