盧鵬懷， 曹眾達(dá)， 孫耀貴， 孫盼盼， 孫 娜， 李宏全， 程 佳

(中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 山西太谷 030801)

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖與消費(fèi)大國(guó)， 雞蛋產(chǎn)量位居世界首位， 但我國(guó)“小規(guī)模、大群體”的產(chǎn)業(yè)特征依然存在， 萬(wàn)只以下的中小規(guī)模養(yǎng)殖仍然是蛋雞養(yǎng)殖的主體。由于生產(chǎn)設(shè)施簡(jiǎn)陋、飼養(yǎng)管理不到位、從業(yè)人員專(zhuān)業(yè)知識(shí)匱乏、疾病、應(yīng)激等因素的影響， 導(dǎo)致蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中疾病頻發(fā)、高峰產(chǎn)蛋率降低、蛋品質(zhì)下降。在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中， 經(jīng)營(yíng)者為了追求蛋雞的生產(chǎn)性能和抗疾病能力， 往往會(huì)在飼料中添加抗生素。長(zhǎng)期不規(guī)范使用抗生素， 不僅會(huì)引起蛋雞免疫能力下降、腸道菌群平衡破壞等一系列問(wèn)題， 同時(shí)還會(huì)危害到人類(lèi)的健康。中草藥富含多種生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分， 具有純天然、耐藥性弱、有害殘留少、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)， 在替代抗生素方面有著巨大的潛力。2020版《中國(guó)獸藥典》二部中收錄的具有改善蛋雞產(chǎn)蛋性能、提升蛋品質(zhì)的中獸藥僅有降脂增蛋散、蛋雞寶、激蛋散三種[1]。且三種中獸藥均為傳統(tǒng)散劑， 存在組方藥味多、制劑工藝粗糙、質(zhì)量難以控制、藥物利用率低、療效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。蛋雞養(yǎng)殖行業(yè)迫切需要能夠安全、有效延長(zhǎng)蛋雞產(chǎn)蛋周期， 提升蛋品質(zhì)的新型中獸藥。

淫羊藿和制何首烏為傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥。淫羊藿為助陽(yáng)藥， 性溫， 味辛、甘， 歸肝經(jīng)、腎經(jīng)， 具有溫腎助陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨、益精補(bǔ)氣的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明其主要有促進(jìn)性腺功能、防治骨質(zhì)疏松、促進(jìn)造血功能、抗腫瘤、抗炎等作用[2-3]。制何首烏為滋陰藥， 性微溫， 味苦、甘、澀， 歸肝、心、腎經(jīng)， 具有滋補(bǔ)肝腎、填精益血、強(qiáng)筋健骨的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明其主要有延緩機(jī)體衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善心腦血管功能、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等作用[4-5]。課題組前期針對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋時(shí)期的生理特點(diǎn)， 以肝腎陰陽(yáng)雙補(bǔ)立法， 精選淫羊藿、制何首烏兩味藥材進(jìn)行組方， 經(jīng)粉碎混合制備成傳統(tǒng)散劑“藿烏散”， 研究發(fā)現(xiàn)其具有提高蛋雞產(chǎn)蛋性能和改善蛋品質(zhì)的效果。為了更好的推廣應(yīng)用， 課題組擬將傳統(tǒng)散劑“藿烏散”開(kāi)發(fā)成一款新型中獸藥“藿烏粉”。

本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上， 應(yīng)用現(xiàn)代中獸藥制劑技術(shù)，進(jìn)行 “藿烏粉”的提取工藝研究， 為將其開(kāi)發(fā)為微量、安全、高效、質(zhì)量可控、使用方便的新型中獸藥和在蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；B-491旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BU CHI公司)；SB25-12D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TB-215D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯天平有限公司)；HH-56數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 試藥 對(duì)照品2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱(chēng)二苯乙烯苷、批號(hào)82373-94-2， 含量98%)、淫羊藿苷(批號(hào)489-32-7， 含量98%)、朝藿定A(批號(hào)110623-72-8， 含量98%)、朝藿定B(批號(hào)110623-73-9， 含量98%)， 購(gòu)于江西佰草源生物科技有限公司；液相部分所用甲醇、乙腈、乙醇均為色譜純(美國(guó)Fisher公司)； 淫羊藿、制何首烏藥材， 購(gòu)于河北省安國(guó)市祁源中藥材有限公司。

