陳思源王思雨祁明媛李壟坡徐儀昕張 婷姚紫研趙洪慶*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)沙 410208;2.湖南炎帝生物工程有限公司,湖南 株洲 412000)

腎陽(yáng)虛是臨床最為常見(jiàn)的證型之一,由于患者素體陽(yáng)虛、年老腎虧、久病傷腎等因素引起腎陽(yáng)氣衰竭,以腰膝酸軟、畏寒肢冷、夜尿頻多、精神萎靡、性欲減退等為主要特征,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。西醫(yī)針對(duì)單一癥狀進(jìn)行治療,存在副作用多、依賴性、成癮性及停藥復(fù)發(fā)等缺點(diǎn),中醫(yī)藥立足整體,辨證論治,能夠系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)體腎陽(yáng)虛相關(guān)癥狀,療效獨(dú)特,從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)安全有效的補(bǔ)腎陽(yáng)產(chǎn)品,將具有重要的臨床價(jià)值及廣闊的市場(chǎng)前景。

蛹蟲(chóng)草又名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草,為麥角菌科、蟲(chóng)草屬真菌,是由子實(shí)體與菌核組成的復(fù)合體,其性平味甘,具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰、延緩衰老的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明,蛹蟲(chóng)草的活性成分主要包括蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、甾醇類(lèi)及蟲(chóng)草多糖,具有增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、性功能保護(hù)等作用,因其與冬蟲(chóng)夏草具有類(lèi)似的活性成分與臨床療效,能夠改善患者的肺腎氣虛證及疲勞綜合征,補(bǔ)腎壯陽(yáng),且蛹蟲(chóng)草易于培育,成本相對(duì)較低,近年來(lái)已逐漸成為冬蟲(chóng)夏草的替代品,應(yīng)用廣泛,具有很強(qiáng)的開(kāi)發(fā)價(jià)值[2-3]。然而,目前關(guān)于蛹蟲(chóng)草的基礎(chǔ)研究較少,其能否改善腎陽(yáng)虛模型大鼠的腎陽(yáng)虛狀態(tài),相關(guān)機(jī)制如何,尚未有相關(guān)報(bào)道,需要進(jìn)一步的相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)行深入探討。

芳香化酶基因CYP19是細(xì)胞色素P450超基因家族中的重要成員,主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及卵巢、睪丸等生殖系統(tǒng)相關(guān)組織中。研究表明,CYP19能夠通過(guò)調(diào)控下游信號(hào)編碼芳香化酶P450arom基因,后者能夠催化睪酮轉(zhuǎn)化為雌激素,是雌激素體內(nèi)合成的關(guān)鍵酶和限速酶,與下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG)軸功能密切相關(guān)[4-5]。鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calmodulin/calmodulin kinase Ⅱ, CaM/CaMKⅡ)是CYP19潛在的下游信號(hào),能夠調(diào)節(jié)HPG軸功能,并與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的完整性密切相關(guān)[6]。本研究擬建立腎陽(yáng)虛大鼠模型,明確蛹蟲(chóng)草通過(guò)增加體內(nèi)CYP19的表達(dá),進(jìn)而抑制CaM/CaMKⅡ激活,從而調(diào)控HPG軸發(fā)揮補(bǔ)腎陽(yáng)功效的作用機(jī)理。該機(jī)制的證實(shí)將首次明確CYP19/CaM/CaMKⅡ信號(hào)介導(dǎo)大鼠腎陽(yáng)虛病理狀態(tài)及蛹蟲(chóng)草的功效特點(diǎn)與潛在機(jī)制,將為蛹蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供重要理論支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠60只,雄性,SPF級(jí),7周齡,體重200～220 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],質(zhì)量合格證號(hào)(430727201101573875),飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(湘)2019-0009]。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度(22±2)℃,濕度(60±5)%,12 h明暗交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)(LLBH-202009140001)。

