張?zhí)鹛?劉 楊 唐小童 于寒冰 李玉梅 汪 蕊，2

1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽省蚌埠市 233003； 2 癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其中肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌中最為常見(jiàn)的病理類型[1]。盡管近些年隨著外科技術(shù)及新藥研發(fā)的發(fā)展，肝癌在診斷及治療方面均取得了較大的進(jìn)步，但由于肝癌存在早期臨床癥狀隱匿、惡性程度高、生長(zhǎng)速度快、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，肝癌患者整體預(yù)后情況仍不理想[2]。因此，探索肝癌發(fā)展機(jī)制及尋求潛在的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。人斯鈣素1(Stanniocalcin 1，STC1)是一種糖蛋白激素，可廣泛表達(dá)于脊椎動(dòng)物多種組織中，除調(diào)節(jié)鈣/磷代謝外，還參與血管生成、炎癥、生殖、凋亡、妊娠、腦缺血等生理病理過(guò)程[3]。近些年，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，STC1可在結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病等多種惡性腫瘤中表達(dá)，且和腫瘤患者的臨床預(yù)后相關(guān)。在肝癌組織中STC1的表達(dá)水平及其臨床意義尚未有詳盡研究，因此本研究探討STC1在肝癌組織中的表達(dá)情況及與HCC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以明確STC1在肝癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2016年1月—2018 年12月期間就診于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院并接受手術(shù)治療的肝癌患者臨床病理資料，患者均經(jīng)病理學(xué)確診為肝細(xì)胞癌，且手術(shù)前未接受包括化療、放療和介入等任何抗腫瘤治療。所有的患者均具有充分的肝癌組織樣本和完整的臨床病理及隨訪資料，隨訪截止時(shí)間為 2020年5月。符合上述要求納入本研究的患者共75例，其中男61例，女14例；年齡22～76歲，中位年齡49歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例；肝硬化38例，無(wú)肝硬化37例；有脈管癌栓26例，無(wú)脈管癌栓49例；腫瘤分化Ⅰ～Ⅱ級(jí)57例，Ⅲ級(jí)及以上18例；TNM 分期依據(jù)第8版AJCC 標(biāo)準(zhǔn)確定，Ⅰ期35例，Ⅱ期20例，Ⅲ期20例。肝癌組織行常規(guī)HE染色，選取含有腫瘤組織的區(qū)域行免疫組化染色。同時(shí)，通過(guò)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)網(wǎng)站，分析STC1在肝癌和正常肝組織中RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 試劑及免疫組化染色(IHC) 兔抗人STC1抗體(Anti-Stanniocalcin 1)購(gòu)買于美國(guó)Abcam公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒(EliVisionTMplus)以及DAB 顯色試劑盒購(gòu)買于中國(guó)福州邁新生物科技公司。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，EDTA高溫高壓修復(fù)抗原，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。STC1抗體稀釋濃度為1∶1 000，用已知陽(yáng)性切片(PTC)作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。采用 EnVision兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，所有實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 IHC結(jié)果判讀 STC1陽(yáng)性染色定義為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒染色。應(yīng)用IHC 半定量法對(duì)染色結(jié)果分析，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡下視野(×400)，計(jì)算每個(gè)視野下細(xì)胞的染色強(qiáng)度(I)和陽(yáng)性染色細(xì)胞(P)百分比，取其平均值，以H score = I×P 公式計(jì)算染色結(jié)果。STC1的I評(píng)分為：無(wú)顯色染色(0分)，淺黃色顯色染色(1分)，棕黃色顯色染色(2分)，棕褐色顯色染色(3分)。STC1的P評(píng)分為：0%(0分)，1%～25%(1分)，26%～50%(2分)，51%～75%(3分)，76%～100%(4分)。H score= 0分為陰性(-)，H score=1分為弱陽(yáng)性(1+)，H score=2分為中等陽(yáng)性(2+)，H score≥3分為強(qiáng)陽(yáng)性。H score≥2分判定為STC1陽(yáng)性染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料組間差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，若理論頻數(shù)<1采用Fisher確切概率法，生存資料單因素分析采用Long-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用COX回歸模型，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STC1表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系 75例HCC組織中STC1的陽(yáng)性表達(dá)率為60%(45/75),顯著高于癌旁組織中的36%(27/75)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。另外，STC1的表達(dá)與患者的年齡、性別、有無(wú)肝硬化及腫瘤AJCC分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，與脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)STC1蛋白在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)

