韓 敏易 旭游紹偉

(1.貴州中醫(yī)藥大學,貴陽 550025;2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,貴陽 550003)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)是酒精性肝病逐漸發(fā)展和治療的關(guān)鍵病理前提[1-2]。盡管對酒精誘導脂肪肝的病理生理學進行了廣泛的研究,但在過去50年中,除了禁酒以及對癥處理和營養(yǎng)支持外,仍然沒有針對性的治療[3-4]。白藜蘆醇是一種存在于紅酒和葡萄的膳食多酚,研究顯示在減輕酒精性和非酒精性肝功能障礙、膽汁淤積性肝損傷、化學性肝毒性、肝缺血再灌注等方面具有獨特的藥理活性[5-8]。Tang等[9]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理減少了油酸和酒精作用后的HepG2細胞內(nèi)脂滴形成。類似地,Tang等[10]、Kasdallah-Grissa等[11]、Chen等[12]和Ma等[13]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇除可能通過誘導自噬對酒精性脂肪肝變性具有保護作用外,膳食補充或服用白藜蘆醇可降低酒精誘導的大鼠或C57BL/6J小鼠肝的氧化應激和凋亡,增加超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)等抗氧化酶活性,上調(diào)肝缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)蛋白表達,從而減少酒精性肝損傷。白藜蘆醇也作為蛋白質(zhì)去乙?；窼IRT1的激動劑,可以通過上調(diào)肝中SIRT1-AMPK信號系統(tǒng)阻止乙醇喂養(yǎng)小鼠酒精性脂肪肝的發(fā)生[14-18]。盡管白藜蘆醇的有益作用已在各種酒精性肝病的動物和細胞模型中得到充分證實,但其具體作用分子機制仍不清楚。使用多種蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)分別在一定程度上揭示了大鼠或小鼠肝組織在攝入不同程度酒精后的蛋白質(zhì)表達變化[19-22]。遺憾的是,這些研究結(jié)果較零散,且對AFLD這一重要酒精性肝病病理初始階段的肝蛋白質(zhì)表達譜變化缺乏了解[23-24]。因此,本文運用4D非標定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)檢測AFLD小鼠肝組織蛋白質(zhì)表達情況,并由此探索白藜蘆醇介導的抗AFLD干預作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠9只,8～10周齡,體重(22±2)g,由北京唯尚立德生物科技有限公司提供[SCXK(京)2021-0010]。飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心(北校區(qū))帶有IVC系統(tǒng)的飼養(yǎng)房內(nèi)[SYXK(黔)2018-0001],20～23℃。實驗前適應性喂養(yǎng)1周,自由進食SPF級鼠飼料和自由飲用滅菌自來水。實驗過程嚴格遵守3R原則。動物實驗由貴州中醫(yī)藥大學倫理委員會審批(20210093)。

1.2 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司,生產(chǎn)編號:P0011);胰蛋白酶(美國Promega,生產(chǎn)編號:V5117);乙腈(美國Thermofisher scientific,生產(chǎn)編號:204433);甲酸(美國Fluka,生產(chǎn)編號:A117-50);二硫蘇糖醇(美國Sigma,生產(chǎn)編號:D9163-25G)。除鹽柱(Phenomenex,貨號:8B-S100-EBJ);NanoElute液相色譜儀、Tims TOF Pro飛行時間質(zhì)譜儀(美國bruker)。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物制備

運用高壓滅菌的30% koliphor HS15(BASF,30944788Q0)制備白藜蘆醇(sigma,R5010)溶液。

1.3.2 動物分組與處理

小鼠分為對照組(C)、AFLD組(M)及白藜蘆醇干預組(R),采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料自由攝入+1次95%乙醇灌胃的NIAAA法制備小鼠AFLD模型和給予400 mg/kg白藜蘆醇灌胃處理,具體方法見以往發(fā)表文章[25]。最后1次用藥后24 h收集肝組織,以備蛋白組學檢測分析用。

1.3.3 肝組織總蛋白質(zhì)制備和胰蛋白酶水解

取適量-80℃保存的肝組織,用液氮研磨成粉末,加入40 μL體積含8 mol/L尿素、1%蛋白酶抑制劑、3 μmol/L去乙酰化酶抑制劑、50 mmol/L煙酰胺的裂解緩沖液,進行3次高強度超聲裂解。4℃,12 000 r/min離心10 min后,收集上清液,蛋白質(zhì)濃度用BCA法測定。取等量蛋白質(zhì)樣品和適量標準蛋白質(zhì)混合物,加入終濃度為20% v/v的三氯乙酸,充分混合,4℃沉淀2 h。500 r/min離心5 min后,使用預冷丙酮洗滌和沉淀樣品。在最終濃度為200 mmol/L的四乙基溴化銨溶液中進行超聲分散,然后添加1/50比例的胰蛋白酶過夜處理,加入最終濃度為5 mmol/L的二硫蘇糖醇,然后在56℃下還原30 min。