1.2 主要試劑與儀器

蛹蟲(chóng)草由湖南炎帝生物工程有限公司提供,將蛹蟲(chóng)草粉末用10倍量水浸泡30 min,提取兩次,第一次100℃浸提120 min,提取液過(guò)200目篩,藥渣繼續(xù)加水浸提60 min后過(guò)200目篩,合并濾液,于60～80℃減壓濃縮至相對(duì)密度1.18～1.25,冷凍干燥48 h得蛹蟲(chóng)草提取物;睪丸片由江西澤眾制藥股份有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H36022006,生產(chǎn)批號(hào):20200103,規(guī)格:36片(每片0.2 g),人用劑量為2.4 g/d;腺嘌呤(北京索萊寶科技公司,批號(hào):20200514);大鼠促性腺激素釋放激素(gonadotropinreleasing hormone, GnRH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、睪酮(testosterone, T)、雌二醇(estradiol, E2)ELISA試劑盒(江蘇菲亞生物科技公司,批號(hào):FY3396-A、FY3676-A、FY3452-A、FY3450-A);CYP19、CaM、CaMKⅡ一抗(英國(guó)Abcam公司,批號(hào):ab106168、ab134901、ab134041);β-tubulin一抗(美國(guó)Proteintech公司,批號(hào):10094-1-AP);BCA蛋白定量試劑盒、RIPA組織裂解液、RNA提取液(武漢賽維爾生物科技公司,批號(hào):G2026、G2002、G3013);DAB試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(武漢博士德生物公司,批號(hào):AR1022、MK1613)。

ME204型萬(wàn)分之一精密天平購(gòu)自瑞士梅特勒托利多公司;OML-QPA型生物組織切片機(jī)購(gòu)自湖北歐美萊科技公司;NP-B1型全自動(dòng)生物組織包埋機(jī)、NP-P3型組織攤烤片機(jī)購(gòu)自孝感市諾普電子科技公司;NanoDrop One超微量分光光度計(jì)、MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;Primo Star型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司;Gel Doc XR+型凝膠成像分析儀、CFX型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物處理

根據(jù)動(dòng)物體重將60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、蛹蟲(chóng)草提取物高劑量組、蛹蟲(chóng)草提取物中劑量組、蛹蟲(chóng)草提取物低劑量組、睪丸片組,每組10只。除正常組外,其余組均采用腺嘌呤(200 mg/kg)灌胃的方法建立腎陽(yáng)虛大鼠模型[7-8],連續(xù)42 d,正常組灌胃等體積蒸餾水。從造模第15天起開(kāi)始給予受試藥,依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)(第3版)》中人與大鼠體表面積系數(shù)換算大鼠用藥劑量[9],蛹蟲(chóng)草提取物高、中、低劑量組給藥劑量分別為0.72、0.36、0.18 g/kg(臨床等效2、1、0.5倍劑量),睪丸片組灌胃給予睪丸片水溶液,給藥劑量為0.216 g/kg(臨床等效劑量),正常組和模型組給予等體積蒸餾水,灌胃體積均為10 mL/kg,每天給藥1次,連續(xù)28 d。末次給藥后,檢測(cè)大鼠在體功能指標(biāo),完成后麻醉大鼠,剪開(kāi)腹腔,游離腹主動(dòng)脈進(jìn)行采血,解剖分離雙腎、睪丸、附睪、精囊腺組織,萬(wàn)分之一精密天平稱重,保存于4%多聚甲醛溶液中,其中睪丸組織保存于特定睪丸組織固定液中,用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的睪丸組織置于液氮中冷凍保存。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)

(1)一般指標(biāo)觀察

觀察各組大鼠行為狀態(tài)、毛發(fā)、二便、飲水飲食、墊料潮濕等情況,稱重,檢測(cè)體溫,并采用曠場(chǎng)箱(80 cm×80 cm×40 cm)評(píng)價(jià)動(dòng)物的自主活動(dòng)情況,曠場(chǎng)箱底部均勻劃分為25個(gè)方格,動(dòng)物從中心放入,其自由活動(dòng)30 s后記錄4 min內(nèi)水平跨格數(shù)及垂直站立數(shù)的總和。

(2)臟器指數(shù)

