楊繼濤 法憲恩

1 北大醫(yī)療魯中醫(yī)院胸心血管外科，山東省淄博市 255400； 2 鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管外科

心肌梗死已經(jīng)成為全球人類死亡的頭號病因。雖然在心肌梗死診療方面取得了很大的進步，比如新型藥物、新的再灌注方案及再血管化方式的應(yīng)用，但是成人心肌細胞再生能力很差，這就需要采取有效的措施來挽救受損的心肌細胞。

Goldman醫(yī)生首次報道將激光應(yīng)用于醫(yī)學，因此他也被稱為激光醫(yī)學之父。10年后，高能CO2激光被應(yīng)用于心肌打孔，該激光有很高的能量，1～100W/cm2。CO2激光可以產(chǎn)生微孔道，不會產(chǎn)生碎屑，也不會導致纖維組織生成，可以讓心室腔的血液直接流入缺血的心肌[1]，即心肌打孔血運重建技術(shù)，為那些冠狀動脈彌漫性病變不能行冠狀動脈介入治療或者冠狀動脈搭橋手術(shù)的患者提供了一種治療手段。

而低能激光發(fā)生非熱能光束，傳遞的能量不會損傷組織，但又足以引起非熱依賴的刺激效應(yīng)。低能激光照射應(yīng)用于實驗研究和臨床已有40余年的歷史[2]，動物實驗和臨床研究證明低能激光照射可以調(diào)節(jié)多種生物學過程，比如：改善微循環(huán)，促進傷口愈合，減輕炎癥反應(yīng)，促進成骨細胞、淋巴細胞、關(guān)節(jié)軟骨細胞、成纖維細胞等細胞的增殖。Oron等通過大量動物實驗發(fā)現(xiàn)低能激光照射可以明顯減少心肌梗死后梗死心肌面積[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)低能激光照射可以增加梗死心肌中ATP含量，降低線粒體損傷，顯著上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和誘導性一氧化氮合酶(iNOS)的表達從而保護心肌[4]。本研究通過觀察低能激光照射(Low level laser irradiation，LLLI)對大鼠心肌梗死后梗死心肌中抗氧化物質(zhì)SOD活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的影響，探討低能激光照射對大鼠心肌梗死后心肌組織微環(huán)境的影響及對心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雌性SD大鼠120只(體質(zhì)量230～270g，購于河南省實驗動物中心)，分為假手術(shù)組(S組，n=30)，對照組(C組，n=45)和治療組(L組，n=45)。

1.2 主要儀器及試劑 10%水合氯醛溶液，SOD與MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TY-1型激光治療儀(北京天佑科儀科技有限公司)，MS4000小動物呼吸機HX-100E型(成都泰盟科技有限公司),RM6240-C型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，UNICO UV-2000分光光度計，DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀(華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)。

1.3 模型制作方法 通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型[5]：術(shù)前30min肌肉注射青霉素10萬單位預防感染，10%水合氯醛溶液(300g/kg)腹腔注射麻醉，備皮，氣管插管并呼吸機輔助呼吸(頻率70次/min，潮氣量3ml/100g)，胸骨左緣心臟搏動處縱行切開皮膚約3cm，分層于第4肋、第5肋間打開胸腔，小心分開心包膜，暴露心臟，以6-0 prolene線在肺動脈圓錐和左心耳間距主動脈根部3～4mm處，以左冠狀靜脈為標志，連同一束心肌結(jié)扎左冠狀動脈前降支，穿針后于心臟表面噴灑0.05ml 2%利多卡因注射液，待心律規(guī)整后結(jié)扎縫線，以心臟前壁局部顏色變?yōu)榘咨珵闃酥荆?×17絲線逐層關(guān)胸。存活模型大鼠隨機分為對照組(n=35)和治療組(n=35)。假手術(shù)組手術(shù)操作同模型操作，但冠狀動脈只穿線不結(jié)扎縫線(n=25)。手術(shù)結(jié)束后30℃下保溫至大鼠蘇醒，術(shù)后3d連續(xù)肌肉注射青霉素10萬單位預防感染，飲食充足供應(yīng)。

1.4 低能激光照射 本研究采用二極管激光治療儀(波長635nm，功率6mW，照射時間125s，能量密度0.96J/cm2)，大鼠心肌梗死后3周再次麻醉，于第5肋間開胸，暴露心臟，排除心肌梗死欠明顯模型，心梗明確大鼠給予激光照射于心肌梗死部位。假手術(shù)組、對照組操作同前，但不開通激光治療儀。操作結(jié)束后逐層關(guān)胸。