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

分別制備含有2%乙腈和0.1%甲酸的液相色譜流動相A溶液和含有100%乙腈和0.1%甲酸的B溶液,然后通過納米管UHPLC系統(tǒng)分離溶解在流動相A溶液中的肽。將流速設置為300 NL/min,按2%～5% B,0～1 min進行;5%～27% B, 1～76 min;27%～35% B,76～82 min和35%～85% B,82～86 min。分離的肽經(jīng)毛細管離子源電離,電壓為1.75 kV,然后進行一次和二次(掃描范圍為100～1700)串聯(lián)質(zhì)譜分析,動態(tài)排除時間掃描為30 s。

1.3.5 肝組織蛋白組學的生物信息學分析

(1)數(shù)據(jù)庫搜索

借助Maxquant (v1.6.15.0)進行二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索,在Mus_musculus_10090_SP_20201214中有蛋白質(zhì)序列。FASTA(17 063序列)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建理論二級光譜數(shù)據(jù)庫,搜索質(zhì)譜產(chǎn)生的二級光譜,并與理論二級光譜圖進行比較,通過算法評分和過濾得到匹配的理論肽序列,完成樣品蛋白質(zhì)的識別,識別出的蛋白質(zhì)特異性肽可以識別蛋白質(zhì)信息。

(2)蛋白質(zhì)的定量分析及差異表達蛋白的篩選

將肽段在不同樣本中的肽信號強度值通過中心化變化后得到相應的相對定量值,進一步采用中位數(shù)歸一化方法校正后用于計算蛋白的相對定量值。最后采用皮爾森相關(guān)性、主成分分析和相對標準差三種統(tǒng)計分析方法對蛋白質(zhì)定量結(jié)果進行重復性檢驗,使定量結(jié)果具有統(tǒng)計學一致性。以重復定量值的平均值比值作為各蛋白質(zhì)在AFLD組/對照組(M/C)、白藜蘆醇組/AFLD組(R/M)、白藜蘆醇組和對照組(R/C)3個樣本比較對中的表達差異倍數(shù),經(jīng)過Log2對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行t檢驗分析,并計算相應的P值,以此作為顯著性指標。以滿足P＜0.05和差異倍數(shù)≥1.5或≤0.67兩個條件進行顯著上調(diào)或下調(diào)的差異表達蛋白篩選,將同時在3個樣本比較組中顯著差異表達的蛋白視為差異共表達蛋白。

(3)差異表達蛋白的GO、KEGG分析及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析

對每個比較組的差異表達蛋白進行了基因本體論(GO)分類和KEGG通路分析。將3個比較組中共表達的差異蛋白進行GO功能富集及KEGG通路分析,然后將3個比較組中篩選出的差異共表達蛋白的蛋白序列與STRING(v.11.0)蛋白網(wǎng)絡互作數(shù)據(jù)庫比對,根據(jù)confidence score＞0.4提取得到差異蛋白互作關(guān)系,并對差異蛋白互作網(wǎng)絡進行可視化展示。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。組間蛋白差異倍數(shù)值比較采用Student’st檢驗,P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對AFLD小鼠肝脂肪變性的影響

經(jīng)油紅“O”染色后鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預后AFLD小鼠肝細胞脂肪變性顯著減輕,具體結(jié)果可參見以往發(fā)表論文[24]。

2.2 肝組織蛋白質(zhì)表達質(zhì)譜鑒定、定量及差異表達蛋白質(zhì)篩選結(jié)果

各實驗組共鑒定出4513個蛋白質(zhì),其中定量蛋白質(zhì)有3763個。M/C、R/M和R/C 3個樣本比較組共篩選出1228個顯著差異表達蛋白質(zhì)。與對照組比較(P＜0.05),AFLD組、白藜蘆醇干預組小鼠肝組織中分別有324、40個蛋白表達顯著上調(diào)和分別有370、43個蛋白表達顯著下調(diào)。與AFLD組比較(P＜0.05),白藜蘆醇干預組小鼠肝組織分別有224、227個蛋白表達顯著上調(diào)和下調(diào)(如圖1)。白藜蘆醇干預后能夠?qū)⒛Ｐ徒M中198個顯著上調(diào)、171個顯著下調(diào)表達的蛋白質(zhì)分別相應地顯著下調(diào)和上調(diào)。運用火山圖分析3個樣本比較組之間蛋白質(zhì)表達水平的差異(如圖2)。