將組織分離后于萬(wàn)分之一分析天平上稱重,計(jì)算臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體重(g)。

(3)ELISA實(shí)驗(yàn)

采血后將血液靜置1 h,3000 r/min離心15 min,取上清液,得到血清樣本。采用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清GnRH、LH、T、E2水平,操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本中目的因子的含量。

(4)HE染色

組織充分固定后,石蠟包埋,以5 μm厚度連續(xù)切片,梯度乙醇脫水、浸蠟、水化、沖洗,采用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色,完成后將切片固定,中性樹(shù)脂封片,顯微鏡下進(jìn)行圖像采集,觀察各組大鼠腎、睪丸、附睪、精囊腺的病理形態(tài)并進(jìn)行拍照分析。

(5)免疫組化染色

取充分固定的睪丸組織,石蠟包埋,切片、脫水、浸蠟、水化、沖洗,滴加山羊血清于37℃封閉30 min,按說(shuō)明書(shū)對(duì)一抗進(jìn)行稀釋,采用稀釋后的一抗4℃孵育過(guò)夜;次日采用PBS緩沖液洗滌切片3次,反應(yīng)增強(qiáng)液孵育10 min后用二抗繼續(xù)孵育15 min;洗滌3次,DAB顯色液顯色5 min后用蘇木精復(fù)染15 s,脫水,透明,封片。于顯微鏡下選取視野進(jìn)行拍攝,應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白的積分光密度(IOD)值。

(6)Western blot實(shí)驗(yàn)

切取100 mg睪丸組織,加入1 mL組織裂解液冰上充分勻漿,離心取上清液,檢測(cè)上清液中總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠,將蛋白煮沸變性后上樣,上樣量為50 μg,80 V恒壓電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉2 h,加入按說(shuō)明書(shū)稀釋后的一抗,4℃孵育過(guò)夜。次日用TBST液洗滌條帶3次,每次15 min,加入二抗繼續(xù)孵育4 h,洗滌條帶3次,滴加混合顯影液,將條帶置于凝膠成像儀中顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值,目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白條帶灰度值除以內(nèi)參蛋白(β-tubulin)灰度值。

(7)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

切取100 mg睪丸組織,按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA,以mRNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:95℃、10 min預(yù)變性,95℃、15 s變性,60℃、30 s退火延伸,40個(gè)循環(huán)。采用經(jīng)典2-ΔΔCT法(Liva法)根據(jù)內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)分析目的基因mRNA的表達(dá)水平。引物由武漢賽維爾公司合成,其中CYP19引物序列(NM_017085.2):上游 5’-GCTGGACACTTCTAACAC GCTCTT-3’,下 游 5’-CTCCTTTGTCAGGTCTCC ACGT-3’,片段長(zhǎng)度298 bp;GAPDH引物序列(NM_017008.4):上游 5’-CTGGAGAAACCTGCCAA GTATG-3’,下游5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’,片段長(zhǎng)度138 bp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析,多重比較方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)法,方差不齊時(shí)用Tambane’sT檢驗(yàn)法,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠一般指標(biāo)的影響

正常組大鼠行為活動(dòng)、飲水?dāng)z食均正常,有明顯的探索欲,毛色光亮整潔,墊料較干凈,大便成形;模型組大鼠外形消瘦,墊料明顯潮濕,大便稀薄不成形,體溫降低(P＜0.01),自主活動(dòng)次數(shù)顯著減少(P＜0.01);蛹蟲(chóng)草提取物組大鼠行為活動(dòng)較正常,毛色亮潔,墊料較臟,潮濕程度一般,大便基本成形,高劑量組體溫升高(P＜0.05),自主活動(dòng)次數(shù)增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠體重、體溫及自主活動(dòng)次數(shù)的影響 (n=10)Table 1 Effects of Cordyceps militaris extract on body weight, body temperature and the number of voluntary activities in model rats