1.5 心肌組織中SOD和MDA測定 分別于二次開胸后1h、24h、48h、72h、1周處死大鼠，取出心臟，采集各組大鼠整塊梗死的心肌組織部分，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。標本采集結(jié)束后，取保存的新鮮心肌組織在低溫條件下制備組織勻漿液，分別以黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.6 組織病理學觀察 大鼠心肌梗死后4周 10%水合氯醛溶液麻醉，開胸取出大鼠心臟，剪去多余的結(jié)締組織和大血管，應(yīng)用生理鹽水充分沖洗至心腔內(nèi)無血液殘留，放入10%甲醛溶液中固定，冠狀動脈結(jié)扎線以下部分做一與房室溝平行的切面，取結(jié)扎線以下部分常規(guī)制備石蠟切片(5μm)，用于HE染色，觀察左室壁病理變化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心梗模型的制備 制備大鼠心梗模型的成功率約為77.8%，左冠狀動脈前降支結(jié)扎后肉眼可見心臟左室局部顏色變白。3周后切取心臟肉眼觀可見明顯的梗死區(qū)，與周邊存活心肌區(qū)別明顯。HE染色在組織學上顯示梗死區(qū)心肌組織壞死，無正常心肌結(jié)構(gòu)，與梗死周邊區(qū)存活的心肌組織區(qū)別明顯，表明心梗造模成功。

2.2 大鼠梗死心肌組織中SOD活性變化 對照組和LLLI治療組大鼠梗死心肌組織中SOD活性比假手術(shù)組明顯降低(P<0.05)，各組心肌組織中SOD活性呈現(xiàn)出術(shù)后1～48h逐漸升高，在72h后逐漸降低的趨勢。低能激光照射后SOD活性在術(shù)后1h、24h、48h比對照組明顯提高(P<0.05)，在48h達到最高，但仍較未心肌梗死的心肌組織低(P<0.05)。72h和1周時，LLLI治療組和對照組SOD活性無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 AMI二次手術(shù)后各時間點SOD活性比較(U/mgprot，n=4～6)

2.3 大鼠梗死心肌組織中MDA含量變化 對照組和LLLI治療組大鼠梗死心肌組織中MDA含量比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，各組心肌組織中MDA含量呈現(xiàn)出術(shù)后1～48h逐漸降低，在72h后逐漸升高的趨勢。低能激光照射后MDA含量在術(shù)后1h、24h、48h比對照組明顯降低(P<0.05)，在48h達到最低，但仍較未心肌梗死的心肌組織高(P<0.05)。72h和1周時，LLLI治療組和對照組MDA含量無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 AMI二次手術(shù)后各時間點MDA含量比較(nmol/mgprot，n=4～6)

3 討論

活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)在血管生物學特性中發(fā)揮著重要的作用。一般認為相對低濃度的ROS在細胞信號傳導中充當介質(zhì)或者調(diào)節(jié)子的作用，在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、基因表達方面發(fā)揮重要的作用[6]，而高濃度的ROS可導致血管功能不全及細胞畸形生長，比如血管平滑肌肥厚。隨著年齡增長，或者很多病理狀態(tài)下，比如：高血壓病、動脈粥樣硬化、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥、心力衰竭、敗血癥和阿爾茨海默病等[7]，血管中的氧自由基水平是明顯增加的。機體內(nèi)穩(wěn)定的氧自由基水平依賴于其產(chǎn)生速度和各種超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SODs)濃度。SODs可以歧化超氧化物加氧生成過氧化氫，具有多種生物學作用[8]，比如：保護細胞免受超氧化物介導的細胞毒性；保護一氧化氮(Nitric Oxide,NO)及NO介導的信號傳導。NO是重要的血管舒張物質(zhì)，其介導的信號傳導在細胞生物功能中發(fā)揮重要的作用。

ROS還可以和其他的生物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生新的物質(zhì)，比如和脂類反應(yīng)生成MDA。這個現(xiàn)象被稱為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[9]，反過來，這也是ROS的主要來源。MDA對機體細胞有多種危害[10]，可以通過降低復合體Ⅰ的活性損傷細胞線粒體，還可以改變多巴胺能代謝，甚至和細胞修復蛋白相互作用，導致基質(zhì)修復系統(tǒng)受損，誘發(fā)基因突變的發(fā)生。因此，血漿MDA濃度不僅可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，還可以反映氧化反應(yīng)的嚴重程度及機體受氧化應(yīng)激的損傷程度。

心肌梗死后心肌缺血、缺氧以及心肌缺血再灌注導致心肌組織中氧自由基堆積，誘發(fā)細胞膜上的不飽和脂肪酸氧化而形成的MDA增加，使得心肌細胞受到更嚴重的損傷。因此MDA含量可以反映脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細胞損傷的程度。SOD作為機體內(nèi)清除氧自由基的重要酶，可以清除氧自由基，對抗MDA對心血管的損傷作用，SOD活力越高，則清除氧自由基的能力越強，對心血管的保護作用的效果越顯著。故SOD和MDA可動態(tài)評價氧自由基的防治效果。