表1 STC1表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 STC1的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系 在75例肝癌患者中，與STC1陽(yáng)性表達(dá)患者(n=45)比較，STC1陰性表達(dá)患者(n=30)表現(xiàn)出更長(zhǎng)的mOS，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 STC1表達(dá)與肝癌患者總生存之間的關(guān)系

2.3 肝癌患者預(yù)后的多變量COX回歸分析 COX回歸多因素分析結(jié)果顯示：AJCC分期、STC1表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者生存狀態(tài)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

表2 肝癌患者預(yù)后的COX回歸分析

3 討論

STC1是一種糖蛋白激素，最早發(fā)現(xiàn)于硬骨魚(yú)類腎臟的內(nèi)分泌腺Stannius小體中，其生理主要作用是調(diào)節(jié)血清鈣和磷的平衡。人類STC1位于染色體8p11.2～p21，作為一種分泌型蛋白發(fā)揮作用[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明 STC1與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。STC1是一種與內(nèi)源性缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factots, HIF)1α密切相關(guān)的一種糖蛋白激素，研究證實(shí) HIF-1α是缺氧條件下誘導(dǎo)STC1 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)的一個(gè)關(guān)鍵因子，STC1通過(guò)促進(jìn)缺氧區(qū)域的血管生成和提高腫瘤細(xì)胞的缺氧耐受性，來(lái)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新血管形成及腫瘤增殖[5]。在人類多種腫瘤樣本中，可觀察到STC1表達(dá)的顯著升高，且STC1表達(dá)水平的升高多與患者預(yù)后不良相關(guān)。如Fang等[6]通過(guò)檢測(cè)胃癌患者腫瘤組織及血清中STC1的表達(dá)及生存預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)STC1在胃癌中高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和 3年無(wú)進(jìn)展生存率明顯相關(guān)，且在胃癌診斷方面血清中STC 蛋白比CEA和CA199更加敏感。Bai等[7]研究發(fā)現(xiàn)，STC1通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖，可作為前列腺癌診斷新的分子標(biāo)志物。以上研究提示，STC1參與了腫瘤進(jìn)展過(guò)程，與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，有可能作為腫瘤新的標(biāo)志物。因此，STC1也被有些學(xué)者建議作為癌癥進(jìn)展的分子標(biāo)記。

本文通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)了STC1在HCC組織中的蛋白表達(dá)情況，并分析了STC1的表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系,結(jié)果顯示肝癌組織中STC1陽(yáng)性表達(dá)率為60%，STC1的表達(dá)與脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度差有關(guān)(P<0.05)。盡管Yeung等[8]研究結(jié)果也證實(shí)了STC1在HCC組織中高表達(dá)，但發(fā)現(xiàn)STC1的表達(dá)與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)。然而，Chan等[9]研究發(fā)現(xiàn)血清中STC1高表達(dá)與肝癌更大的腫瘤直徑和更差的5年無(wú)病生存相關(guān)，并且分泌型STC1通過(guò)激活JNK信號(hào)通路增強(qiáng)肝癌的轉(zhuǎn)移潛能，揭示STC1可能作為HCC的預(yù)后血清生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。同時(shí)我們觀察到STC1陽(yáng)性表達(dá)的患者相比較于陰性表達(dá)的患者mOS縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，本研究通過(guò)多變量Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)：AJCC分期、STC1表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者生存狀態(tài)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Chan等[9]研究也證明，STC1的單克隆抗體可作為一種HCC患者TACE術(shù)后的潛在治療方法，可通過(guò)對(duì)抗不良反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)TACE的治療效果?？梢?jiàn)，STC1不僅可提示HCC患者的疾病進(jìn)程和預(yù)后，還可能成為HCC治療的新靶點(diǎn)。本研究為單中心回顧性研究，未獲取治療前血清學(xué)樣本，且組織樣本缺乏癌旁組織對(duì)照，因此STC1是否可作為HCC診斷及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)還需進(jìn)行前瞻性的研究。

綜上所述，STC1在HCC中高表達(dá)，并和HCC患者不良預(yù)后相關(guān)，STC1在HCC中可能扮演著癌基因角色，有望成為HCC新的診斷及預(yù)后判斷標(biāo)記物，未來(lái)針對(duì)STC1靶點(diǎn)的治療有可能為HCC患者帶來(lái)新的治療策略。