2 方 法

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)色譜柱；柱溫30 ℃， 流速1 mL/min， 進(jìn)樣量10 μL； 二苯乙烯苷含量檢測(cè)：以V(乙腈)∶V(水)= 25∶75為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm； 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B含量檢測(cè)：以V(乙腈)∶V(水)=30∶70為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定二苯乙烯苷對(duì)照品適量， 加50%乙醇定容至刻度， 制成0.3920 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)定淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B對(duì)照品適量， 加50%乙醇定容至刻度， 制成含淫羊藿苷0.3463 mg/mL、朝藿定A 0.2334 mg/mL、朝藿定B 0.2607 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取藿烏提取物0.1 g， 置具塞錐形瓶中， 加入50%乙醇20 mL， 稱(chēng)定重量， 超聲處理15 min， 用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量， 搖勻， 濾過(guò)， 取續(xù)濾液， 即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 分別稱(chēng)取缺制何首烏、淫羊藿的陰性處方量藥材2份， 按最佳工藝制得缺何首烏和缺淫羊藿陰性樣品。精密稱(chēng)取陰性樣品0.1 g， 同“2.1.3”項(xiàng)下的處理方法， 制得陰性供試品溶液。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液適量， 分別進(jìn)樣， 得到相應(yīng)的液相圖譜。二苯乙烯苷色譜圖見(jiàn)圖1， 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B三種成分的色譜圖見(jiàn)圖2。

A-對(duì)照品； B-供試品； C-缺制何首烏陰性供試品；1- 二苯乙烯苷?qǐng)D1 二苯乙烯苷HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms of Stilbene glycoside

A-對(duì)照品； B-供試品； C-缺淫羊藿陰性供試品；1- 朝藿定A； 2-朝藿定B； 3-淫羊藿苷?qǐng)D2 淫羊藿三種黃酮成分的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatograms of three flavonoids in Epimedium

2.1.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液適量， 對(duì)照品溶液依次稀釋2、4、8、16、32倍。混合對(duì)照品溶液依次稀釋2、4、8、16、32、64倍。按相應(yīng)的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定， 記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)， 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 進(jìn)行回歸分析， 線性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察Tab 1 Investigation of linear relationship

2.1.5.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液各一份， 按相應(yīng)的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次， 測(cè)得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B峰面積的RSD值分別為0.55%、0.66%、0.67%、0.75%， 表明儀器精密度良好。

2.1 穴播根據(jù)樹(shù)種的種粒大小，每穴均勻地播入數(shù)粒到數(shù)十粒種子。播后覆土鎮(zhèn)壓。操作簡(jiǎn)單、靈活、用工量少。

2.1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液各一份， 按相應(yīng)的色譜條件分別在0， 2， 4， 8， 12， 24 h時(shí)進(jìn)樣， 測(cè)得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B峰面積的RSD值分別為0.62%、0.42%、0.47%、0.49%， 表明對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份供試品， 根據(jù)“2.1.3”項(xiàng)下的供試品制備方法， 平行制備6份供試品溶液， 并按照相應(yīng)的色譜條件測(cè)定各成分的含量， 測(cè)得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為35.23、19.70、7.12、11.20 mg/g，RSD分別為1.55%、0.48%、0.78%、0.77%。

2.1.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的樣品(二苯乙烯苷35.78 mg/g、淫羊藿苷19.78 mg/g、朝藿定A 7.10 mg/g、朝藿定B 11.39 mg/g)0.025 g， 共6份， 分別置于50 mL錐形瓶中， 加入1 mL混合對(duì)照品溶液(二苯乙烯苷0.8931 mg/mL、淫羊藿苷1.648 mg/mL、朝藿定A 0.625 mg/mL、朝藿定B 1.060 mg/mL， 50%乙醇制)， 50%乙醇定容至20 mL。按“2.1.3”項(xiàng)下供試品的處理方法進(jìn)行處理， 之后按相應(yīng)的色譜條件測(cè)定， 測(cè)得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B的平均加樣回收率分別為102.05%、99.40%、101.04%、99.14%，RSD值分別為1.80%、0.43%、0.41%、0.40%， 結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.2 干膏得率測(cè)定 將藿烏粉提取液減壓濃縮， 得生藥質(zhì)量濃度0.5 g/mL的濃縮液。精密吸取濃縮液100 mL， 置已干燥恒重的蒸發(fā)皿內(nèi)， 60 ℃水浴蒸干， 于105 ℃干燥3 h， 取出置干燥器冷卻0.5 h， 精密稱(chēng)定重量， 計(jì)算干膏得率。干膏得率=(m1-m0)/M×100%， m0為蒸發(fā)皿質(zhì)量， m1為干浸膏與蒸發(fā)皿總質(zhì)量， M為中藥飲片的質(zhì)量。