2.2 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠臟器指數(shù)的影響

與正常組相比,模型組大鼠腎臟指數(shù)、睪丸指數(shù)顯著增加(P＜0.01),精囊腺指數(shù)降低(P＜0.01);與模型組相比,蛹蟲(chóng)草提取物高劑量組腎臟指數(shù)與睪丸指數(shù)顯著降低(P＜0.05),精囊腺指數(shù)增加(P＜0.05),同時(shí),中劑量組與低劑量組腎臟指數(shù)均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠臟器指數(shù)的影響 (mg/g, n=10)Table 2 Effects of Cordyceps militaris extract on the organ index of model rats

2.3 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠血清因子水平的影響

與正常組相比,模型組血清GnRH、LH、T含量均顯著降低(P＜0.01),E2含量無(wú)顯著變化;與模型組相比,蛹蟲(chóng)草提取物高劑量組GnRH、LH、T含量均升高(P＜0.05),睪丸片組僅睪酮含量顯著升高(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

表3 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠血清因子的影響 (n=6)Table 3 Effects of Cordyceps militaris extract on serum factors in model rats

2.4 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠腎組織腎小球形狀規(guī)則,輪廓清晰,未觀察到炎性細(xì)胞的浸潤(rùn);睪丸生精小管基膜完整且厚,基膜內(nèi)可見(jiàn)排列整齊、致密且結(jié)構(gòu)正常的生精細(xì)胞及支持細(xì)胞,生精小管管腔內(nèi)可見(jiàn)大量精子;附睪管腔結(jié)構(gòu)清晰,管壁細(xì)胞排列緊密整齊,管壁較厚;精囊腺腺腔內(nèi)有許多皺襞,表面為假?gòu)?fù)層柱狀上皮,內(nèi)含有豐富的分泌顆粒、脂肪滴及脂褐素;模型組腎小球體積增大,基底膜明顯擴(kuò)張,通透性增加,伴有大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),部分大鼠可見(jiàn)明顯的腺嘌呤代謝物結(jié)晶累積;睪丸生精小管基膜變薄,基膜內(nèi)生精細(xì)胞排列紊亂,數(shù)量減少,生精小管腔內(nèi)間隙增大,精子數(shù)量減少;附睪部分管腔拉伸變形,管壁變薄,部分管壁破裂,偶可見(jiàn)碎片,管腔內(nèi)精子數(shù)量下降;精囊腺腺腔皺襞萎縮變薄,通透性增加,內(nèi)含物豐度減少。經(jīng)藥物治療后,各臟器損傷有不同程度的緩解,以蛹蟲(chóng)草提取物高劑量組效果最佳。見(jiàn)圖1。

圖1 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠組織形態(tài)的影響 (HE染色)Figure 1 Effects of Cordyceps militaris extract on the tissue morphology of model rats (HE staining)

2.5 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMK Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的影響

與正常組相比,模型組睪丸組織CYP19平均光密度值顯著下降(P＜0.01) ,CaM、CaMK Ⅱ顯著增加(P＜0.01);與模型組相比,蛹蟲(chóng)草提取物高劑量組CYP19平均光密度值升高(P＜0.01),CaM、CaMK Ⅱ降低(P＜0.01),中劑量組CYP19表達(dá)增加(P＜0.05),CaM降低(P＜0.01)。見(jiàn)圖2、表4。

表4 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMKⅡ平均光密度值的影響 (n=4)Table 4 Effects of Cordyceps militaris extract on the average optical density of CYP19, CaM and CaMKⅡ in the testis of model rats

圖2 各組大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMKⅡ陽(yáng)性表達(dá)情況 (免疫組化)Figure 2 The positive expression of CYP19, CaM and CaMKⅡ in testis of rats in each group (immunohistochemistry)

2.6 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比,模型組大鼠睪丸CYP19蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01),CaM、CaMK Ⅱ顯著增加(P＜0.01);經(jīng)睪丸片或高劑量蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)治療后,模型大鼠CYP19、CaM、CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)均得到有效逆轉(zhuǎn)(P＜0.01、P＜0.05),中劑量組對(duì)CYP19、CaMK Ⅱ表達(dá)也有顯著作用(P＜0.05)。見(jiàn)圖3、表5。