圖1 三個樣本比較組差異表達蛋白質(zhì)篩選Figure 1 Screening of differentially expressed proteins in three sample comparison groups

圖2 三個樣本比較組差異表達蛋白質(zhì)的火山圖分析Figure 2 Volcanic map analysis of differentially expressed proteins in three sample comparison groups

2.3 差異表達蛋白的功能富集分析結(jié)果

1228個差異表達蛋白的GO功能富集分析顯示,M/C、R/M和R/C三個比較組對分別涉及19、10、11個生物過程、19、9、8個細胞組成和14、11、13個分子功能的變化(如圖3),此外,分別有13、15和17個KEGG通路顯著富集(如圖4)。

圖3 差異表達蛋白的GO分類分析結(jié)果Figure 3 GO classification analysis results of differentially expressed proteins

圖4 差異表達蛋白的KEGG富集通路分析結(jié)果Figure 4 Analysis results of KEGG enrichment pathway of differentially expressed proteins

2.4 差異共表達蛋白篩選及GO功能、KEGG通路分析

在M/C、R/C、R/M 3個比較組中篩選出11個差異共表達蛋白質(zhì),其中推測水解酶(putative hydrolase RBBP9, Rbbp9),白細胞彈性蛋白酶抑制劑A(leukocyte elastase inhibitor A, Serpinb1a),蛋氨酸-R-亞砜還原酶 B1(methionine-R-sulfoxide reductase B1, Msrb1),硫轉(zhuǎn)移酶家族胞質(zhì)1B(sulfotransferase family cytosolic 1B, Sult1b1)等4個蛋白在模型組中顯著下調(diào)0.08～0.39倍,過氧化物酶體膜蛋白(peroxisomal membrane protein, Slc25a17),載脂蛋白A-IV(apolipoprotein A-IV, Apoa4),UDP-N-乙酰己糖胺焦磷酸化酶樣蛋白1( UDP-N-acetylhexosamine pyrophosphorylase-like protein 1, Uap1l1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)金屬肽酶1(endoplasmic reticulum metallopeptidase 1, Ermp1),甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶3(glycerol-3-phosphate acyltransferase 3, Gpat3),環(huán)氧化物水解酶1(epoxide hydrolase 1, Ephx1),STIP1同源性含U盒蛋白1(STIP1 homology and U box-containing protein 1, Stub1)等7個蛋白顯著上調(diào)2.44～6.79倍,相應地,經(jīng)白藜蘆醇干預后能夠分別上調(diào)1.6～6.0倍和下調(diào)0.26～0.63倍。GO功能富集分析顯示,除Rbbp9、Ermp1 2個蛋白質(zhì)無分子功能外,其余9個蛋白質(zhì)涉及9種分子功能(如表1)。此外,KEGG通路分析顯示其中Apoa4、Uap1l1、Slc25a17、Gpat3、Ephx1等5個蛋白質(zhì)分別涉及脂肪消化和吸收、過氧化物、異生物質(zhì)CYP450代謝和代謝等5條通路(如圖5)。

圖5 11個差異共表達蛋白的KEGG通路分析結(jié)果Figure 5 Analysis results of KEGG enrichment pathway of 11 differentially co-expressed proteins

表1 11個差異共表達蛋白質(zhì)分子功能及差異倍數(shù)Table 1 Molecular functions and differential fold values of 11 differentially co-expressed proteins

2.5 差異共表達蛋白網(wǎng)絡互作分析結(jié)果

11個差異共表達蛋白網(wǎng)絡互作分析結(jié)果顯示,Sult1b1、Apoa4、Agpat9(Gpat3)、Ephx1等4個蛋白具有相互作用關(guān)系,其余7個蛋白Rbbp9、Msrbl、Ermpl、Stubl、Slc25a17、Serpinbla、Uap1l1無相互作用關(guān)系(如圖6)。

圖6 11個差異共表達蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡互作關(guān)系圖Figure 6 Network interaction diagram of 11 differentially co-expressed proteins