2.3 單因素試驗(yàn) 取處方量藥材14份， 分別以乙醇濃度(A)、固液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)為自變量， 以二苯乙烯苷含量、三種黃酮之和以及干膏得率的綜合評(píng)分為因變量， 進(jìn)行提取， 提取液抽濾后照2.2項(xiàng)下方法得到干浸膏， 并計(jì)算干膏得率。將干浸膏粉碎， 照2.1項(xiàng)下的方法測(cè)定三種黃酮之和以及二苯乙烯苷的含量。

2.4 正交試驗(yàn) 在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 以乙醇濃度(A)、固液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)為自變量， 以二苯乙烯苷、三種黃酮之和以及干膏得率的綜合評(píng)分為因變量， 采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝， 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表2。綜合評(píng)分Y=二苯乙烯苷含量/最高含量×權(quán)重系數(shù)+三種黃酮之和/最高含量×權(quán)重系數(shù)+干膏得率/最高得率×權(quán)重系數(shù)。

表2 正交因素水平L9(34) 表Tab 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

2.5 指標(biāo)權(quán)重的確定

2.5.1 AHP法 據(jù)藿烏粉中各指標(biāo)對(duì)藥理活性作用的強(qiáng)弱， 采用1 ～ 9標(biāo)度法[6]對(duì)二苯乙烯苷、三種黃酮之和以及干膏得率三個(gè)權(quán)重指標(biāo)進(jìn)行量化， 各指標(biāo)優(yōu)先順序如下：二苯乙烯苷>三種黃酮之和>干膏得率， 構(gòu)建成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣， 見(jiàn)表3。根據(jù)矩陣評(píng)分情況利用SPSSAU軟件進(jìn)行AHP層次分析， 分析得二苯乙烯苷、三種黃酮之和以及干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為 0.5390、0.2972、0.1638。一致性比例因子(CR)=0.0089<0.10,因此判斷矩陣評(píng)分具有良好的一致性， 求得的權(quán)重系數(shù)有效。

表3 判斷矩陣評(píng)分Tab 3 Judgment matrix scoring

2.5.2 CRITIC法 CRITIC法是一種客觀的權(quán)重賦值方法， 它通過(guò)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差和相關(guān)系數(shù)來(lái)體現(xiàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的變異性和沖突性[7]。首先將正交中的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理， 歸一化的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSSAU軟件分析， 得二苯乙烯苷、三種黃酮之和、干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.2969、0.4439、0.2592。

2.5.4 綜合評(píng)價(jià)結(jié)果比較 分別采用AHP、CRITIC、AHP-CRITIC綜合加權(quán)法對(duì)正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)， 結(jié)果見(jiàn)表4。使用SPSS 25軟件對(duì)三種方法的評(píng)分結(jié)果進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析。AHP法和AHP-CRITIC法、CRITIC法和AHP-CRITIC法、AHP法和CRITIC法評(píng)分的相關(guān)系數(shù)分別為0.9817、0.9212、0.8854， 三者相關(guān)性顯著(P<0.01)。AHP和CRITIC法各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.0291， 接近于0， 且P>0.05， 說(shuō)明AHP和CRITIC法確定的權(quán)重系數(shù)沒(méi)有相關(guān)關(guān)系， 故選用AHP-CRITIC綜合加權(quán)法來(lái)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果。

表4 3種賦權(quán)方法綜合評(píng)分Tab 4 Synthetical scores of three weighting methods

2.6 提取工藝的驗(yàn)證 精密稱(chēng)取粗粉過(guò)的混合藥材3份， 每份100 g， 以篩選出的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)， 測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5(序號(hào)1～5、6～10、11～14依次為乙醇濃度、固液比、提取時(shí)間的單因素試驗(yàn))。由序號(hào)1～5的結(jié)果可知， 隨著提取溶劑中乙醇濃度的增加， 評(píng)分先增加后減少， 并在濃度為60%時(shí)評(píng)分最高， 因此將正交試驗(yàn)中乙醇的濃度水平設(shè)置為60%、70%、80%； 由序號(hào)6～10的結(jié)果可知， 隨著固液比的增加， 評(píng)分先增加后減少， 并在固液比為1∶12時(shí)達(dá)到最高， 因此將正交試驗(yàn)中固液比的水平定為1∶8、1∶12、1∶16； 由序號(hào)11～14的結(jié)果可知， 隨著提取時(shí)間的增加， 評(píng)分先增加后減少， 并在1.5 h時(shí)達(dá)到最高， 因此將提取時(shí)間的水平設(shè)置為0.5 h、1 h、1.5 h； 前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明提取次數(shù)也對(duì)提取效果有一定的影響， 為此增加了提取次數(shù)因素， 并將水平設(shè)置為1、2、3次。