圖3 各組大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMK Ⅱ蛋白電泳圖Figure 3 Electrophoresis of CYP19, CaM and CaMKⅡ proteins in testis of rats in each group

表5 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMKⅡ表達(dá)的影響 (n=4)Table 5 Effects of Cordyceps militaris extract on the expression of CYP19, CaM and CaMKⅡ in the testis of model rats

2.7 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠睪丸CYP19 mRNA表達(dá)的影響

與正常組相比,模型組睪丸CYP19 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01) ;與模型組相比,睪丸片組和蛹蟲(chóng)草提取物高劑量組CYP19 mRNA水平顯著升高(P＜0.05)。見(jiàn)表6。

表6 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)模型大鼠睪丸CYP19 mRNA表達(dá)的影響 (n=4)Table 6 Effects of Cordyceps militaris extract on the expression of CYP19 mRNA in the testis of model rats

3 討論

《中華本草》中記載,蟲(chóng)草入肺腎二經(jīng),既能滋肺陰,又能補(bǔ)腎陽(yáng),主治腎虛,陽(yáng)痿遺精,腰膝酸痛,病后虛弱等。現(xiàn)代藥理研究證實(shí),蛹蟲(chóng)草具有腎保護(hù)作用。Sun等[10]研究表明,蛹蟲(chóng)草通過(guò)影響Toll樣受體4/核因子κB(toll-like receptor 4/nuclear factor κB, TLR4/NF-κB)氧化還原信號(hào)通路改善慢性腎疾病;Cai等[11]發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草通過(guò)調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)介導(dǎo)的自噬改善大鼠腎性高血壓損傷和腎纖維化;李冰等[12]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草提取物能夠同時(shí)發(fā)揮降血糖和腎保護(hù)作用,減緩糖尿病大鼠腎病程進(jìn)展;此外,蛹蟲(chóng)草對(duì)慢性腎衰、腎小球腎炎、肺腎氣虛證等病證也有一定的治療作用[13-15]。蛹蟲(chóng)草腎保護(hù)作用主要與蟲(chóng)草素以及多糖類(lèi)成分有關(guān)。Kopalli等[16]明確來(lái)源于藥用真菌蛹蟲(chóng)草的蟲(chóng)草素能夠減輕自然衰老大鼠體內(nèi)炎癥介導(dǎo)的腎和睪丸組織損傷;蟲(chóng)草素還具有補(bǔ)腎益精、改善性功能的功效[17],蛹蟲(chóng)草多糖則是蛹蟲(chóng)草治療糖尿病腎病的主要有效成分[18]。然而,目前關(guān)于蛹蟲(chóng)草對(duì)腎陽(yáng)虛模型動(dòng)物的研究?jī)H限于小鼠的在體功能及組織病理變化[19],未涉及相關(guān)機(jī)制,對(duì)于蛹蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)有一定局限。本研究旨在建立腎陽(yáng)虛大鼠模型,通過(guò)予以不同劑量的蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù),研究其補(bǔ)腎陽(yáng)的功效及潛在作用機(jī)理。

腎陽(yáng)虛病理模型主要包括大劑量激素造模、化學(xué)藥物誘導(dǎo)損傷、手術(shù)造模、自然衰老等,其中應(yīng)用最廣泛的是激素造模中的氫化可的松致腎陽(yáng)虛模型及藥物造模中的腺嘌呤致腎陽(yáng)虛模型,且兩者原理均是通過(guò)影響機(jī)體內(nèi)分泌軸的功能而引起腎陽(yáng)虛癥狀[20-21]。腺嘌呤是核酸的主要組成成分之一,當(dāng)機(jī)體攝入大劑量腺嘌呤時(shí),在酶的作用下轉(zhuǎn)變成極難溶解于水的2,8-二羥基腺嘌呤,沉積于腎小管,導(dǎo)致腎功能低下,同時(shí)其具有毒性作用,使腎組織中與糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的多種酶活性受到抑制,影響腎組織的能量代謝[22]。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索,本研究采用200 mg/kg劑量的腺嘌呤造模,發(fā)現(xiàn)大鼠外形消瘦、皮毛無(wú)光澤、活動(dòng)減少、體溫降低、尿量明顯增多、大便稀溏,表現(xiàn)出典型的腎陽(yáng)虛癥狀,模型建立成功。