3 討論

眾所周知,疾病往往伴隨著多個層面的蛋白質(zhì)功能障礙[26-27]。蛋白質(zhì)組學技術(shù)的進步使篩選與疾病發(fā)生、防治相關(guān)的蛋白標志物成為可能[28-30]。因此,全面了解AFLD相關(guān)信號通路中涉及的蛋白質(zhì)分子可能會為AFLD的發(fā)生機制理解以及開發(fā)合適的臨床治療或新藥的方法提供有價值的見解。Song等[31]通過蛋白質(zhì)組學方法分析了刺梨對高脂血癥小鼠肝組織蛋白質(zhì)表達的影響,發(fā)現(xiàn)了15種與脂質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)。類似的,Dai等[32]通過定量化學蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn),從黃芩中提取的黃芩苷激活了肝肉堿棕櫚基轉(zhuǎn)移酶1,從而對代謝性疾病(如肝脂肪變性和肥胖)起到干預作用。Du等[33]利用蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn),賴氨酸丙二?；赡芘c2型糖尿病治療密切相關(guān)。Liu等[34]利用蛋白質(zhì)翻譯后修飾技術(shù)發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶14通過穩(wěn)定其底物脂肪酸合酶在非酒精性脂肪肝中發(fā)揮作用。白藜蘆醇作為治療酒精性肝病研究最廣泛、最有前途的膳食多酚[5-8],其具體作用分子機制仍不清楚。故本文采用更高檢測深度的4D非標定量蛋白質(zhì)組學分析技術(shù),從AFLD組中獲得了370個差異表達蛋白質(zhì),該結(jié)果提示慢性飲酒可導致肝組織蛋白質(zhì)表達譜的顯著變化,也表明這些差異蛋白可能參與了AFLD的形成。白藜蘆醇干預后能分別將AFLD小鼠其中下調(diào)表達的蛋白質(zhì)中的198個上調(diào)、將上調(diào)表達中的171個蛋白實現(xiàn)下調(diào)的結(jié)果表明,這些蛋白也可能與白藜蘆醇的AFLD干預作用可能密切相關(guān)。因此,慢性酒精攝入后引起肝組織蛋白質(zhì)表達譜變化的結(jié)果為后續(xù)探討藥物干預機理和完善AFLD發(fā)生機制提供了重要的研究方向。進一步的差異表達蛋白質(zhì)的功能富集分析也表明這些差異表達蛋白質(zhì)與多種生物學效應有關(guān),能夠通過多種途徑直接或間接影響小鼠攝入酒精后的肝病理學結(jié)局。