表5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 5 Single factor test design and results

3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)AHP-CRITIC法確定的權(quán)重系數(shù)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分， 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6， 方差分析見(jiàn)表7。根據(jù)表6極值(R)的大小， 可知各因素主次關(guān)系為C>D>B>A。由表7可知， 四個(gè)因素對(duì)提取效果均無(wú)顯著性影響， 因此取各因素較高水平的組合， 得最佳工藝為A2B2C3D2?？紤]到乙醇濃度(A因素)K1和K2的值相差不大， 且對(duì)提取效果的影響最小， 故選用成本更低的A1， 最終確定提取工藝為A1B2C3D2， 即12倍量60%的乙醇加熱回流2次， 每次1.5 h。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 6 Orthogonal test design and results

表7 方差分析Tab 7 Analysis of variance

3.3 提取工藝的驗(yàn)證 提取工藝的驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知， 各指標(biāo)成分和綜合評(píng)分的RSD值均小于2%， 且平均綜合評(píng)分大于之前所有的單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定， 主要活性成分的提取率高， 可用于藿烏粉的制備。

表8 提取工藝的驗(yàn)證結(jié)果/(mg·g- 1)Tab 8 Results of extraction process verification experiment/(mg·g- 1)

4 討 論

本研究在查閱淫羊藿、制何首烏提取工藝相關(guān)文獻(xiàn)后， 選擇了二苯乙烯苷作為評(píng)價(jià)藿烏粉中制何首烏提取效果的指標(biāo)[9-10], 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B三種黃酮成分作為評(píng)價(jià)淫羊藿提取效果的指標(biāo)[11-12]。二苯乙烯苷是制何首烏中的主要活性成分， YANG等的研究表明二苯乙烯苷類(lèi)成分能增強(qiáng)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟的抗氧化能力從而延緩小鼠衰老[13]。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B是淫羊藿總黃酮的評(píng)價(jià)指標(biāo)。淫羊藿總黃酮是淫羊藿的主要活性成分， 具有促進(jìn)蛋雞生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用， GUO等的研究表明淫羊藿總黃酮能顯著提高蛋雞顆粒細(xì)胞的增殖、分化， 并促進(jìn)初級(jí)卵泡向?qū)忧奥雅莸霓D(zhuǎn)化[14]。

在選擇藿烏粉中二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B四種成分的含量測(cè)定方法時(shí)， 曾借鑒了江勛等人的思路[15]， 嘗試建立一種一測(cè)多評(píng)四種成分的HPLC方法。但最終的效果并不理想， 為此選擇了分開(kāi)測(cè)定二苯乙烯苷和淫羊藿三種黃酮成分的含量。二苯乙烯苷含量的測(cè)定方法參照了《中國(guó)藥典》2020版一部何首烏項(xiàng)下的方法[16]， 該方法重復(fù)性好， 且陰性無(wú)干擾， 故使用該方法作為測(cè)定藿烏粉中二苯乙烯苷含量的方法。淫羊藿三種黃酮成分含量的測(cè)定方法主要參照了《中國(guó)藥典》2020版一部淫羊藿項(xiàng)下的方法[16]， 但該方法用時(shí)較長(zhǎng)， 需要近35 min才能完全出峰， 因此適當(dāng)提升了流動(dòng)相中乙腈的比例， 將三種物質(zhì)的出峰時(shí)間壓縮至20 min內(nèi)。

在選擇多指標(biāo)權(quán)重方法時(shí)， 本文提到的AHP法雖能在一定程度上體現(xiàn)復(fù)方中藥君臣佐使的配伍規(guī)律， 但容易受主觀判斷的影響， 忽略數(shù)據(jù)本身的客觀屬性。CRITIC法雖能體現(xiàn)數(shù)據(jù)波動(dòng)性和數(shù)據(jù)間相關(guān)關(guān)系等客觀屬性， 但它沒(méi)有考慮到指標(biāo)間的輕重關(guān)系。AHP-CRITIC綜合加權(quán)法則結(jié)合了上述兩種方法的優(yōu)點(diǎn)， 在考慮各指標(biāo)輕重關(guān)系的同時(shí)又兼顧了數(shù)據(jù)本身的客觀屬性， 因此選用AHP-CRITIC綜合加權(quán)法對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析。

5 結(jié) 論

采用AHP-CRITIC綜合加權(quán)法結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選出的提取工藝經(jīng)驗(yàn)證穩(wěn)定、可行重復(fù)性好， 可用于藿烏粉的制備。