HPG軸是機(jī)體三大功能軸之一,主要負(fù)責(zé)調(diào)控機(jī)體生殖功能。中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖,腎與生殖系統(tǒng)功能關(guān)系密切,腎虛與HPG軸功能異常亦密切相關(guān)[23]。HPG軸通過(guò)下丘腦分泌GnRH,作用于垂體釋放促卵泡生成素 (follicle-stimulating hormone, FSH) 、LH,該類(lèi)激素的合成分泌又進(jìn)一步作用于性腺組織,調(diào)節(jié)睪酮、雌二醇等性激素的分泌并反饋于下丘腦,從而調(diào)節(jié)機(jī)體生殖功能[24]。腎陽(yáng)虛通常伴隨著生殖功能的衰退,性激素分泌紊亂,在雄性中主要表現(xiàn)為睪酮分泌不足。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠體內(nèi)GnRH、LH、睪酮含量均顯著下降,雌二醇含量有上升趨勢(shì),同時(shí)腎、睪丸、附睪、精囊腺等與生殖相關(guān)的組織均存在明顯損傷,而蛹蟲(chóng)草提取物能夠上調(diào)HPG軸相關(guān)激素的水平,恢復(fù)HPG軸功能,緩解生殖組織的損傷狀態(tài)。

CYP19是細(xì)胞色素P450超基因家族中19號(hào)家族的唯一成員,負(fù)責(zé)編碼芳香化酶P450arom基因,后者與性腺激素的合成分泌密切相關(guān)。一方面,CYP敲除的雄性小鼠不能產(chǎn)生雌激素,導(dǎo)致生精細(xì)胞發(fā)育受阻,精子數(shù)量及活性明顯降低,小鼠生殖功能低下甚至完全不育[25];另一方面,睪丸組織CYP19的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致雌激素產(chǎn)生過(guò)多,也可引起不育[26]。CYP19基因主要通過(guò)cAMP依賴性蛋白激酶信號(hào)在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié),對(duì)于維持雌雄激素間的平衡、保證機(jī)體的正常生理功能具有重要意義[27]。CaM/CaMKⅡ信號(hào)通路是cAMP依賴性蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分。CaM是一種鈣結(jié)合蛋白,靜息態(tài)下無(wú)生物活性,在胞內(nèi)Ca2+增加時(shí),CaM會(huì)結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合物,并通過(guò)激活其特異性激酶CaMKⅡ發(fā)揮生物學(xué)活性[28-29]。CaM與垂體-靶腺軸的分泌功能密切相關(guān),可以作用于HPG軸的不同環(huán)節(jié)、不同層次,并通過(guò)不同的途徑對(duì)其進(jìn)行著復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)作用。研究表明,CaM表達(dá)增加可以通過(guò)線粒體途徑引起睪丸細(xì)胞凋亡,抑制CaMKⅡ能夠緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化損傷,提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞的完整性[30]。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠睪丸組織CYP19 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低,CaM、CaMKⅡ表達(dá)顯著增加,證實(shí)CYP19通過(guò)CaM/CaMKⅡ信號(hào)通路介導(dǎo)大鼠生殖損傷,而蛹蟲(chóng)草提取物則能明顯逆轉(zhuǎn)該趨勢(shì)。

綜上,蛹蟲(chóng)草提取物能夠調(diào)節(jié)HPG軸功能,緩解腎、睪丸等組織損傷,發(fā)揮補(bǔ)腎陽(yáng)功效,其機(jī)制可能與調(diào)控CYP19/CaM/CaMKⅡ信號(hào)有關(guān)。本研究首次闡明蛹蟲(chóng)草補(bǔ)腎陽(yáng)的潛在機(jī)理,有助于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用,下一步繼續(xù)挖掘其功效作用及潛在靶點(diǎn)。