有趣的是,運用PPI分析,我們從11個差異共表達蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了4個具有相互作用關(guān)系的蛋白質(zhì),即環(huán)氧化物水解酶1(Ephx1)、載脂蛋白A-IV(Apoa4)、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶3(Gpat3)和硫轉(zhuǎn)移酶家族胞漿1B成員(Sult1b1),然而與酒精性肝病關(guān)系尚不明確。本文檢測結(jié)果顯示,酒精攝入后小鼠肝組織Ephx1、Apoa4、Gpat3的表達水平均分別顯著上調(diào)3.38、6.79和3.98倍,經(jīng)白藜蘆醇干預后均分別顯著下調(diào)了0.54、0.26和0.53倍。相反地,Sult1b1在酒精攝入后顯著下調(diào)0.21倍,經(jīng)白藜蘆醇干預后顯著上調(diào)2.87倍。GO分類和KEGG通路功能富集分析顯示Ephx1通過細胞色素P450代謝外源性物質(zhì)途徑發(fā)揮作用。Ephx1為在肝中廣泛表達的解毒酶和水解酶折疊酶[35],Gautheron等[36]通過小鼠3T3-L1前脂肪細胞的Ephx1敲除實驗,證明了Ephx1敲除促進細胞的氧化應激和衰老。然而也有研究證明Ephx1與細胞色素P450酶偶聯(lián)[37],Davydov等[38]使用化學交聯(lián)質(zhì)譜法確證了Ephx1和細胞色素P450 2E1的相互作用關(guān)系。微粒體Ephx1活性的增加可能通過增加細胞色素P450活性加速酒精向其有毒代謝物乙醛的轉(zhuǎn)化[39]?；诩毎豍450 2E1與AFLD發(fā)生的密切相關(guān)性認知[40-41],這些結(jié)果表明了白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)Ephx1表達水平進而影響細胞色素P450活性,從而達到小鼠AFLD的保護作用。脂肪生成和分解代謝的不平衡會導致脂肪肝等代謝性疾病[42]。Apoa4是主要表達于腸上皮細胞中的交換性載脂蛋白家族成員之一,它在促進腸脂質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝中起關(guān)鍵作用[43-45]。Li等[42]發(fā)現(xiàn)Apoa4缺乏會降低小鼠肝脂肪分解相關(guān)限速酶的表達,Apoa4會促進脂肪分解和能量代謝。此外,肝Apoa4蛋白的過度表達在肝纖維化初期和非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝癌中得到證實[46-47]。Kang等[48]使用微陣列分析鑒定了參與肝脂肪代謝的人亮氨酸拉鏈蛋白(LZIP)誘導基因,發(fā)現(xiàn)LZIP和Apoa4在人類脂肪變性樣品中均高度表達,并促進小鼠肝中的肝脂肪變性。近期Tryndyak等[49]利用飲食誘導的肝細胞脂肪變性體外模型,也證明了Apoa4表達的顯著上調(diào)。一致地,我們的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)也顯示AFLD小鼠肝組織Apoa4蛋白的上調(diào)表達和白藜蘆醇干預后的下調(diào)表達。提示白藜蘆醇可能通過干預Apoa4的表達,調(diào)節(jié)腸道脂肪消化吸收途徑參與小鼠AFLD的保護作用,不過需要進一步的驗證。Gpat3是甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶的一種亞型酶,在脂肪組織中高度表達,有研究證明Gpat3的敲低不僅減少甘油三酯的合成,還會損害脂肪的生成[50]。Gao等[51]通過Seipin/Gpat3敲除小鼠體內(nèi)實驗,也發(fā)現(xiàn)Gpat3的缺乏能夠緩解嚴重先天性全身性脂肪營養(yǎng)不良小鼠模型中的胰島素抵抗和肝脂肪變性。Pagac等[52]在運用3T3-L1前脂肪細胞,發(fā)現(xiàn)敲低Gpat3顯著增強了脂肪細胞分化,而Sim等[53]通過Gpat3過表達3T3-L1細胞實驗發(fā)現(xiàn)增強的Gpat3活性將積極調(diào)節(jié)脂肪細胞分化。Khatun等[54]發(fā)現(xiàn)Gpat3敲除小鼠表現(xiàn)出減弱的血漿甘油三酯偏移和腸細胞中積聚的脂質(zhì)等結(jié)果證明了Gpat3是參與腸脂代謝的新型酶,腸道Gpat3是脂質(zhì)吸收的次要途徑。因此,研究這個蛋白是否通過脂肪細胞分化、腸道脂質(zhì)吸收失衡來參與酒精誘導的脂肪肝及作為藥物干預作用靶點將會是非常有意義的。綜合我們的蛋白質(zhì)組學定量數(shù)據(jù)和功能富集分析結(jié)果,提示,通過調(diào)節(jié)Gpat3對肝脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)代謝通路的影響也可能是白藜蘆醇發(fā)揮抗AFLD的重要途徑。作為SULT家族成員之一的Sult1b1是小腸中表達并參與人體異源解毒的主要酶,與SULT1A3/4一起主要構(gòu)成組織中硫轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)[55-56]。Lian等[57]近期通過生物信息學分析和qRT-PCR鑒定、驗證了Sult1b1在結(jié)直腸癌細胞中表達水平的顯著降低,確定了是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的新型生物標志物。然而Sult1b1雖然在藥物、環(huán)境毒素和內(nèi)源性類固醇的代謝中起重要作用已經(jīng)被證實[58],但是很少有研究顯示Sult1b1表達或活性在酒精攝入后肝病理條件下的變化。我們研究結(jié)果表明了AFLD小鼠肝組織中Sult1b1的顯著表達下調(diào)和白藜蘆醇干預后的顯著上調(diào)。GO功能富集分析結(jié)果顯示該蛋白涉及催化活性和轉(zhuǎn)移酶活性兩種分子功能,提示通過上調(diào)Sult1b1表達增強其發(fā)揮清除外源性物質(zhì)、加強酒精代謝可能參與白藜蘆醇的小鼠的AFLD保護作用,有必要深入了解具體的分子作用機理。

綜上所述,我們研究了AFLD小鼠肝組織中蛋白質(zhì)表達譜的變化及其與白藜蘆醇干預作用的可能相關(guān)性。白藜蘆醇至少通過正向或負向調(diào)節(jié)Sult1b1、Apoa4、Gpat3、Ephx1等4個蛋白質(zhì)的表達,發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道脂肪消化、細胞色素P450代謝外源性物質(zhì)途徑和代謝途徑來減輕小鼠肝的酒精性脂肪變性,有望成為新的治療AFLD的靶點,值得進一步探討。