低能激光照射是一種無創(chuàng)、無顯著危害的物理治療方法，主要通過所謂的“光生物刺激”效應(yīng)而非“熱效應(yīng)”發(fā)揮作用[11]。Ad N等人研究發(fā)現(xiàn)，LLLI可以使心肌梗死面積減少達65%，顯著減少心肌組織的丟失[3]。Hana Tuby等發(fā)現(xiàn)，LLLI可以顯著上調(diào)梗死心肌組織中VEGF和iNOS的表達，從而有效的發(fā)揮心肌保護作用及促進血管再生[4]。國內(nèi)胡盛壽等研究表明LLLI在照射后急性期內(nèi)可以刺激?！奘杉毎浯碳ひ蜃拥谋磉_和下調(diào)fractalktin表達，從而減少白細胞聚集，促進自身心肌修復，更好地保護損傷的心肌組織[12]，另外還發(fā)現(xiàn)，LLLI可以有效促進骨髓間充質(zhì)干細胞的復制、分泌及向心肌組織分化[13]。然而，目前不同類型的低能激光的最佳治療能量密度沒有統(tǒng)一的標準。既往研究發(fā)現(xiàn)，低能激光治療缺血心肌最佳的功率密度范圍為5～15mW/cm2，在治療各組織疾病和臨床應(yīng)用中最佳的能量密度為1～4J/cm2[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，能量密度在1J/cm2的LLLI最有利于缺血性心臟病的治療[15]，同時，Hana Tuby等研究顯示，低能激光以能量密度為0.96J/cm2直接照射梗死心肌組織可以顯著上調(diào)梗死心肌組織中VEGF和iNOS的表達[4]，從而有效發(fā)揮心肌保護作用及促進血管再生，減少心肌梗死面積。因此，本研究采用輸出功率為6mW，照射時間為125s，功率密度為6.37mW/cm2，能量密度為0.96J/cm2。

本研究表明心肌梗死后心肌組織中SOD活性明顯降低，MDA含量增加，采用低能激光直接照射梗死后心肌組織后1h，即可以顯著增加SOD活性，減少MDA含量，明顯改善了心肌梗死后心肌組織不良的微環(huán)境，但是這種顯著性差異在72h和1周時不再具有統(tǒng)計學意義。低能激光的“光生物刺激”的確切機制尚不清楚，目前認為低能激光通過作用于線粒體呼吸鏈中的細胞色素C等光受體進而引起氧自由基的輕度、短暫升高，進一步激發(fā)Ca2+內(nèi)流，通過多種信號傳導通道，影響細胞活性，發(fā)揮生物學作用[6，8]。本研究發(fā)現(xiàn)，LLLI對SOD活性和MDA含量的影響在48h達到最大，72h時已消失，這說明在LLLI后1～48h這個時間段內(nèi)，LLLI明顯抑制了自由基的產(chǎn)生，降低了氧自由基對細胞的損害，充分發(fā)揮了心肌保護作用。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)移植骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells)可以明顯減少心肌梗死面積，促進血管生成，改善心肌梗死后病理改變，提高心肌梗死后心臟功能，但移植后梗死區(qū)極低的存活率嚴重限制了BMSCs的應(yīng)用，梗死后心肌組織炎癥反應(yīng)、缺血等“不良”移植微環(huán)境是導致移植細胞高死亡率的主要機制。本研究發(fā)現(xiàn)LLLI后1～48h時間段內(nèi)LLLI可以明顯減少梗死心肌組織中氧自由基含量，減輕氧自由基對心肌組織的損傷，具有心肌保護作用，另外，LLLI也可以促進梗死心肌組織中VEGF和iNOS的表達，進而促進干細胞的定植和復制提供了一個良好的微環(huán)境，也為增強骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療心肌梗死提供了一種簡單有效的干預方法。

LLLI發(fā)揮生物學的具體機制尚未完全清楚，已有研究顯示，LLLI可以改變梗死心肌中細胞因子的表達，抑制炎癥反應(yīng)。受損心肌中釋放的細胞因子在心肌修復的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。細胞因子蛋白陣列系統(tǒng)可以檢測LLLI后心肌中細胞因子的變化，以探查受損心肌的細胞因子變化。結(jié)果顯示LLLI可促進生成白介素-4(Interleukin-4,IL-4)和粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，抑制趨化因子-3(CINC-3)和曲動蛋白(fractalkine)的產(chǎn)生[18]。而GM-CSF可以驅(qū)動BMSCs至梗死心肌中[19]。另一研究報道冠脈內(nèi)或皮下應(yīng)用GM-CSF可以改善冠心病病人的側(cè)支血流[20]。這些均顯示LLLI可以改善干細胞的生存環(huán)境，促進GM-CSF表達進而促進側(cè)支循環(huán)生成。另外，曲動蛋白在白細胞聚集中發(fā)揮作用，進而調(diào)節(jié)組織局部的炎癥反應(yīng)[21]。降低曲動蛋白濃度可以抑制梗死心肌組織中的白細胞聚集，減輕炎癥反應(yīng)，改善移植干細胞的存活率。因此，LLLI可以通過刺激GM-CSF表達，抑制曲動蛋白對梗死心肌有良好的保護作用。這與本研究結(jié)果具有相同的同一性。這可能是LLLI發(fā)揮生物學作用的一方面，其確切的作用機制尚需新的平臺技術(shù)，比如蛋白組學、代謝組學，從分子學角度進一步研究闡明。

綜上所述，低能激光照射可以降低大鼠心肌組織中氧自由基含量，從而對梗死后心肌組織有保護作用。